芍藥苷抑制子宮內(nèi)膜癌遷移侵襲及其作用機制

肖慧 覃鴻恩 姚姿羽 周輝 馬榮河

作者單位：445000 恩施1恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院藥劑科；2湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院藥劑科

子宮內(nèi)膜癌好發(fā)于絕經(jīng)后的中老年婦女，易發(fā)生陰道不規(guī)則出血，臨床主張手術(shù)切除子宮、卵巢或輸卵管，并以化療進行輔助［1］。但對于中晚期子宮內(nèi)膜癌患者，化療易耐藥，治療效果并不理想，晚期患者5年總生存率約為30%［2-3］。因此，尋找更安全有效的藥物和生物標志物對子宮內(nèi)膜癌治療具有重要的臨床意義。芍藥苷（Paeoniflorin）是一類具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解痙、抗炎等多種活性作用的天然化合物［4］，同時也具有良好的抗腫瘤作用，在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)其能抑制惡性腫瘤增殖和遷移［5-6］。然而，目前關(guān)于芍藥苷在子宮內(nèi)膜癌中的藥理活性及其作用并未明確。本研究通過生物信息學(xué)分析以及體內(nèi)和體外實驗觀察芍藥苷干預(yù)子宮內(nèi)膜癌細胞對細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人子宮內(nèi)膜癌細胞株HEC108 和Ishikawa 分別購于上海傳秋生物科技有限公司，武漢普諾賽生命科技有限公司；芍藥苷標準品（純度：98%）購于上海純優(yōu)生物科技有限公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基購于上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（生產(chǎn)批號：PD-BCA-500）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（生產(chǎn)批號：P0012A）購自北京伊塔生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（生產(chǎn)批號：C57-C0017-500）購于上海吉至生化科技有限公司；AURKA 和空載質(zhì)粒購于上?？吕咨锟萍加邢薰?；基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、鋅指蛋白（Snail）、極光激酶A（aurora kinase A，AURKA）和Ki-67 多克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）二抗購自上?？泼羯锟萍加邢薰?；ST-360型酶標儀購自上海晚成醫(yī)療器械有限公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用TargetNet 和Swiss target prediction 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測芍藥苷靶基因后進行交叉分析，即得該藥物的可能作用靶點。利用UALCAN數(shù)據(jù)庫［7］（https：//ualcan.path.uab.edu/）分析芍藥苷的靶點在子宮內(nèi)膜癌中的表達水平，并通過TCGA（版本：unc.edu_UCEC_IlluminaHiSeq_RNASeqV2.geneExp）在線數(shù)據(jù)庫下載子宮內(nèi)膜癌的臨床樣本數(shù)據(jù)，比較靶基因在不同臨床病理特征間的表達情況。

1.3 細胞培養(yǎng)及分組

將HEC108和Ishikawa 細胞接種至含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，細胞為貼壁生長，胰酶消化液消化后傳代培養(yǎng)，取用對數(shù)生長期細胞進行實驗。

根據(jù)LipofectamineTM2000說明書將AURKA和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞（HEC108 和Ishikawa）中，實驗分組：對照組（Control 組/Vector 組，細胞不處理，即正常培養(yǎng)細胞）；AURKA 組（轉(zhuǎn)染AURKA 質(zhì)粒），芍藥苷組（0.5 mg/mL 芍藥苷處理細胞），芍藥苷+ AURKA 組（0.5 mg/mL 芍藥苷處理細胞并轉(zhuǎn)染AURKA 質(zhì)粒），轉(zhuǎn)染48 h 后收集各組細胞，采用Western blot檢測AURKA蛋白水平，以評估轉(zhuǎn)染效率。

1.4 CCK-8實驗檢測細胞活性

HEC108 和Ishikawa 細胞消化離心重懸，以密度為5×103個/孔接種于96 孔板。將細胞置于培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)24 h，以不同濃度芍藥苷（0、0.5、1.0、2.0 mg/mL）作用于細胞，分別于0、24、48、72、96 h 對細胞增殖活性進行檢測。每孔加入10μL CCK-8 溶液于37 ℃環(huán)境中繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm 的吸光度，以各組吸光度的平均值反映細胞增殖活性。

1.5 CCK-8實驗檢測細胞增殖能力

將HEC108和Ishikawa細胞以密度為5×103個/孔接種于96 孔板。分別于0、24、48、72、96、120、144 h對細胞增殖能力進行檢測。每孔加入10μL CCK-8溶液于37 ℃環(huán)境中繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm處的吸光度值，根據(jù)吸光度值繪制細胞生長曲線。

