復(fù)方丹參滴丸抑制活性氧介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷機制

*基金項目：福建省中青年教師教育科研項目（編號 JAT210905）；閩西職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研項目（編號 KJMY2310）的成果之一。

收稿日期：2024-5-4

第一作者簡介：鄭麗麗（1981-），福建龍巖人，碩士，講師，研究方向：藥理學(xué)、藥物分析、藥物化學(xué)。Email：13806983900@163.com。

摘要：目的探討復(fù)方丹參滴丸抑制活性氧介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷的機制。方法使用過氫化氫（H2O2）構(gòu)建內(nèi)皮細胞損傷模型，將細胞分為正常組、模型組、復(fù)方丹參滴丸（50、100、150μg/mL）組，CCK-8檢測細胞增殖情況，LDH試劑盒及ATP 試劑盒檢測細胞毒性及ATP產(chǎn)生，比色法檢測內(nèi)皮細胞MDA含量及SOD活力；ROS熒光探針檢測細胞中ROS含量；Western blot及實時熒光定量PCR檢測各組細胞中Bcl-2、Bax及Cleaved caspase-3的蛋白及mRNA表達情況。在上述模型的基礎(chǔ)上使用ROS清除劑（NAC）構(gòu)建ROS清除模型，將細胞分為正常組，H2O2組，H2O2+復(fù)方丹參100μg/ml組、H2O2+復(fù)方丹參100μg/ml+NAC組，免疫熒光探針、CCK-8、LDH及ATP試劑盒、比色法檢測細胞ROS、增殖、毒性、ATP、MDA、SOD的含量及活力；Western blot及實時熒光定量PCR檢測凋亡蛋白及mRNA表達情況。結(jié)果H2O2刺激后，細胞增殖被抑制，細胞毒性增強，ROS及MDA表達上調(diào)，ATP及SOD表達下調(diào)，Bcl-2表達下調(diào)，Bax及Cleaved caspase-3表達下調(diào)，復(fù)方丹參滴丸干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細胞損傷，以100μg/ml劑量組最顯著。ROS清除劑抑制ROS的產(chǎn)生，并減弱100μg/ml復(fù)方丹參滴丸逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細胞損傷作用。結(jié)論復(fù)方丹參滴丸可逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的內(nèi)皮細胞損傷，此作用可能是通過抑制ROS/Bcl-2/Bax信號通路實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：復(fù)方丹參滴丸，活性氧，內(nèi)皮細胞，增殖，凋亡

中圖分類號：R153.3

文獻標識碼：A

文章編號：1674-9545（2024）02-0000-（07）

DOI：10.19717/j.cnki.jjun.2024.02.020

血管內(nèi)皮是覆蓋在動脈、毛細血管和靜脈壁上最內(nèi)層的結(jié)構(gòu)，可控制血管的舒張/收縮程度、溶質(zhì)、激素、大分子、血小板和血細胞等外滲，不僅是血液及血管壁之間的選擇性通透膜，也是維持血管系統(tǒng)完整性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要結(jié)構(gòu)［1］。血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cell， VECs）是覆蓋在血管內(nèi)膜表面的單細胞層，可分泌抗增殖和抗炎細胞因子以平衡抗凝和促凝因子調(diào)節(jié)體內(nèi)凝血級聯(lián)反應(yīng)［2］。血管內(nèi)皮細胞受損是眾多心血管疾病發(fā)生的主要病理機制之一，研究發(fā)現(xiàn)VECs功能障礙與氧化應(yīng)激增加和NO平衡受損有關(guān)，如氧化應(yīng)激時可導(dǎo)致內(nèi)皮通透性、血小板聚集及粘附性增加，導(dǎo)致疾病進展［3-4］。故內(nèi)皮細胞損傷模型是闡明內(nèi)皮損傷機制和篩選內(nèi)皮保護藥物的重要工具。

