空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在消化系統(tǒng)腫瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)展

軒晨礒 牛旭東 淳雨婕 王紹清 王顯艷

作者單位：161006 齊齊哈爾 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2病理學(xué)院

近年來，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，尤其是單細(xì)胞RNA 測(cè)序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）成為揭示腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的有效手段。然而，scRNA-seq 在單細(xì)胞水平上分析細(xì)胞RNA 表達(dá)的前提是需要把組織解離成單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，在這一過程中可能會(huì)丟失其原始的空間信息［1］。空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)結(jié)合組織學(xué)成像和RNA 測(cè)序，定量檢測(cè)基因表達(dá)水平的同時(shí)提供相應(yīng)的空間位置信息，這有助于更好地確定腫瘤異質(zhì)性的來源，揭示其致病機(jī)制、潛在的藥物靶點(diǎn)和新的生物標(biāo)志物［2］。在消化系統(tǒng)腫瘤研究中，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)顯示了一定的應(yīng)用前景。本文就空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)及其在消化系統(tǒng)腫瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 常見的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)根據(jù)檢測(cè)原理可分為四大類，包括基于原位雜交（in situ hybridization，ISH）、原位測(cè)序（in situ sequencing，ISS）、激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection，LCM）和基于原位捕獲的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)。在ISH 中，來自組織內(nèi)各個(gè)部分（或細(xì)胞）的RNA分子通過與特定標(biāo)記的已知序列的探針雜交，從而獲取靶基因的表達(dá)情況。與初始ISH相比，單分子RNA 熒光原位雜交（single-molecule fluorescence in situ hybridization，smFISH）具有更強(qiáng)、更穩(wěn)健的信號(hào)。順序熒光原位雜交技術(shù)（sequential fluorescence in situ hybridization，seqFISH）、多重抗誤差矯正熒光原位雜交技術(shù)（multiplexed erorr-robust fluorescence in situ hybridization，MERFISH）等提高了檢測(cè)的靶通量。在ISS 中，來自細(xì)胞的RNA 分子直接在其組織環(huán)境中進(jìn)行測(cè)序，雖然大多數(shù)基于ISS 的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)都具有亞細(xì)胞分辨率，但是其發(fā)展仍受靶基因數(shù)量與效率限制；基于LCM 技術(shù)是在顯微鏡下利用激光束切割出識(shí)別的特定組織區(qū)域，但并不適用于批量處理樣品?；谠徊东@技術(shù)是通過捕獲RNA 分子進(jìn)行非原位cDNA 測(cè)序，在保留較高通量的同時(shí)還具有亞微米分辨率等優(yōu)勢(shì)。在消化系統(tǒng)腫瘤中，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可用于識(shí)別其空間異質(zhì)性和基因表達(dá)譜，以揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制?？臻g轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的原理見圖1［3］。

圖1 常見的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)[3]Fig.1 Common spatial transcriptome techniques[3]

1.1 基于原位雜交的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

ISH 技術(shù)主要用于定量檢測(cè)組織切片中的核苷酸序列，而在該技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)具有更高的安全性、穩(wěn)定性和定位準(zhǔn)確性，而且可獲得基因的表達(dá)信息，目前被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和基因組學(xué)的研究以及腫瘤學(xué)的臨床診斷［4-6］。其中，smFISH 是最早嶄露頭角的FISH，它采用多個(gè)單鏈熒光標(biāo)記的短DNA 探針與該探針互補(bǔ)的靶RNA 進(jìn)行雜交，通過數(shù)字顯微鏡成像將細(xì)胞中的單個(gè)基因表達(dá)水平可視化［7］。該技術(shù)雖然具有高靈敏度和高分辨率的優(yōu)勢(shì)，但受熒光團(tuán)種類限制，檢測(cè)通量和效率較低［8］。為提高smFISH 的檢測(cè)通量，LUBECK 等［9］開發(fā)了順序熒光原位雜交技術(shù)，通過將一系列探針與每個(gè)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行多輪雜交來實(shí)現(xiàn)大通量分析，增加了FISH 信號(hào)強(qiáng)度。然而，隨著雜交次數(shù)的增加，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本數(shù)量增長(zhǎng)，耗時(shí)增加，誤差也逐漸增大。由ENG等［10］開發(fā)的seqFISH 技術(shù)利用順序雜交和標(biāo)準(zhǔn)共聚焦顯微鏡成像，縮短了成像時(shí)間并進(jìn)行多重分析糾錯(cuò)，提高了檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性?？紤]到seqFISH 耗時(shí)過長(zhǎng)和誤差較大，CHEN 等［11］提出了一種高度多路復(fù)用的smFISH 成像方法--MERFISH，該技術(shù)通過使用組合標(biāo)記、順序雜交和成像以及兩種不同的錯(cuò)誤魯棒編碼方案，可以在單個(gè)細(xì)胞中鑒定數(shù)千種RNA 的拷貝數(shù)及進(jìn)行空間定位。MERFISH 不僅可通過錯(cuò)誤魯棒編碼方案降低檢測(cè)誤差，控制檢測(cè)成本，而且還可以使用組合標(biāo)記方法縮短多輪雜交的總時(shí)間?？傊贗SH 的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)具備高分辨率、大通量檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，但仍存在耗時(shí)長(zhǎng)、誤差大、成本昂貴等局限性。