1.6 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力

遷移實驗：在24孔板中，將密度為5×104個/mL 的細胞懸液接種于不含Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室上層，下層添加含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，去除Transwell 小室并吸棄24 孔板中的培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色15 min，用PBS 洗3 次，用無菌棉簽移除未遷移細胞，在倒置顯微鏡下觀察，拍照統(tǒng)計細胞數(shù)量。侵襲實驗：將細胞懸液接種于內(nèi)鋪Matrigel 基質(zhì)膠的Transwell小室上層，下層添加含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，其余步驟同遷移實驗。

1.7 LDH活性檢測

將HEC108 和Ishikawa 細胞接種于6 孔板（細胞濃度為2×105個/mL），加入0.5 mg/mL 濃度的芍藥苷2 mL，消化離心，加入裂解液后再離心取上清液。按照LDH試劑盒說明書中的操作步驟分別進行加樣后，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長為440 nm時測定光密度（OD）值，計算出LDH活性。

1.8 裸鼠移植瘤實驗檢測瘤體生長

8 周齡健康雌性C57BL/6 裸鼠16 只，體質(zhì)量（22±2）g，購自湖北省實驗動物研究中心，許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。所有小鼠均在標準環(huán)境中飼養(yǎng)，并自由采食飲水。將Control組、芍藥苷組對數(shù)生長期的子宮內(nèi)膜癌細胞HEC108 重懸，接種于裸鼠腋下脂肪墊，每組8只。每隔1 d 經(jīng)皮下注射1 次藥物質(zhì)量濃度為50 mg/mL 的芍藥苷溶液，每天1 次，共2 周。待成瘤后，每2 d 測量一次瘤體體積。成瘤第14 天后處死所有裸鼠，取出瘤體測量瘤體體積及重量。所有實驗動物均遵循3R 原則，經(jīng)湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院動物實驗倫理審查通過（審批號：KEH20220805）。

1.9 免疫組化染色檢測腫瘤組織中Ki-67的表達水平

處死裸鼠后取出腫瘤組織，常規(guī)包埋切片，用PBS 沖洗3 次，每次5 min；微波修復(fù)15 min，切片用過氧化酶抑制劑室溫處理10 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min；滴加CBL 抗體（1∶100），4 ℃孵育過夜；PBS 沖洗3次，每次3 min；滴加HRP-羊抗小鼠IgG，室溫孵育10 min；PBS充分淋洗后，滴加H2O2-DAB顯色液顯色；復(fù)染，脫水透明，封片。陰性對照用PBS 代替一抗。在顯微鏡下觀察，拍照。

1.10 Western blot檢測蛋白表達

收集各組對數(shù)生長期的HEC108 和Ishikawa 細胞，Control 組和芍藥苷組加入SDS 上樣緩沖液，沸水浴中煮沸10 min，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入用封閉液稀釋的抗體（1∶5 000），4 ℃孵育過夜。次日PBST洗滌6 min，重復(fù)3 次，然后加入封閉液稀釋的HRP標記的羊抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育60 min，PBST 洗滌6 min，重復(fù)3 次，ECL 化學(xué)發(fā)光液進行顯影，以β-actin 作為內(nèi)參，利用BCA 蛋白檢測試劑檢測蛋白濃度。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，采用單因素方差分析各組細胞增殖、遷移和侵襲的差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用Kaplan-Meier法分析患者總生存期（從確診為惡性腫瘤至因任何原因引起死亡的時間）和無病生存期（從治療開始至腫瘤復(fù)發(fā)或因任何原因死亡的時間），生存率差異比較采用log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷靶基因及其與子宮內(nèi)膜癌臨床不良表型之間關(guān)系

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得到芍藥苷的41 個作用靶點。UALCAN 在線分析顯示有29 個基因表達上調(diào)。TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，在這29個基因中，有2個基因的表達水平與子宮內(nèi)膜癌的總生存期相關(guān)，且只有AURKA與腫瘤分期相關(guān)（圖1A），因此選擇AURKA進行后續(xù)研究。

圖1 芍藥苷的靶基因AURKA及其與子宮內(nèi)膜癌臨床特征的關(guān)系Fig.1 Paeoniflorin target gene AURKA and its relationship with clinical features of endometrial carcinoma

TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，AURKA 在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達明顯高于癌旁組織（圖1B，P=0.002），亞組分析顯示臨床分期Ⅰ期以及Ⅱ-Ⅳ期的子宮內(nèi)膜癌組織中AURKA 表達均高于癌旁組織（圖1C，P=0.001），預(yù)后不良患者中AURKA 表達高于預(yù)后良好患者（圖1D，P=0.003），復(fù)發(fā)患者中AURKA的表達高于非復(fù)發(fā)患者（圖1E，P=0.009），G3～4分級的子宮內(nèi)膜癌組織中AURKA表達高于G1～2分級患者（圖1F，P=0.005）。生存分析顯示，AURKA高表達患者的總生存期和無病生存期均小于AURKA 低表達患者（圖1G～H，P=0.006、0.004）。