復(fù)方丹參滴丸是一種廣泛使用的抗氧化劑，主要治療氣滯血瘀之癥，包括心絞痛、冠心病等心血管疾病，可以修復(fù)動物機體和細胞的多種氧化損傷［5］。既往針對丹參酮、皂苷等的研究發(fā)現(xiàn)其可通過降低凋亡相關(guān)基因如 Bcl-2/Bax表達比率及半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase， caspase）的表達水平，減少內(nèi)皮細胞活性氧（reactive oxygen， ROS）和丙二醛（malondialdehyde， MDA）生成、促進乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase， LDH）滲漏及一氧化氮（nitric oxide， NO）釋放，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）活性及增加腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine triphosphate， ATP）含量，發(fā)揮抗氧化作用保護內(nèi)皮細胞［6-7］。為此本研究選取血管內(nèi)皮為研究對象，水法提取并配制復(fù)方丹參滴丸的不同濃度，驗證復(fù)方丹參滴丸保護血管內(nèi)皮損傷的作用，并使用ROS清除劑明確其具體機制。

1材料與方法

1.1細胞系

血管內(nèi)皮細胞ECV-304細胞株購自上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.2試劑

復(fù)方丹參滴丸（天士力醫(yī)藥集團，批號：201014）；CCK8 試劑盒（上海圣爾生物有限公司）；ATP、MDA、SOD及ATP試劑盒（南京建成生物）；ROS檢測熒光探針（江蘇凱基生物）；Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3及GAPDH抗體（美國 Abcam公司）；辣根過氧化物酶標記二抗（武漢三鷹技術(shù)有限公司）；Trizol 試劑、TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNase HPlus）（2x）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（5×Prime Script RT Master Mix）（日本Takara公司）；其余所用實驗試劑購自國產(chǎn)相關(guān)試劑公司。

1.3主要儀器

Western blot電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Western blot成像系統(tǒng)（美國Alpha-Innotech公司）；熒光定量PCR儀及恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛有限公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；超凈工作臺（美國Sigma公司）；倒置顯微鏡（德國Leica公司）。

1.4細胞培養(yǎng)及處理分組

ECV-304細胞使用含10%胎牛血清、1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日PBS清洗，細胞鋪滿至90%左右時使用胰酶消化傳代。H2O2模型組細胞處理：待細胞貼壁之后，換用含0.5mM濃度的H2O2的細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。復(fù)方丹參（50、100、 150μg/ml）組細胞處理：利用水法提取復(fù)方丹參滴丸，5g生藥提取1g浸膏，提取之后用超純水配制復(fù)方丹參滴丸的系列濃度（50、100、 150μg/mL），放置冰箱中備用；細胞分組貼壁后，更換含0.5mM濃度H2O2的DMEM培養(yǎng)基時，加入不同濃度的復(fù)方丹參溶液繼續(xù)培養(yǎng)。H2O2+復(fù)方丹參+N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）組細胞處理：待正常細胞貼壁后，加入2.5mmol/L的NAC預(yù)處理3h后，再按照上述復(fù)方丹參組細胞處理方法處理。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖

將細胞分別接種于96孔中培養(yǎng)板，每孔細胞數(shù)為3000/個，每組設(shè)置5個復(fù)孔，按照1.4中細胞分組處理各組細胞。根據(jù)CCK-8細胞增殖活性測定試劑盒說明書，分別于0 h、24h、48h和72h取出細胞培養(yǎng)上清液分別加入10μL的CCK-8溶液。在37℃，5%CO2孵育1h，酶標儀測定450 nm處OD值，繪制細胞生長曲線。

1.6 LDH檢測細胞毒性

將細胞分別接種于96孔中培養(yǎng)板，每孔細胞數(shù)為3000/個，每組設(shè)置5個復(fù)孔，按照1.4中細胞分組處理各組細胞。按照LDH檢測試劑盒說明書配置下相關(guān)溶液，提取細胞上清液，酶標儀檢測440 nm處各孔吸光度值。