1.2 基于顯微切割的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

LCM 是一種在顯微鏡下通過顯微操作系統(tǒng)對(duì)所選取的樣本進(jìn)行切割分離并收集應(yīng)用的技術(shù)，其工作原理是將激光與倒置的顯微鏡結(jié)合，并通過計(jì)算機(jī)連接，實(shí)現(xiàn)直接可視化分析［12-13］。LCM最重要的優(yōu)點(diǎn)在于高速、高精度及多功能性。然而，由于LCM 存在分析通量較低等局限性，其應(yīng)用范圍受到一定限制［14］。WU 等［15］提出了一種將LCM 與scRNA-seq 相結(jié)合并使用地理位置測(cè)序（Geo-seq）方法來高通量基因表達(dá)以分析精子發(fā)生過程中的特定生殖細(xì)胞。MOOR等［16］通過優(yōu)化LCM-RNA-seq方法提取小腸絨毛上皮特異性標(biāo)志基因，并利用其進(jìn)行單細(xì)胞空間重建以獲取腸細(xì)胞空間位置信息。此外，EZZOUKHRY等［17］將LCM 與質(zhì)譜分析（MS）結(jié)合使用，能夠在少量樣本條件下分析原始亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)從而實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析。以上研究說明，與單LCM 技術(shù)應(yīng)用相比，多技術(shù)聯(lián)用可提高捕獲單個(gè)細(xì)胞的精確度、減少非目標(biāo)組織沾染等局限性，可作為尋找腫瘤早期診斷、預(yù)后及藥物治療靶標(biāo)的潛在工具［18］。