2.2 芍藥苷體外抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖

CCK-8 檢測顯示，不同濃度芍藥苷（0.5、1.0、2.0 mg/mL）作用于HEC108和Ishikawa細胞72 h后，與對照組相比，芍藥苷可以顯著提高細胞抑制率且呈濃度依賴性（圖2A～B，P=0.011、0.015）。72 h時，0.5 mg/mL濃度芍藥苷作用于HEC108 和Ishikawa 細胞，其細胞抑制率基本達50%，因此選擇0.5 mg/mL 濃度的芍藥苷處理細胞進行體外功能實驗。0.5 mg/mL 濃度芍藥苷作用于HEC108和Ishikawa 細胞后，細胞增殖活性低于Control組（圖2C～D，P=0.015、0.019）；LDH 活性高于Control 組（圖2E，P=0.008、0.012），Ki-67 蛋白表達水平低于Control組（圖2F，P=0.010、0.013）。

圖2 芍藥苷抑制子宮內(nèi)膜癌HEC108和Ishikawa細胞增殖Fig.2 Paeoniflorin inhibited the proliferation of HEC108 and Ishikawa cells

2.3 芍藥苷抑制子宮內(nèi)膜癌細胞遷移、侵襲和EMT

Transwell 實驗結(jié)果顯示，0.5 mg/mL 濃度芍藥苷作用于HEC108 和Ishikawa 細胞后，芍藥苷組遷移細胞數(shù)低于Control組（圖3A，P=0.032、0.039），侵襲細胞數(shù)也低于Control 組（圖3B，P=0.023、0.025）。Western blot 實驗結(jié)果（圖3C）顯示，與Control 組相比，芍藥苷組細胞中MMP2（P=0.027、0.029）、MMP9（P=0.031、0.032）蛋白表達水平均降低。另外，與Control 組相比，芍藥苷組細胞中Vimentin（P=0.022、0.024）、N-cadherin（P=0.023、0.025）、Snail（P=0.026、0.028）蛋白表達水平均降低，而E-cadherin（P=0.021、0.019）蛋白水平升高，見圖3D。

圖3 芍藥苷抑制子宮內(nèi)膜癌細胞遷移、侵襲和EMT Fig.3 Paeoniflorin inhibited migration, invasion and EMT of endometrial cancer cells

2.4 芍藥苷體內(nèi)抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖

裸鼠建模完成后均未出現(xiàn)意外死亡現(xiàn)象，所有移植瘤瘤體表面皮膚完整，無破潰缺損。裸鼠移植瘤實驗2周后成瘤，而且隨著時間的推移，移植瘤體積不斷增大，但是芍藥苷組增長速度明顯小于對照組（圖4A，P=0.021），移植瘤體積和重量小于對照組（圖4B～C，P=0.003、0.006）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，芍藥苷組中Ki-67 相對表達量低于對照組（圖4D，P=0.012）。

圖4 芍藥苷體內(nèi)抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖Fig.4 Paeoniflorin inhibited proliferation of endometrial cancer cells in vivo

2.5 不同濃度芍藥苷對AURKA蛋白表達的影響

Western blot 檢測結(jié)果顯示，隨著芍藥苷濃度增加，HEC108和Ishikawa 細胞中AURKA蛋白表達逐漸減少，呈濃度依賴性（圖5A，P=0.001、0.003）；隨著芍藥苷作用時間的增加，HEC108 和Ishikawa 細胞中AURKA 蛋白表達逐漸減少，呈時間依賴性（圖5B，P=0.004、0.005）；AURKA 組中AURKA 蛋白表達水平高于Vector 組（圖5C，P=0.011、0.014）。細胞增殖實驗顯示，HEC108和Ishikawa 細胞中，AURKA組的OD 值明顯高于Vector 組（圖5D～E，P=0.014、0.018）。AURKA 組細胞LDH 活性低于對Vector 組（圖5F，P=0.024、0.027）。

圖5 AURKA促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖Fig.5 AURKA promoted proliferation of endometrial cancer cells

2.6 芍藥苷通過AURKA抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖

Western blot 實驗結(jié)果顯示（圖6A），與對照組相比，HEC108 和Ishikawa 細胞中AURKA 組的AURKA蛋白表達增加（P=0.016、0.019）；與AURKA 組相比，芍藥苷組中AURKA 蛋白表達減少（P=0.020、0.022）；與芍藥苷組相比，芍藥苷+AURKA 組中AURKA 蛋白表達增加（P=0.002、0.006）。細胞增殖實驗顯示（圖6B～C），與對照組相比，AURKA 組中細胞活性增加（P=0.005、0.008）；與AURKA 組相比，芍藥苷組中細胞活性減少（P=0.006、0.007）；與芍藥苷組相比，芍藥苷+AURKA 組中細胞活性增加（P=0.009、0.012）。LDH 活性檢測實驗結(jié)果顯示（圖6D），與對照組相比，AURKA組中LDH活性減少（P=0.018、0.020）；與AURKA組相比，芍藥苷組中LDH 活性增加（P=0.004、0.006）；與芍藥苷組相比，芍藥苷+AURKA 組中LDH 活性減少（P=0.007、0.009）。