1.7 ATP含量測定

收集按照1.4分組處理之后的細胞，置于沸水浴中勻漿破碎，按照ATP檢測試劑盒說明書加試劑，混勻后靜置5min。酶標儀檢測636nm處各孔吸光度值，記錄并分析結(jié)果。

1.8 MDA及SOD含量測定

按照1.4分組處理細胞，收集細胞上清液，按照試劑盒說明書分別測定MDA及SOD含量。

1.9 ROS熒光探針

取1.4處理好的細胞，清洗之后加入終濃度為10μM的二氫乙錠液，避光孵育30 min，PBS再次清洗細胞。熒光顯微鏡拍照，保存。

1.10 Western Blot檢測蛋白表達

收集按照1.4方法處理的細胞至EP管中，加入100μl蛋白裂解液，離心取上清，提取細胞蛋白，提取之后加入上樣緩沖液，混勻后100℃煮沸變性，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。使?0%SDS-PAGE凝膠電泳系統(tǒng)分離蛋白，根據(jù)目標蛋白的分子量切膠，轉(zhuǎn)膜之后放入脫脂牛奶中封閉，4小時后再次清洗，一抗4℃孵育過夜，次日取出PVDF膜搖床清洗，二抗4℃孵育1h，再次清洗后凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.11實時熒光定量PCR

收集經(jīng)1.4處理的細胞，利用Trizol試劑盒提取總RNA，使用PCR儀將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3及內(nèi)參的引物如下：Bcl-2-F： 5'- GTGCCATTTTACTTTCCTACC-3'，Bcl-2-R： 5'- TAGGGAAATGCAACCAAAACC-3'；Bax-F： 5'- ACGGCTACACAGGAGAGTTTGA-3'，Bax-R： 5'- TCAAACTCTCCTGTGTAGCCGT-3；Cleaved caspase-F： 5'- AGCACCTGGTTACTATTCCTG-3'， Cleaved caspase-R： 5'- TAAATTCTAGCTTGTGCGCGTA-3'；內(nèi)參GAPDH-F： 5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'，GAPDH-R： 5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'。實時熒光定量PCR儀的25μL擴增體系如下，2μL的cDNA，12.5μL的2×Super Real Premix；0.75μL的上、下游引物（10μmol/L）；9μL的RNase-free ddH2O。擴增條件為：94℃，5min；94℃，20s；60℃，34s；35個循環(huán)。

1.12統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)之間比較釆用t檢驗，當p＜0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1復(fù)方丹參降低內(nèi)皮細胞ROS的產(chǎn)生

與正常組相比，H2O2刺激后細胞ROS產(chǎn)生增多，復(fù)方丹參滴丸可不同程度降低ROS水平，以100μg/mL濃度時降低最為顯著（p＜0.05），見圖1。

（與正常組相比，##p＜0.01；與模型組相比，*p＜0.05，**p＜0.01）

2.2復(fù)方丹參對內(nèi)皮細胞增殖、毒性及MDA、ATP、SOD的影響

與正常組細胞相比，模型組細胞增殖緩慢，LDH和MDA產(chǎn)生增多，ATP及SOD活力降低；與模型組細胞相比，復(fù)方丹參不同濃度組可減弱H2O2的生長抑制作用，LDH和MDA產(chǎn)生明顯減少，ATP及SOD活力增強，以100μg/mL濃度時作用最為顯著（p＜0.05），見圖1。

A： 不同濃度復(fù)方丹參滴丸對細胞增殖的影響；B：不同濃度復(fù)方丹參滴丸對細胞產(chǎn)生LDH的影響；C-E：不同濃度復(fù)方丹參滴丸對細胞MDA、ATP、SOD的影響。

（與正常組相比，##p＜ 0.01；與模型組相比，*p＜ 0.05，**p＜ 0.01。）

2.3復(fù)方丹參對內(nèi)皮細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

與正常組相比，模型組Bcl-2蛋白及mRNA表達下降，Bax及Cleaved caspase-3表達升高；與模型組相比，復(fù)方丹參滴丸可使Bcl-2表達升高并下調(diào)Bax及Cleaved caspase-3的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），見圖3。

