根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

摘要：為進(jìn)一步提高根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化效率，本試驗(yàn)以紫花苜蓿（Medicago sativa L.）品種‘中苜1號(hào)’為試驗(yàn)材料，通過篩選高效再生的植株，以篩選出的植株葉片為外植體，并通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基激素配比，在農(nóng)桿菌侵染過程中添加谷氨酰胺、進(jìn)行冷處理等措施優(yōu)化苜蓿由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。試驗(yàn)結(jié)果表明：轉(zhuǎn)化過程中以嫩葉作為外植體，菌液和重懸液中添加150 μmol·L-1乙酰丁香酮，侵染過程中使用300 μmol·L-1的谷氨酰胺將瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率從32%提高至92%，轉(zhuǎn)化效率提高到31%。研究紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化體系可為紫花苜蓿高效遺傳改良及基因功能研究提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；根癌農(nóng)桿菌；遺傳轉(zhuǎn)化；體系優(yōu)化

中圖分類號(hào)：Q756"" "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）06-1665-07

Optimization of Agrobacterium Tumefaciens-Mediated Genetic

Transformation System of Alfalfa

WANG Zhi-jie， LI Ming-xu， ZHANG Wan-jun*

（College of Grassland Science and Technology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

Abstract：In order to improve Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation efficiency of alfalfa （Medicago sativa L.），we used alfalfa variety ‘Zhongmu No.1’ as plant material. The genetic transformation system of alfalfa mediated by agrobacterium was optimized by selecting the highly regeneration plant，using young leaves as explants，adjusting the hormone ratio in the medium，adding glutamine，and giving a cold treatment during agrobacterium infection. The results showed that the transient transformation efficiency of ‘Zhongmu No.1’ increased from 32% to 92% and the stable transformation efficiency increased to 31% by adding 150 μmol·L-1 acetosyringone to the bacterial suspensions solution，and using 300 μmol·L-1 glutamine during infection. The genetic transformation system of alfalfa reported in this paper provides technical support for efficient genetic improvement and gene functional study of alfalfa.

Key words：Alfalfa;Agrobacterium tumefaciens;Genetic transformation;System optimization

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一種多年生的豆科牧草，因其粗蛋白含量高、適口性好、生長迅速等優(yōu)點(diǎn)，被譽(yù)為“牧草皇后”。目前，我國的苜蓿干草和種子仍大量依靠進(jìn)口［1］，亟需培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新品種。紫花苜蓿是同源多倍體，具有自交不親和的遺傳特性。目前，國內(nèi)現(xiàn)有品種均是通過傳統(tǒng)育種方式育成，周期長、效率低。近年來，隨著基因工程育種技術(shù)的不斷發(fā)展，使得快速、定向獲得優(yōu)質(zhì)新種質(zhì)材料成為了可能。而遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是現(xiàn)代基因工程育種的底盤技術(shù)，因此，建立快速、高效的紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系是加速優(yōu)質(zhì)苜蓿育種進(jìn)程的首要前提。

Deak等［2］首次使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法成功轉(zhuǎn)化紫花苜蓿后，多位研究者通過對(duì)培養(yǎng)基配方、外源激素配比、最適農(nóng)桿菌菌株等進(jìn)行了詳細(xì)的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)大部分苜蓿品種在侵染過程中使用EHA105農(nóng)桿菌菌株侵染效果較好，在添加一定濃度的2，4-D、6-BA、KT的MS基本培養(yǎng)基上，愈傷誘導(dǎo)率及再分化率較高［3-5］，但是目前國內(nèi)大部分苜蓿品種轉(zhuǎn)化效率仍不足10%［6-8］?！熊?號(hào)’是我國重要栽培品種，抗逆性狀優(yōu)良［9］，是紫花苜?；蚬こ逃N的優(yōu)質(zhì)底盤材料，但目前‘中苜1號(hào)’遺傳轉(zhuǎn)化體系的轉(zhuǎn)化效率較低［8］，限制了應(yīng)用該品種開展分子育種方面的研究。為此，需對(duì)其遺傳轉(zhuǎn)化流程進(jìn)行優(yōu)化，建立高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系都以幼苗的子葉或下胚軸作為外植體，但由于紫花苜蓿具有異花授粉的特性，其品種內(nèi)部任何兩粒種子的基因型都可能不一致，影響對(duì)紫花苜蓿基因功能的研究。因此，本試驗(yàn)以篩選獲得的‘中苜1號(hào)’高再生植株葉片為外植體，選擇適宜的潮霉素篩選濃度，探究不同類型葉片外植體、添加乙酰丁香酮（AS）、添加谷氨酰胺（Gln）及冷處理對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，優(yōu)化了‘中苜1號(hào)’的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為紫花苜蓿的遺傳改良和基因功能研究提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以紫花苜蓿品種‘中苜1號(hào)’的葉片（如圖2B所示）、子葉和下胚軸（如圖1B所示）作為外植體。