圖6 芍藥苷通過AURKA抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖Fig.6 Paeoniflorin inhibited the proliferation of endometrial cancer through AURKA

3 討論

本研究采用不同濃度的芍藥苷作用子宮內(nèi)膜癌細胞，觀察其對子宮內(nèi)膜癌細胞活力的影響并篩選出合適濃度的芍藥苷進行后續(xù)功能試驗。研究結(jié)果顯示，不同濃度的芍藥苷作用子宮內(nèi)膜癌細胞，其細胞存活率均明顯下降，且濃度越大，細胞存活率越低，呈濃度依賴趨勢。有研究［8］采用芍藥苷處理人子宮內(nèi)膜癌細胞系RL95-2 后發(fā)現(xiàn)其對細胞有明顯抑制作用，且呈劑量和時間依賴性，這與本研究結(jié)果部分相同，說明芍藥苷可能以濃度依賴性的方式抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖。體外功能實驗顯示，經(jīng)芍藥苷處理后的細胞活力降低，LDH 活性升高，Ki-67 蛋白水平降低。本研究結(jié)果提示芍藥苷干預(yù)子宮內(nèi)膜癌細胞可明顯抑制細胞活力和調(diào)節(jié)LDH活性。

裸鼠移植瘤實驗進一步支持芍藥苷對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的抑制作用，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)芍藥苷干預(yù)裸鼠后，芍藥苷組移植瘤體積和重量均小于對照組，裸鼠移植瘤組織中Ki-67蛋白表達也低于對照組。既往研究已證實，腫瘤細胞中Ki-67 增高往往反映腫瘤細胞的增殖活性增強［9］，說明芍藥苷抑制了裸鼠移植瘤生長。同時本研究還通過生物信息學(xué)分析芍藥苷的作用靶點，發(fā)現(xiàn)并驗證了AURKA 與子宮內(nèi)膜癌臨床不良表型有關(guān)?；诖?，本研究進一步通過體外細胞實驗進行驗證芍藥苷是否通過靶向調(diào)節(jié)AURKA 進而影響子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著芍藥苷濃度和時間的增加，AURKA 蛋白表達逐漸減少，呈濃度和時間依賴性，且AURKA 高表達可促進腫瘤細胞增殖，降低LDH 活性，提示AURKA 可以濃度和時間依賴性的方式促進腫瘤細胞增殖；將AURKA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌細胞，發(fā)現(xiàn)芍藥苷可以通過下調(diào)AURKA蛋白表達抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和增加LDH活性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)芍藥苷干預(yù)子宮內(nèi)膜癌細胞后細胞遷移和侵襲能力被抑制；并且細胞中MMP2、MMP9、Vimentin、N-cadherin、Snail 蛋白水平降低，E-cadherin 蛋白水平升高。MMP9 與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，MMP2 也能促進腫瘤細胞遷移［10］。MMP9 和MMP2 是一種基質(zhì)金屬蛋白酶，可以靶向許多胞外蛋白，能降解Ⅳ型膠原蛋白等細胞外基質(zhì)，從多方面、多層次參與腫瘤進展的機制及通路調(diào)控，目前已被發(fā)現(xiàn)與直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等腫瘤進展密切相關(guān)［11-12］。EMT 是指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學(xué)過程。通過EMT，上皮細胞失去了細胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型［13-14］。N-cadherin屬于Ⅰ類鈣黏蛋白，其表達上調(diào)與細胞增殖遷移呈正相關(guān)；E-cadherin 也是在上皮細胞膜表達的跨膜糖蛋白，能夠介導(dǎo)上皮細胞間的黏附連接，對維持正常上皮細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整具有重要作用［15-17］。為了探索芍藥苷抑制子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移的作用機制，本研究從EMT出發(fā)，觀察芍藥苷對子宮內(nèi)膜癌細胞中EMT 相關(guān)蛋白Vimentin、N-cadherin、Snail 和E-cadherin 表達的影響，研究結(jié)果說明芍藥苷可能通靶向AURKA 的方式調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細胞EMT 相關(guān)蛋白表達，抑制EMT發(fā)生，進而抑制腫瘤增殖、侵襲和遷移。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)芍藥苷可以降低子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，抑制EMT，下調(diào)MMP2 和MMP9 蛋白表達，且其作用機制可能與下調(diào)AURKA 表達有關(guān)，說明芍藥苷可能是子宮內(nèi)膜癌潛在的治療藥物，而靶向AURKA 為研究子宮內(nèi)膜癌治療提供了新的途徑。