A： 不同濃度復(fù)方丹參滴丸對Bcl-2， Bax及Cleaved caspase-3蛋白表達的影響；B不同濃度復(fù)方丹參滴丸對Bcl-2， Bax及Cleaved caspase-3 mRNA表達的影響

（與正常組相比，##p＜ 0.01；與模型組相比，*p＜ 0.05，**p＜ 0.01）

2.4 ROS清除劑NAC抑制內(nèi)皮細胞ROS的產(chǎn)生

與正常組比較，H2O2刺激后細胞產(chǎn)生ROS明顯增多，100μg/mL復(fù)方丹參滴丸及NAC組ROS熒光水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），見圖4。

2.5 ROS清除劑NAC對細胞增殖、毒性及MDA、ATP、SOD的影響

100μg/mL復(fù)方丹參滴丸可逆轉(zhuǎn)H2O2的細胞抑制并降低細胞毒性，增加ATP及SOD活力。與復(fù)方丹參組比較，NAC可減弱復(fù)方丹參的作用，細胞增殖緩慢，LDH和MDA產(chǎn)生增多，ATP及SOD活力降低（p＜0.05），見圖5。

A： ROS清除劑NAC對細胞增殖的影響；B： ROS清除劑NAC對細胞產(chǎn)生LDH的影響；C-E：ROS清除劑NAC對細胞MDA、ATP、SOD的影響。

與正常組相比，#p＜0.05，##p＜0.01；與H2O2組相比，*p＜0.05，**p＜0.01；與H2O2+復(fù)方丹參100μg/mL組比較，△p＜0.05，△△p，p＜0.01

2.6 ROS清除劑NAC對內(nèi)皮細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

100μg/mL復(fù)方丹參滴丸可降低促凋亡相關(guān)蛋白表達，如使Bcl-2表達升高并下調(diào)Bax及Cleaved caspase-3的表達。與復(fù)方丹參組相比，NAC預(yù)處理后Bcl-2表達明顯降低，Bax及Cleaved caspase-3的表達明顯升高（p＜0.05，圖6）

A： ROS清除劑NAC對Bcl-2， Bax及Cleaved caspase-3蛋白表達的影響；BROS清除劑NAC對Bcl-2， Bax及Cleaved caspase-3 mRNA表達的影響。

（與正常組相比，#p＜0.05，##p＜0.01；與H2O2組相比，*p＜0.05，**p＜0.01；與H2O2+復(fù)方丹參100μg/ml組比較，△p＜0.05，△△p＜0.01）

3討論

氧化應(yīng)激的發(fā)生是眾多心血管疾病進展的高危因素，當機體發(fā)生損傷或氧化/抗氧化劑水平不平衡即可導(dǎo)致氧化應(yīng)激［8］。H2O2作為一種超強氧化劑，在氧化還原信號傳導(dǎo)及過程中起著至關(guān)重要的監(jiān)管作用，H2O2通過超氧陰離子及金屬離子等作用，產(chǎn)生異?；顫姷牧u基自由基，羥基自由基與體內(nèi)幾乎所有的有機物均能發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)［9］。過多的H2O2會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞中ROS的積累，刺激內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致?lián)p傷［10］。對于過度ROS的產(chǎn)生及氧化應(yīng)激反應(yīng)，機體內(nèi)存在非酶促及酶促體系以清除ROS，非酶促體系如抗氧化劑可通過螯合亞鐵離子發(fā)揮抗氧化作用；酶促體系中的過氧化氫酶（Catalase， CAT）及SOD等，如SOD可將超氧氫離子分解為較弱的過氧化氫，過氧化氫隨即可被CAT分解，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，但是SOD及CAT也易受到氧自由基的攻擊，將氧自由基的級聯(lián)反應(yīng)擴大，加重氧化應(yīng)激［11-12］。故正常體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除處于相對平衡的狀態(tài)，使氧化應(yīng)激處于較低水平，一旦失衡會使氧化應(yīng)激反應(yīng)進入惡性循環(huán)，導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生。此外研究表明，不同濃度的硫酸鎳對血管內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)呈現(xiàn)劑量和時間依賴性的抑制作用，可增加IL-6及TGF-α的水平引發(fā)炎癥反應(yīng)，并能導(dǎo)致細胞凋亡，表現(xiàn)為Bcl-2表達降低，Bax及caspase 3表達升高，此作用是通過刺激ROS產(chǎn)生誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)實現(xiàn)的［13］。與上述結(jié)果類似的是，在該研究中使用H2O2刺激血管內(nèi)皮細胞，結(jié)果顯示細胞增殖緩慢，毒性增加，ROS和氧化應(yīng)激標志物MDA生成增多，SOD生成減少，并可誘導(dǎo)細胞凋亡，提示過度的H2O2在內(nèi)皮細胞中可引起氧化應(yīng)激級聯(lián)反應(yīng)。