1.3 基于原位測(cè)序的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

鎖式探針和滾動(dòng)環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）的ISS 方法已被應(yīng)用于不同來源組織切片中基因轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)。該技術(shù)首先使用掛鎖探針以多重方式識(shí)別組織中的mRNA分子，并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；接著利用特定的掛鎖探針與cDNA 雜交，在此基礎(chǔ)上通過RCA 步驟生成滾環(huán)產(chǎn)物（rolling circle product，RCP），再通過連接錨定和檢測(cè)探針進(jìn)行測(cè)序，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)特定mRNA 分子的檢測(cè)分析［19］。TANG 等［20］在ISS 技術(shù)基礎(chǔ)上開發(fā)了改進(jìn)版原位測(cè)序（improved in situ sequencing，IISS），該方法采用一種新型探測(cè)和條形碼方法結(jié)合先進(jìn)圖像分析進(jìn)行高分辨率空間基因表達(dá)譜研究。IISS 編碼策略雖然可提高信號(hào)強(qiáng)度和原位測(cè)序特異性并保持靶向空間轉(zhuǎn)錄組簡(jiǎn)化分析管道，但是仍可能受熒光團(tuán)數(shù)量及顯微鏡光學(xué)衍射極限等限制。LEE等［21］進(jìn)一步提出了熒光原位測(cè)序（fluorescent in situ sequencing，F(xiàn)ISSEQ）技術(shù)，該方法在固定細(xì)胞時(shí)利用脫氧尿嘧啶（dUTP）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并經(jīng)過RCA 和測(cè)序處理來實(shí)現(xiàn)對(duì)多種RNA 定位模式非破壞性比較。與LCM 和FISH 相比，F(xiàn)ISSEQ 可以不受所需探針數(shù)量限制且具有更好的靈活性，但存在測(cè)序深度低，會(huì)丟失一些豐度的轉(zhuǎn)錄本，不能提供單個(gè)細(xì)胞RNA完整信息等局限性［22］。GYLLBORG等［23］優(yōu)化了鎖式探針并開發(fā)了基于雜交的技術(shù)（hybridizationbased in situ sequencing，HybISS），相較于鎖式探針，HybISS 方法采用一種新的組合條形碼方法，不僅能更穩(wěn)定地對(duì)樣本進(jìn)行分子檢測(cè)，而且其原位空間解析基因表達(dá)的能力也得到了提升，能支持容納更多的基因數(shù)量。LEE等［24］開發(fā)了直接RNA 靶向原位測(cè)序（dRNA-hybridization-based in situ sequencing，dRNA-HybISS）技術(shù)，該技術(shù)可直接檢測(cè)RNA 獲取基因序列，從而避免了基于cDNA 的原位測(cè)序所需的逆轉(zhuǎn)錄過程，極大提高其檢測(cè)效率。近年來，利用dRNA-HybISS 的實(shí)驗(yàn)研究仍較少，可能與各實(shí)驗(yàn)室缺乏“即插即用”的儀器和軟件解決方案相關(guān)，但其高效優(yōu)勢(shì)可能使其成為未來具有巨大潛力的細(xì)胞分類技術(shù)。

1.4 基于原位捕獲的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

原位捕獲技術(shù)是在原位捕獲轉(zhuǎn)錄本的基礎(chǔ)上進(jìn)行異位測(cè)序，并允許對(duì)完整的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行無偏分析的一項(xiàng)技術(shù)。2016 年，ST?HL 等［25］開發(fā)了能夠利用引物微陣列對(duì)原位RNA 進(jìn)行分析的基于原位捕獲的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，通過將組織學(xué)切片定位到具有獨(dú)特位置的引物微陣列芯片的條形碼上，再利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)組織中的RNA 進(jìn)行測(cè)序，可提供具有完整二維位置信息的高質(zhì)量全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。盡管該法提供了空間分辨率的全轉(zhuǎn)錄組信息，其中每個(gè)捕獲區(qū)域直徑為100μm，含有1 007 個(gè)捕獲點(diǎn)，但只能檢測(cè)到10～40 個(gè)細(xì)胞，分辨率仍然較低。10×Genomics 公司收購該技術(shù)并進(jìn)一步改進(jìn)為10×Visium 技術(shù)，該技術(shù)的流程主要包括樣本制備、文庫構(gòu)建和測(cè)序三大部分［3］。與ST?HL 等［25］開發(fā)的原位捕獲空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)相比，10×Visium技術(shù)的每個(gè)捕獲區(qū)域直徑雖減小為55μm，但卻含有5 000 個(gè)捕獲點(diǎn)，這意味可以檢測(cè)到更多的細(xì)胞，大大提高了空間分辨率和檢測(cè)靈敏度［26］。Slide-seq 是繼ST?HL 等后發(fā)布的第二個(gè)基于原位捕獲和測(cè)序的高通量空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)［27］。在該技術(shù)中，RODRIQUES 等［27］將組織切片貼附于直徑為10μm 的磁珠表面，并通過芯片上的磁珠捕獲組織切片中的mRNA，然后再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行建庫和測(cè)序以推斷出RNA 的空間位置信息，從而獲得組織的空間基因表達(dá)圖譜，其靈敏度和分辨率較10×Visium技術(shù)得到很大提高。2019 年，VICKOVIC 等［28］開發(fā)了高清空間轉(zhuǎn)錄組（high definition spatial transcriptomics，HDST），它可以從直徑僅為2 μm 磁珠陣列上的組織切片中捕獲RNA，與Slide-seq技術(shù)相比，HDST具有更高的分辨率和靈敏度，可用于空間分辨基因表達(dá)分析。然而HDST和Slide-seq技術(shù)的分辨率仍比具有亞微米分辨率的光學(xué)顯微鏡低，且需要scRNA-seq 數(shù)據(jù)協(xié)助空間定位細(xì)胞類型［26］?？臻g條形碼技術(shù)（spatial barcoding sequencing，Seq-Scope）是基于Illumina 測(cè)序平臺(tái)的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)。該技術(shù)流程主要分為兩輪測(cè)序，首先對(duì)帶有不同條形碼的引物片段固相擴(kuò)增形成簇后，進(jìn)行第一次測(cè)序和成像以獲得引物簇的序列和空間位置信息，然后利用引物簇捕獲組織中的mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行第二次測(cè)序得到不同條形碼對(duì)應(yīng)的cDNA 序列信息，最后與第一次得到的位置信息結(jié)合從而獲得組織不同部位細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息。該技術(shù)捕獲的RNA條形碼間的距離為0.5～0.8μm，可實(shí)現(xiàn)亞微米分辨率。Seq-Scope 具有快速、直接、精確且易于實(shí)施等優(yōu)點(diǎn)，但其研究只關(guān)注于含有poly-A 的轉(zhuǎn)錄組，尚處于需進(jìn)一步研發(fā)和完善階段［29］。