試驗(yàn)農(nóng)桿菌為含有pCAMBIA1305.1質(zhì)粒的EHA105，T-DNA區(qū)包括由煙草花葉病毒35S啟動(dòng)子控制下的潮霉素篩選標(biāo)記基因及GUS報(bào)告基因。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 篩選高效再生材料 選取萌發(fā)7天‘中苜1號(hào)’無菌苗的子葉和下胚軸為外植體，切為小塊，置于D+K培養(yǎng)基上，組培室條件下（26℃，16 h，5 000 Lux光照/ 8 h黑暗）進(jìn)行脫分化誘導(dǎo)，培養(yǎng)2周后挑選愈傷組織于DK培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，挑選魚雷型胚狀體移入MSK培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽再生，每兩周繼代1次，繼代1～2次后轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)至根系形成以獲得高再生的植株。體細(xì)胞發(fā)生率高，胚狀體容易成苗的再生苗被看作是容易再生的苜蓿植株。

1.2.2 潮霉素篩選條件優(yōu)化 以前期篩選出的高再生植株葉片作為外植體，0.1%次氯酸鈉溶液消毒葉片5 min，無菌水沖洗6～8次后使用無菌解剖刀切為0.25 cm2左右大小的方形小塊（如圖3A所示），實(shí)驗(yàn)組外植體置于添加5 mg·L-1 潮霉素（Hygromycin B，Hyg）的BD培養(yǎng)基光下培養(yǎng)，對(duì)照實(shí)驗(yàn)組不添加潮霉素。將培養(yǎng)14天后的實(shí)驗(yàn)組外植體分別放置于含有5，10，15，20 mg·L-1濃度梯度潮霉素的D+K培養(yǎng)基，對(duì)照實(shí)驗(yàn)組置于不含潮霉素的D+K培養(yǎng)基，每個(gè)處理20片外植體，每2周繼代一次并統(tǒng)計(jì)正常狀態(tài)愈傷比例，重復(fù)3次。

1.2.3 添加AS濃度的優(yōu)化 在菌液、重懸液、共培養(yǎng)基中分別添加50，100，150 μmol·L-1 AS進(jìn)行轉(zhuǎn)化（重懸液及共培養(yǎng)基需在滅菌后加入），具體操作為：菌液搖培至OD600≈0.5，分別加入50，100，150 μmol·L-1 AS，繼續(xù)培養(yǎng)菌液至OD600≈0.8，5 000 r·min-1 離心5 min收集菌體，用重懸液重懸至OD600為0.2～0.4，28℃放置2 h，制備為侵染液。

1.2.4 最佳外植體選擇的優(yōu)化 以刈割后新長出枝條頂端的第1，2片葉（嫩葉）、第3到5片葉（成熟葉）、莖基部葉（老葉）為外植體，0.1%次氯酸鈉溶液消毒葉片5 min，無菌水沖洗6～8次后切為0.25 cm2左右大小的方形小塊進(jìn)行侵染，重復(fù)3次。