復(fù)方丹參滴丸是傳統(tǒng)中藥方劑，此方劑中含丹參、三七及冰片三種主要物質(zhì)，丹參為君藥，取自丹參植物的根莖系，主要的活性成分為水溶性的丹參素、丹酚酸和脂溶性的丹參酮及等［14］。丹參酮通過促進缺血心肌ATP的合成，具有正性肌力作用；丹參素及丹酚酸具有抗氧化及清除體內(nèi)自由基等作用，發(fā)揮抗血小板聚集，抗氧化，改善微循環(huán)等作用，整體可表現(xiàn)為通行血脈，活血祛瘀之效［15］。三七為臣藥，內(nèi)含三七皂苷等四環(huán)三萜、三七素及槲皮素等多糖類物質(zhì)，可螯合亞鐵離子，清除過氧化氫及超氧陰離子，具有散瘀止血，消腫止痛等作用［16］。冰片為佐藥，具有芳香開竅，通陽定痛的作用［17］。三者合用，可芳香開竅、活血化瘀、通絡(luò)止痛。從現(xiàn)代藥理學(xué)看，復(fù)方丹參滴丸具有調(diào)脂、舒張血管、抗炎抗氧化、降低粘附等作用，但是方劑的具體作用機制仍不明確［18］。該研究通過水提法提取復(fù)方丹參滴丸的活性成分，作用于H2O2刺激后的血管內(nèi)皮細胞，結(jié)果表明復(fù)方丹參滴丸可逆轉(zhuǎn)H2O2的增殖抑制及毒性作用，降低ROS及MDA的產(chǎn)生，促進ATP及SOD活力，同時降低Bcl-2/Bax表達比率及caspase-3的表達，且可能存在一定的劑量依賴性，以100μg/ml作用最強。

ROS是心血管系統(tǒng)氧化應(yīng)激的重要遞質(zhì)，也是線粒體介導(dǎo)凋亡通路的關(guān)鍵物質(zhì)［19］。過量的ROS使線粒體中的凋亡相關(guān)蛋白釋放至細胞質(zhì)中，線粒體途徑是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中經(jīng)典的下游效應(yīng)途徑，線粒體蛋白Bcl-2及Bax相互拮抗控制細胞凋亡［20］。同時在caspase級聯(lián)反應(yīng)中，caspase-3剪切形成Cleaved caspase-3促進細胞凋亡。為了驗證復(fù)方丹參滴丸降低氧化應(yīng)激反應(yīng)及凋亡是否通過靶向ROS而實現(xiàn)，該研究使用ROS清除劑NAC預(yù)處理內(nèi)皮細胞后檢測細胞變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用NAC預(yù)處理后，細胞ROS分泌降低，與復(fù)方丹參滴丸組比較，細胞活力減弱，毒性凋亡增加，提示復(fù)方丹參滴丸的對內(nèi)皮細胞的正向作用被削弱，表明復(fù)方丹參滴丸是通過減弱ROS的途徑降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護內(nèi)皮細胞。