2 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在消化系統(tǒng)腫瘤研究中的應(yīng)用

2.1 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在肝癌研究中的應(yīng)用

空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在識(shí)別肝癌及其微環(huán)境的異質(zhì)性方面發(fā)揮了重要作用，對(duì)其診斷、治療、預(yù)后及分子生物標(biāo)志物分析具有深遠(yuǎn)意義［30］。WU等［31］采用10×Genomics Visium 技術(shù)比較了肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者非腫瘤區(qū)域、邊界區(qū)域及腫瘤區(qū)域的空間腫瘤微環(huán)境特征，發(fā)現(xiàn)具有纖維包膜的腫瘤細(xì)胞在正常組織側(cè)的免疫細(xì)胞富集程度高于腫瘤組織側(cè)，而無包膜的腫瘤細(xì)胞邊界兩側(cè)組織內(nèi)的免疫細(xì)胞分布更趨于復(fù)雜多變，這揭示了腫瘤纖維包膜與免疫微環(huán)境的異質(zhì)性關(guān)系。同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)了CD47+和PROM1+的腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSC）在HCC 中高度富集并與腫瘤的侵襲和遷移能力增強(qiáng)相關(guān)；三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structures，TLS）參與抗腫瘤免疫反應(yīng)和潛在的免疫治療反應(yīng)，與腫瘤預(yù)后相關(guān)［32］。該團(tuán)隊(duì)將HCC-5的cluster-6中表達(dá)最高的前50 個(gè)基因當(dāng)做一個(gè)新鑒別TLS 的基因集（命名為TLS-50），證實(shí)了TLS-50鑒定的TLS 結(jié)構(gòu)在形態(tài)學(xué)與細(xì)胞構(gòu)成上均與TLS 相符合。為探索TLS-50在HCC 中的臨床意義，該團(tuán)隊(duì)還對(duì)TLS-50 評(píng)分與臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)TLS-50 的高評(píng)分與腫瘤直徑和巴塞羅那臨床肝癌分期相關(guān)，這意味著TLS-50 有望成為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的新指標(biāo)。該研究詳細(xì)描述了HCC的空間異質(zhì)性，為臨床肝臟CSC靶向治療提供新的研究方向，以及為在臨床中評(píng)估患者預(yù)后提供了新的指標(biāo)。