1.2.5 侵染流程的優(yōu)化 以相同數(shù)目的外植體分別采用不同處理方式探究侵染流程中添加谷氨酰胺，冷處理對(duì)侵染效率和轉(zhuǎn)化效率的影響，每種處理方式具體操作為：

CK：外植體侵染前不進(jìn)行處理，浸入侵染液真空處理2 min（-0.08 Mp）。

G：外植體在含有300 μmol·L-1的Gln 的3%蔗糖溶液中室溫浸泡20 min，浸入含有300 μmol·L-1的Gln在侵染液中，真空處理2 min（-0.08 Mp）。

CG：外植體放于預(yù)冷的含有300 μmol·L-1Gln的3%蔗糖溶液中，置于冰盒中冰浴20 min，后浸入含有300 μmol·L-1的Gln在侵染液中，真空處理2 min（-0.08 Mp）。

經(jīng)上述方式處理后的外植體置于80 rpm·min-1 28℃條件下?lián)u培侵染20 min，將侵染后的葉片在超凈臺(tái)中晾干，置于加蓋有1層無菌濾紙的共培養(yǎng)基中，暗處共培養(yǎng)3天。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.6 篩選和分化培養(yǎng) 共培養(yǎng)3天后的外植體移入BD培養(yǎng)基（添加5 mg·L-1潮霉素、100 mg·L-1 特美汀、200 mg·L-1頭孢噻肟鈉），組培室條件下培養(yǎng)。2周后，將外植體分成小塊，置于D+K培養(yǎng)基（添加10 mg·L-1潮霉素、100 mg·L-1 特美汀、200 mg·L-1頭孢噻肟鈉），每2周繼代1次，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。挑選生長旺盛的白色愈傷組織（抗性愈傷，如圖4 F所示）置于DK培養(yǎng)基（添加10 mg·L-1潮霉素、100 mg·L-1 特美汀、200 mg·L-1頭孢噻肟鈉）誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生，挑選魚雷型胚狀體置于MSK培養(yǎng)基（添加10 mg·L-1潮霉素、100 mg·L-1 特美汀、200 mg·L-1頭孢噻肟鈉）培養(yǎng)14天進(jìn)行芽再生，隨后轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基直至幼芽生長為再生幼苗。

1.2.7 GUS基因表達(dá)檢測(cè)及指標(biāo)統(tǒng)計(jì) 使用GUS染色試劑盒進(jìn)行檢測(cè)（購于北京酷來博科技有限公司，產(chǎn)品貨號(hào)SL7160）。分別選取外植體（共培養(yǎng)3天）、胚狀體和幼苗的葉片進(jìn)行染色。將待染色的組織浸泡在GUS染色液中，真空處理10 min（-0.08 Mp），37℃暗處染色過夜，75%乙醇溶液脫色至未表達(dá)部位呈白色（NiKon SMZ25體視顯微鏡拍攝）。通過GUS的表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)以下數(shù)據(jù)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率=含有藍(lán)色組織的外植體數(shù)/染色總數(shù)，植株陽性率=顯色為藍(lán)色的植株數(shù)（陽性植株）/染色的植株總數(shù)，轉(zhuǎn)化效率=含有GUS基因表達(dá)植株的株系數(shù)/轉(zhuǎn)化的總外植體數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選高效再生遺傳背景材料

‘中苜1號(hào)’紫花苜蓿的子葉和下胚軸經(jīng)過脫分化、體細(xì)胞胚誘導(dǎo)、芽再生及生根培養(yǎng)后，從不同遺傳背景的愈傷組織中，篩選體細(xì)胞發(fā)生頻率高的愈傷組織上再生的植株，用于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化。