綜上所述，在氧化應(yīng)激條件下，復(fù)方丹參通過降低ROS的產(chǎn)生從而減輕H2O2對人血管內(nèi)皮細胞的氧化損傷，包括增加酶促反應(yīng)，促進增殖，降低凋亡等。通過上述結(jié)果，有助于了解復(fù)方丹參滴丸與氧化損傷的關(guān)系，為治療心血管疾病提供理論支持。

參考文獻：

［1］Rajendran P，Rengarajan T，Thangavel J，et al. The vascular endothelium and human diseases［J］. Int J Biol Sci. 2013，9（10）：1057.

［2］Ribatti D，Tamma R，Annese T. The role of vascular niche and endothelial cells in organogenesis and regeneration［J］. Exp Cell Res. 2021，398（1）：112398.

［3］Zhang Q，Liu J，Duan H，et al. Activation of Nrf2/HO-1 signaling： An important molecular mechanism of herbal medicine in the treatment of atherosclerosis via the protection of vascular endothelial cells from oxidative stress［J］. J Adv Res. 2021，34（3）：43.

［4］Jeong H，Choi D，Oh Y，et al. A Nanocoating Co-Localizing Nitric Oxide and Growth Factor onto Individual Endothelial Cells Reveals Synergistic Effects on Angiogenesis［J］. Adv Healthc Mater，2022，11（6）：e2102095.

［5］李夢蘭，徐天，李全，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究復(fù)方丹參滴丸治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的作用機制［J］. 中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2023，25（2）：156.

［6］Jia LQ，Yang GL，Ren L，et al. Tanshinone IIA reduces apoptosis induced by hydrogen peroxide in the human endothelium-derived EA.hy926 cells［J］. Journal of Ethnopharmacology，2012，8（2）：100.

［7］朱軍鳳，姜旭，陳溢瀅，等.三七總皂苷對ApoE～（-/-）小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成及自噬的影響［J］.河南中醫(yī)，2023，43（3）：378.

［8］Fuentes E，Moore-Carrasco R，de Andrade Paes AM，et al. Role of platelet activation and oxidative stress in the evolution of Myocardial infarction［J］. J Cardiovasc Pharmacol Ther，2019，24（6）：509.

［9］Jiang F， Xu XR， Li WM， et al. Monotropein alleviates H2O2-induced inflammation， oxidative stress and apoptosis via NF-KB/AP-1 signaling［J］. Mol Med Rep，2020， 22 （6）：4828.

［10］周蒙恩，張娜，闕任燁，等.柴胡皂苷-d對H2O2誘導(dǎo)的HL-7702細胞ROS產(chǎn)生及NLRP3炎癥體的影響［J］.中國免疫學(xué)雜志，2021，37（20）：2470.

［11］張妍薇，鄭皖，楊人貴，等.Fisetin對H2O2誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS的清除作用及機制探討［J］.生命科學(xué)研究，2019，23（6）：437.

［12］朱可馨，王冰，王志成.活性氧在血小板活化和凋亡中的作用機制研究進展［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2015，42（8）：1575.

［13］Liu Y，Gong X，Wang J，et al. Investigation of nickel sulfate-induced cytotoxicity and underlying toxicological mechanisms in human umbilical vein endothelial cells through oxidative stress，inflammation，apoptosis，and MAPK signaling pathways［J］. Environ Toxicol，2022，37（8）：2058.

［14］呂睿婷，馬聰，呂睿倩.糖尿病腎病應(yīng)用厄貝沙坦聯(lián)合復(fù)方丹參滴丸的療效分析［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2023，17（7）：136.

［15］張誼，歐玉龍，王惠霞，等.丹參酮ⅡA通過調(diào)節(jié)線粒體轉(zhuǎn)位蛋白誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡［J］中國藥理學(xué)通報，2023，39（1）：101.