HCC 預(yù)后與其病理分型密切相關(guān)，其中粗梁-團(tuán)塊型HCC 預(yù)后極差［33］。FENG 等［34］通過單細(xì)胞測(cè)序結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組等技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)粗梁-團(tuán)塊型HCC與B 細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫球蛋白合成的體液免疫失調(diào)有關(guān)。該研究結(jié)果為基于病理分型的肝癌精準(zhǔn)診療模式的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，并為HCC 的臨床診治提供了新思路，具有重要而深遠(yuǎn)的臨床意義。SAVIANO等［35］通過scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組對(duì)小鼠的肝臟分區(qū)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路是參與人肝纖維化生態(tài)位中細(xì)胞相互作用的中心途徑，進(jìn)一步闡明了腫瘤上皮細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）之間的相互作用。癌癥免疫治療的主要難題之一就是腫瘤免疫微環(huán)境的空間異質(zhì)性。XUE等［36］應(yīng)用10×單細(xì)胞，空間轉(zhuǎn)錄組以及超多色免疫熒光等技術(shù)揭示了肝癌免疫微環(huán)境亞型和中性粒細(xì)胞的異質(zhì)性。該研究利用單細(xì)胞測(cè)序闡明了5 種免疫微環(huán)境亞型的空間分布，結(jié)果提示2 個(gè)中性粒細(xì)胞亞群CCL4+TAN 通過招募腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和PD-L1+TAN 抑制CD8+T 的免疫功能從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，該研究結(jié)果有望為肝癌的免疫治療提供新的策略?？臻g轉(zhuǎn)錄組技術(shù)深度挖掘了肝腫瘤細(xì)胞及其纖維包膜、上皮細(xì)胞與不同免疫細(xì)胞亞群之間的關(guān)系，進(jìn)一步揭示了肝癌及其微環(huán)境的異質(zhì)性，為肝癌的病理分型、靶向治療及預(yù)后評(píng)估提供新的研究方向。

2.2 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在胃癌研究中的應(yīng)用

胃癌是我國腫瘤相關(guān)死亡的第三大常見原因［37］，術(shù)后高復(fù)發(fā)率是導(dǎo)致其高死亡率的重要原因［38］。胃癌微環(huán)境異質(zhì)性對(duì)晚期患者的預(yù)后和治療起著關(guān)鍵作用［39］?？臻g轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可保留胃癌細(xì)胞空間信息，進(jìn)一步揭示腫瘤內(nèi)部的微環(huán)境異質(zhì)性，可為其個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療和預(yù)后分析提供新的見解。KUMAR等［40］運(yùn)用scRNA-Seq與DSP技術(shù)，初步揭示在彌漫型胃癌中，Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子（KLF2）表達(dá)水平上升，且KLF2 的表達(dá)和調(diào)節(jié)與漿細(xì)胞群的塑造密切相關(guān)，這為胃癌細(xì)胞亞群的鑒定提供了新的數(shù)據(jù)。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤成纖維細(xì)胞（CAFs）中INHBA 表達(dá)上調(diào)，且CAFs的標(biāo)志物FAP表達(dá)增加；隨著胃癌臨床分期的升高，表達(dá)INHBA 和FAP 的CAFs 亞群數(shù)量也逐步增加，提示在不同CAFs 中INHBA-FAP 的高表達(dá)可能是預(yù)測(cè)胃癌預(yù)后不良的因子。在過去，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的研究主要集中在腫瘤本身，近年來在藥物開發(fā)領(lǐng)域，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的應(yīng)用更直觀地揭示了新型藥物對(duì)胃癌的作用靶點(diǎn)機(jī)制。AKIYAMA等［41］利用Visium空間基因表達(dá)平臺(tái)發(fā)現(xiàn)PDGFRα/β 雙重阻斷可通過靶向逆轉(zhuǎn)免疫抑制微環(huán)境，提高免疫檢查點(diǎn)抑制劑在纖維化胃癌中的療效?？臻g轉(zhuǎn)錄組技術(shù)雖在藥物開發(fā)領(lǐng)域報(bào)道較少，但具有可識(shí)別腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞基因表達(dá)特征的優(yōu)勢(shì)，能為開發(fā)更有效的新型免疫治療藥物提供指導(dǎo)［2］。