2.2 篩選培養(yǎng)潮霉素濃度

脫分化誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后，將外植體置于含有不同濃度潮霉素的D+K培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周，每2周生長旺盛狀態(tài)愈傷的比例，隨著潮霉素濃度的升高，愈傷組織的褐化速度不斷加快，潮霉素濃度高于10 mg·L-1條件下，培養(yǎng)2周時(shí)愈傷組織的生長會(huì)明顯受到抑制，并且4周時(shí)90%以上的愈傷組織褐化，無法再分化出胚狀體，但是15，20 mg·L-1的潮霉素在2周時(shí)會(huì)使愈傷嚴(yán)重褐化，生長抑制嚴(yán)重（圖2）。因此，在后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，選擇10 mg·L-1潮霉素用于篩選抗性愈傷。

2.3 苜蓿嫩葉的轉(zhuǎn)化效率高

外植體是影響轉(zhuǎn)化效率的一個(gè)重要因素，試驗(yàn)選定了不同部位的葉片作為轉(zhuǎn)化受體，根據(jù)生長位置差異分類，通過GUS染色，測(cè)定農(nóng)桿菌對(duì)不同類型外植體的侵染能力，結(jié)果顯示：3種類型的葉片中，只有嫩葉和成熟葉中檢測(cè)到GUS基因的表達(dá)，老葉中未檢測(cè)到GUS基因的表達(dá)，其中嫩葉的農(nóng)桿菌侵染率相比成熟葉片高20%，并且培養(yǎng)2周后，嫩葉脫分化狀況最好，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇莖頂端新生的葉片為外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化。

2.4 添加150 μmol·L-1AS轉(zhuǎn)化效率高

侵染液和共培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的AS進(jìn)行轉(zhuǎn)化。篩選培養(yǎng)后，統(tǒng)計(jì)抗性愈傷（HygR愈傷，生長旺盛的白色愈傷）比例，再分化率和幼芽陽性率，結(jié)果如表3所示：添加50，100，150 μmol·L-1AS的抗性愈傷比例、再分化率和幼芽GUS陽性率依次增加。AS-150下，再分化率和幼芽GUS陽性率分別達(dá)20.95%和19.80%，高于AS-50和AS-100。說明加入150 μmol·L-1的AS能顯著提高轉(zhuǎn)化效率。

2.5 侵染時(shí)添加谷氨酰胺有利于轉(zhuǎn)化

本試驗(yàn)共設(shè)置3種處理方式，統(tǒng)計(jì)分析瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化效率，3種處理方式中，G處理轉(zhuǎn)化效率最高，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率為92.35%，轉(zhuǎn)化效率為31.56%，因此添加Gln能夠顯著提高農(nóng)桿菌的侵染效率（表4）。

3 討論

基因型是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素，紫花苜蓿的體外再生能力具有很強(qiáng)的基因型依賴性［10］，不同品種間及同一品種內(nèi)不同植株間的再生效率差異巨大，選擇高頻再生的基因型是高效遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的前提［11］。多位學(xué)者通過對(duì)不同類型外植體組織培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)不同外植體的再生效率差異顯著［12-14］，王強(qiáng)龍等［15］比較了紫花苜蓿的下胚軸、子葉、葉片和葉柄的再生能力，發(fā)現(xiàn)下胚軸是一種理想的受體材料，并以下胚軸作為外植體建立了紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化體系。雖然下胚軸再生能力較強(qiáng)，但轉(zhuǎn)化效率仍極低，且不能排除基因型的影響，難以進(jìn)行基因的研究。相比之下，以高再生基因型的植株葉片作為轉(zhuǎn)化受體，材料易獲得，遺傳背景一致，在應(yīng)用方面有更好的前景。但不同生長部位的葉片再生和轉(zhuǎn)化效率差異較大，大多數(shù)植物的幼嫩組織部位的再生及轉(zhuǎn)化效果更好，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，后續(xù)探究其他品種紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系時(shí)，可優(yōu)先采用幼嫩組織為外植體以提高轉(zhuǎn)化效率。