［16］曹玉標，孫亮亮，楊野，等. 三七藥渣中主要多糖成分的分離純化及其抗氧化活性研究［J］.中草藥，2023，54（1）：100.

［17］朱婷婷，寇冠軍，王保和.芳香開竅中成藥在心血管系統(tǒng)中應(yīng)用的臨床進展［J］.中國藥物評價，2015，32（3）：151.

［18］曾建勇，王小玲，范小虹，等.復(fù)方丹參滴丸聯(lián)合阿托伐他汀治療冠心病合并心絞痛療效及對患者氧化應(yīng)激指標的影響［J］. 陜西中醫(yī)，2023，44（1）：55.

［19］Chuang KC，Chang CR，Chang SH，et al. Imiquimod-induced ROS production disrupts the balance of mitochondrial dynamics and increases mitophagy in skin cancer cells［J］. J Dermatol Sci，98（3）：152.

［20］Wang X，Lu X，Zhu R，et al. Betulinic Acid Induces Apoptosis in Differentiated PC12 Cells Via ROS-Mediated Mitochondrial Pathway［J］. Neurochem Res. 2017，42（4）：1130.

［21］Asadi M，Taghizadeh S，Kaviani E，et al. Caspase-3： Structure，function，and biotechnological aspects［J］. Biotechnol Appl Biochem，2022，69（4）：1633.

Mechanism of Compound Danshen Dripping Pills to Inhibit

Endothelial Cell Damage Mediated by Reactive Oxygen Species

ZHENG Lili1，CAO Yangyuan1，WEI Lan1，LIU Meichen2

（1 Minxi vocational amp; Technical college;2 Pharmacy Department Fujian Medical Uniuersity Affliated Longyan First Hospital，Longyan，F(xiàn)ujian 364000，China）

ABSTRACT" Objective To explore the mechanism of compound Danshen dripping pills inhibiting endothelial cell damage mediated by reactive oxygen species.

Method H2O2 was used to construct endothelial cell injury model， and the cells were divided into normal group， model group， compound Danshen dripping pills （50， 100， 150μg/ml） groups. Cell proliferation was detected by CCK-8， and cytotoxicity and ATP production were detected by LDH and ATP kit. MDA content and SOD activity of endothelial cells were detected by colorimetry. ROS fluorescence probe was used to detect ROS content in cells. The protein and mRNA expression of Bcl-2， Bax and Cleaved caspase-3 were detected by Western blot and real-time quantitative PCR. On the basis of the above models， ROS scavenging model was constructed using ROS scavengers （NAC）. The cells were divided into normal group， H2O2 group， H2O2+ compound Danshen 100μg/ml， H2O2 + compound Danshen 100μg/mL+NAC group. The contents and activities of ROS， proliferation， toxicity， ATP， MDA and SOD were detected by immunofluorescence probe， CCK-8， LDH and ATP kit and colorimetry. The expressions of apoptotic proteins and mRNA were detected by Western blot and real-time quantitative PCR.

Result After H2O2stimulation， cell proliferation was inhibited and cytotoxicity was enhanced， ROS and MDA expression was up-regulated， ATP and SOD expression was down-regulated， Bcl-2 expression was down-regulated， Bax and Cleaved caspase-3 expression were down-regulated， and endothelial cell damage was reversed after compound Danshen-based dropping pills， which was most significant in the 100μg/mL group. ROS scavenger inhibited ROS production and weakened the effect of 100μg/mL compound Danshen dripping pills on reversing endothelial cell damage.

Conclusion Compound Danshen dripping pills can reverse endothelial cell damage caused by oxidative stress， which might be achieved by inhibiting ROS/Bcl-2/Bax signaling pathway.

KEY WORDS" compound danshen dripping pills； reactive oxygen species； endothelial cells； proliferate； apoptosis

（責(zé)任編輯" 寧梵西）