空間轉(zhuǎn)錄技術(shù)可保留空間信息，而多技術(shù)聯(lián)合可多維度深入探討腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境的異質(zhì)性［42］。DU等［43］應(yīng)用空間轉(zhuǎn)錄組和scRNA-seq技術(shù)揭示了非萎縮性胃炎（non-atrophic gastritis，NAG）、萎縮性胃炎（atrophic gastritis，AG）到早期胃癌（early gastric cancer，EGC）的免疫微環(huán)境特征。該研究發(fā)現(xiàn)，NAG 中的淋巴細(xì)胞聚集面積最大，而AG 和EGC 中的淋巴細(xì)胞聚集面積減小，這表明NAG 的免疫防御功能最強(qiáng)。在此過程中，不同胃狀態(tài)階段的淋巴T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的組成和比例也呈現(xiàn)出不同特點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，在AG和EGC 階段發(fā)現(xiàn)了NAG 階段中未出現(xiàn)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞和耗竭性T 細(xì)胞，說明早期腫瘤進(jìn)展伴隨著免疫反應(yīng)的發(fā)生；而對(duì)于B 細(xì)胞，其數(shù)量和多樣性較少主要與SOX5 的轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)［44］。該研究通過多組學(xué)技術(shù)深入探究了不同胃狀態(tài)免疫微環(huán)境特征，有助于臨床醫(yī)師更好地認(rèn)識(shí)并干預(yù)ECG的進(jìn)展，對(duì)制定個(gè)性化治療方案具有重要意義。

研究表明，胃癌可在營養(yǎng)匱乏的環(huán)境中仍能滿足其生長(zhǎng)和增殖的需求，且其可通過調(diào)控新陳代謝相關(guān)通路實(shí)現(xiàn)免疫逃逸［45］。CHAPMAN 等［46］利用scRNAseq技術(shù)發(fā)現(xiàn)了胃癌TME中基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄重編程產(chǎn)物腫瘤特異性細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），而ECM 促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。該研究雖然有助于深入了解胃癌相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控重編程，但是無法提供胃癌微環(huán)境中特定細(xì)胞代謝物和脂質(zhì)的空間分布及變化?；诖?，SUN 等［47］利用空間分辨代謝組學(xué)和空間分辨脂質(zhì)組學(xué)以及10×Genomics 的空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)ξ赴┙M織冷凍切片進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精氨酸和脯氨酸在胃癌組織中均表現(xiàn)出高度異質(zhì)性的空間分布，通過下調(diào)精氨酸和脯氨酸合成的ASS1、ALDH18A1 和PYCR 可抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，這為抗癌藥物的開發(fā)提供了新的見解。脂質(zhì)代謝的重編程被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞增殖的標(biāo)志［48］。膽固醇是脂質(zhì)的重要代謝產(chǎn)物。有研究發(fā)現(xiàn)膽固醇合成酶基因HMGCS1和HMGCR以及調(diào)控膽固醇合成途徑的SREBF2基因在腫瘤和淋巴組織中均升高并促進(jìn)膽固醇的合成，而膽固醇在腫瘤微環(huán)境中富集可抑制T 細(xì)胞分化，誘導(dǎo)T細(xì)胞功能衰竭［49］。膽固醇合成在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)可能是免疫細(xì)胞不能有效抑制胃癌生長(zhǎng)的原因之一。該研究通過代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)以及空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)全面而系統(tǒng)地描繪了胃癌細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物和脂質(zhì)成分在腫瘤微環(huán)境中的空間分布情況，為深入理解腫瘤形成機(jī)制提供了新視角，也為未來開展相關(guān)臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