本研究所用的雙元載體pCAMBIA1305.1的T-DAN區(qū)含有抗潮霉素的篩選標(biāo)記基因，遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中用抗生素潮霉素B來篩選轉(zhuǎn)基因抗性再生苗。添加篩選劑是遺傳轉(zhuǎn)化過程中從大量細(xì)胞或組織中篩選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞及陽性植株的有效手段［16］，篩選劑濃度會(huì)對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生影響。較低濃度的篩選劑無法有效篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，過高濃度的篩選劑會(huì)導(dǎo)致未整合表達(dá)篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞受到損傷，降低轉(zhuǎn)化體系的效率。因此，選擇合適的篩選劑添加濃度對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化尤為重要。潮霉素B具有篩選效果顯著﹑不同基因型間篩選效果差異小等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。苜蓿不同品種及同一品種的不同部位對(duì)潮霉素的敏感度存在差異，如苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系中潮霉素的適宜濃度范圍是10～50 mg·L-1，保定苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化體系采用30 mg·L-1潮霉素作為愈傷誘導(dǎo)及分化階段的篩選濃度，‘西南1號(hào)’紫花苜蓿葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系的篩選濃度適合設(shè)定為10 mg·L-1潮霉素［17-19］。因此，在優(yōu)化體系前測(cè)定外植體對(duì)篩選劑的敏感度，選擇一個(gè)能夠抑制絕大多數(shù)未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選劑濃度十分重要。

侵染流程是轉(zhuǎn)化方案中最為核心的部分［11］，優(yōu)化外植體選擇后，還可以通過優(yōu)化侵染流程進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率。在轉(zhuǎn)化過程中，葉片的造傷程度、農(nóng)桿菌活性、植物細(xì)胞在農(nóng)桿菌侵染過程中產(chǎn)生的抗病性防御反應(yīng)等都會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。AS是雙子葉植物細(xì)胞壁合成的前體物質(zhì)，它能使農(nóng)桿菌趨化性感染宿主植物受傷部位，誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因的表達(dá)，促進(jìn)T-DNA的加工與轉(zhuǎn)移，從而使農(nóng)桿菌的T-DNA進(jìn)入并整合進(jìn)植物基因組。農(nóng)桿菌Ti或Ri質(zhì)粒的Vir區(qū)編碼產(chǎn)物負(fù)責(zé)接收外界信號(hào)，具有T-DNA的加工、轉(zhuǎn)移及整合等功能，對(duì)菌種的侵染力起決定性作用［20］。在侵染過程中添加AS能顯著提高大豆［21］、紫花苜蓿［22］的遺傳轉(zhuǎn)化效率，但不同物種、植株間最適添加量不盡相同，本研究通過比較不同濃度AS對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，確定150 μmol·L-1的AS對(duì)篩選所得高再生材料的遺傳轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用。Gln作為植物主要的氮轉(zhuǎn)運(yùn)化合物，與植物的抗病性防御反應(yīng)有關(guān)，添加Gln可通過衰減某些病理相關(guān)基因改善土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化效率［23］。Zhang等［24-25］在侵染時(shí)添加了Gln，成功降低了植物組織產(chǎn)生的抗病性防御反應(yīng)，顯著提高了黑麥草和柳枝稷的轉(zhuǎn)化效率。趙振軍等［26］通過添加Gln提高了棉花下胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化效率。本研究比較了3種侵染流程下的‘中苜1號(hào)’轉(zhuǎn)化效率，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化過程中添加150 μmol·L-1AS和300 μmol·L-1Gln中可以有效的提高轉(zhuǎn)化效率。

4 結(jié)論

本研究篩選了‘中苜1號(hào)’高再生植株，測(cè)定潮霉素篩選濃度為10 mg·L-1，探究轉(zhuǎn)化的侵染條件為：以莖頂端嫩葉為外植體，菌液和重懸液中添加150 μmol·L-1的AS，侵染時(shí)添加300 μmol·L-1的Gln，浸入侵染液中真空處理2 min（-0.08 Mp），搖培侵染20 min，晾干后共培養(yǎng)3天。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)92%，轉(zhuǎn)化效率提高至31%，建立了一種高效、穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系，為該品種的遺傳改良和紫花苜蓿的轉(zhuǎn)化方法提供了技術(shù)基礎(chǔ)和參考。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）