2.3 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在結(jié)直腸癌研究中的應(yīng)用

腫瘤微環(huán)境中腸道菌群、炎癥及缺氧與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［50］?？臻g轉(zhuǎn)錄組技術(shù)通過檢測(cè)不同基因標(biāo)志物的表達(dá)以及不同結(jié)直腸癌結(jié)構(gòu)的免疫微環(huán)境，進(jìn)一步闡釋其惡變機(jī)制，能為結(jié)直腸癌靶向藥物開發(fā)與臨床用藥提供新見解。OZATO 等［51］整合單細(xì)胞與空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，對(duì)結(jié)直腸癌組織的TMEs中各免疫細(xì)胞功能進(jìn)行探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)移性的結(jié)直腸癌細(xì)胞可通過分泌人白細(xì)胞抗原G（HLA-G）將巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為分泌型磷蛋白SPP1+巨噬細(xì)胞，而SPP1+巨噬細(xì)胞則通過細(xì)胞因子如IL-10 抑制CD8+T細(xì)胞的免疫活性，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤免疫作用，提示腫瘤免疫微環(huán)境參與調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌生長(zhǎng)并影響其進(jìn)展。同時(shí)，該研究還發(fā)現(xiàn)HLA-G基因敲除可促進(jìn)體內(nèi)腫瘤免疫，SPP1+巨噬細(xì)胞和分泌高水平HLA-G 的癌細(xì)胞可能是治療結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)。另一項(xiàng)研究結(jié)合空間DSP 與成像質(zhì)譜流式（IMC）進(jìn)一步揭示CD47-SIRPα 軸可能是結(jié)直腸癌的一個(gè)潛在免疫治療靶點(diǎn)［52］。QI 等［53］利用Visiun 技術(shù)發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性FAP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞共表達(dá)，其相互作用可能有助于細(xì)胞外基質(zhì)重塑并促成纖維增生微環(huán)境，提示對(duì)共表達(dá)免疫因子進(jìn)行評(píng)估具有積極意義。

結(jié)直腸癌患者長(zhǎng)期生存的主要障礙仍然是肝轉(zhuǎn)移，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可通過鑒定結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移周邊的TME，進(jìn)而對(duì)腫瘤分期、預(yù)后及抗癌策略進(jìn)行評(píng)價(jià)。WU 等［54］對(duì)24 個(gè)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移樣本進(jìn)行Visium 和scRNA-seq 測(cè)序，在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的空間圖譜基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移部位存在高代謝活化的MRC1、CCL18、M2 樣巨噬細(xì)胞，提示這些可能是潛在的靶向治療分子。此外，F(xiàn)AP+成纖維細(xì)胞和SPP1+巨噬細(xì)胞的高浸潤(rùn)也提示與預(yù)后有關(guān)［53］。 WOOD 等［55］發(fā)現(xiàn)，相較于預(yù)后不良患者，在長(zhǎng)期幸存的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤患者中，侵襲組織邊緣主要富集Ⅱ型IFN 信號(hào)傳導(dǎo)和MHC-Ⅱ類抗原呈遞的免疫細(xì)胞群，提示轉(zhuǎn)移瘤的高免疫浸潤(rùn)可能與改善癌癥特異性生存率有關(guān)。WANG 等［56］利用scRNA-seq 和Visium 測(cè)序技術(shù)也發(fā)現(xiàn)CXCL13 T細(xì)胞高浸潤(rùn)的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后良好，與上述研究結(jié)果一致。在結(jié)直腸癌治療領(lǐng)域，WU 等［54］通過觀察NAC 治療后的ECM 重塑，發(fā)現(xiàn)病變進(jìn)展/病變穩(wěn)定（PD/SD）腫瘤和部分緩解（PR）腫瘤NAC后免疫細(xì)胞變化不同。另一項(xiàng)研究［57］借助ST相關(guān)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，TAM中M0和M1表型參與結(jié)直腸癌炎癥反應(yīng)，TAM重分化為M1 表型可作為一種有效的抗癌策略，該研究同時(shí)提出Wnt信號(hào)通路可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的促炎或抗炎表型改變。這提示靶向某些TAM 亞群與重編程相結(jié)合可能有益于結(jié)直腸癌治療，為其臨床治療策略提供新思路。

2.4 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在其他消化系統(tǒng)腫瘤研究中的應(yīng)用

食管癌是源自食管上皮的惡性腫瘤，主要分為食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌兩個(gè)亞型。食管鱗狀上皮細(xì)胞癌前病變是食管鱗狀細(xì)胞癌的前體，但由于缺乏相關(guān)分子標(biāo)志物，其是否發(fā)展為食管鱗狀細(xì)胞癌尚不清楚?？臻g轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的應(yīng)用有效揭示了食管鱗狀上皮細(xì)胞癌前病變的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子，為食管鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷與治療提供便利。LIU 等［58］對(duì)19個(gè)患者樣本進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)隨著食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展，TAGLN2基因表達(dá)水平顯著增加，而CRNN（Cornulin）通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖抑制TAGLN2基因表達(dá)，在食管鱗狀上皮細(xì)胞癌前病變中，TAGLN2和CRNN 可作為評(píng)估食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)候選指標(biāo)。

胰腺癌被稱為“癌中之王”，其中胰腺導(dǎo)管癌是最常見的惡變類型。目前，胰腺癌的診治仍是巨大挑戰(zhàn)，雖然免疫療法在多實(shí)體瘤中取得顯著成就，但對(duì)胰腺癌患者尚未取得明顯效果［59］。近年來，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)不同條件下的胰腺導(dǎo)管癌中的TME 進(jìn)行了深入探索，為其診療提供了新思路，例如MONCADA等［60］結(jié)合微陣列的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)和scRNA-seq 技術(shù)，對(duì)胰腺不同組織區(qū)域的細(xì)胞亞群進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管癌患者存在4 個(gè)導(dǎo)管細(xì)胞亞群，其中MHC Ⅱ類基因的抗原提呈細(xì)胞通過促進(jìn)T 細(xì)胞活化進(jìn)而對(duì)TME 中的炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)以緩解胰腺導(dǎo)管癌的應(yīng)激反應(yīng)，這可能是延緩胰腺導(dǎo)管癌病程發(fā)展的有效策略之一。缺氧是胰腺導(dǎo)管癌等實(shí)體腫瘤的重要特征，它與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性有關(guān)［61］。SUN等［62］利用10×Visium 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)首次闡述了缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)胰腺導(dǎo)管癌空間轉(zhuǎn)錄組變化，結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，缺氧組的腫瘤細(xì)胞亞組相應(yīng)減少且在第6亞組的細(xì)胞表現(xiàn)出高增殖力與高侵襲力的特點(diǎn)，此外，缺氧基因LDHA表達(dá)增加可激活P13K信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)胰腺導(dǎo)管癌在缺氧條件下的分化、增殖、代謝和應(yīng)激以促進(jìn)其侵襲和轉(zhuǎn)移，這提示P13K抑制劑為治療胰腺癌提供了新的候選藥物，但尚未有驗(yàn)證研究報(bào)道。

3 小結(jié)

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)是用于研究腫瘤及其微環(huán)境異質(zhì)性的前沿技術(shù)，在消化系統(tǒng)腫瘤中，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的應(yīng)用不僅可獲取基因表達(dá)的空間特征，揭示腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性起源和發(fā)生發(fā)展中的致病機(jī)制、潛在藥物靶點(diǎn)及新的生物標(biāo)志物，還可以探索腫瘤微環(huán)境中不同類型的腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞、間質(zhì)成分等相互作用關(guān)系，并準(zhǔn)確定位及鑒別具有特定功能和表型特征的亞群體細(xì)胞，可能是探索腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性核心藥物靶點(diǎn)的潛在工具。但是，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)也存在一些局限性，如空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在空間分辨率上無法達(dá)到單細(xì)胞水平；獲得的樣本數(shù)據(jù)集可能不夠全面，可能是因?yàn)椴煌较蚝蛯用鎭碓吹那衅嬖诓町?，測(cè)序過程中所選切片中空間轉(zhuǎn)錄組圖譜能否全面覆蓋多種器官及其變化仍有待明確；經(jīng)濟(jì)成本和操作復(fù)雜性等也限制了空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的廣泛應(yīng)用。目前，多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用成為應(yīng)對(duì)空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)局限性的策略，包括空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)與代謝組學(xué)相結(jié)合，以更全面了解腫瘤異常代謝與特定基因表達(dá)程序的關(guān)聯(lián)性；空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)，能了解腫瘤細(xì)胞中基因表達(dá)程序變化，觀察基因編碼蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)部及周圍環(huán)境中分布情況，在涉及腫瘤信號(hào)通路、代謝途徑以及其他重要生物過程等方面也具有顯著優(yōu)勢(shì)。總體而言，目前空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)主要應(yīng)用于基礎(chǔ)研究，在臨床實(shí)踐中尚未推廣，但隨著空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)不斷完善與優(yōu)化，相信其將在腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域方面提供更多的防治手段，發(fā)揮更大作用。