基于PCR技術檢測復合四倍體鯽及其親本的分子標記開發(fā)

摘 要：為建立一種可以簡單快速區(qū)分復合四倍體鯽與其雙親的方法，根據(jù)鯽和鯉生長相關基因的差異，進行了DNA分子標記的開發(fā)，最終篩選得到一對引物，利用該分子標記在興國紅鯉和異育銀鯽“中科3號”基因組中分別擴增出1 399 bp和1 125 bp的DNA片段，并且在復合四倍體鯽中同時擴增出這兩個DNA片段。試驗結果顯示，這種分子標記提供了一種能較為快速、高效區(qū)分親本興國紅鯉和異育銀鯽“中科3號”及其子代復合四倍體鯽的方法，可為今后育種研究中苗種或成魚的鑒定提供幫助。

關鍵詞：復合四倍體；分子標記；興國紅鯉；天然三倍體；異精雌核發(fā)育

興國紅鯉（Cyprinus carpio var. singuonensis）具有遺傳性狀穩(wěn)定、抗逆性強的優(yōu)良性狀，常被用于誘導鯽的雌核發(fā)育［1-2］。異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）“中科3號”是中國科學院水生生物研究所培育的異育銀鯽新品種，可以進行雌核發(fā)育生殖，具有生長速度快、寄生蟲發(fā)病率低等優(yōu)點［3］。銀鯽具有獨特的異精雌核生殖方式，因其六倍體的遺傳背景，當異源精子與銀鯽卵子結合時，銀鯽可將異源精子的染色體組、染色體片段或微量遺傳物質(zhì)并入到卵核中協(xié)同發(fā)育［4］。

本研究組在興國紅鯉（父本）誘導異育銀鯽“中科3號”（母本）雌核發(fā)育的子代中獲得了少量的復合四倍體鯽。該魚是由興國紅鯉雄魚精子的1套染色體和三倍體異育銀鯽的3套染色體融合而產(chǎn)生的，類似鯽鯉雜交種。復合四倍體鯽與其雙親在形態(tài)學上不易區(qū)分，而利用細胞學區(qū)分遠緣雜交后代及親本的方法較為繁瑣，目前大多采用流式細胞計數(shù)法與染色體核型特征研究相結合的方法來區(qū)分［5］。分子標記技術具有成本低、操作簡便、檢測高效快捷等特點，正被越來越多的研究人員使用。本研究從生長相關基因入手，利用鯉和鯽在基因組上的差異設計引物，基于聚合酶鏈式反應（PCR）檢測技術探索開發(fā)相關的DNA分子標記，以期建立一種快速區(qū)分興國紅鯉、異育銀鯽“中科3號”及其子代復合四倍體鯽的方法，為下一步的育種研究提供幫助。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗魚均取自上海市水產(chǎn)研究所的養(yǎng)殖池塘，其中異育銀鯽“中科3號”平均體質(zhì)量為0.6 kg，復合四倍體鯽平均體質(zhì)量為0.5 kg，興國紅鯉平均體質(zhì)量為0.75 kg。

1.2 基因組DNA的提取

取試驗魚尾鰭約0.2 g，用體積分數(shù)為95%的無水乙醇固定，保存在-20 ℃冰箱備用。使用天根生化科技（北京）有限公司的海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。使用質(zhì)量濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計Nano-300（杭州奧盛儀器有限公司）檢測DNA質(zhì)量和濃度，并將符合要求的DNA樣本保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.3 引物設計與合成

在NCBI數(shù)據(jù)庫上搜索鯉和鯽的基因組，尋找與鯉和鯽生長相關的3個基因，分別是生長激素受體基因（GHR）、生長激素基因（GH）和胰島素樣生長因子1基因（IGF1）。通過序列比對找到基因組的特異性片段，使用Primer 5.0軟件設計11對引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物的寡核苷酸序列見表1。

1.4 PCR擴增反應體系和程序

PCR反應體系為25 μL，其中包括5 U/μL的DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq 0.13 μL，20 mmol/L的緩沖液10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，100 ng/μL的DNA模版2.5 μL，dNTP混合物（每種dNTP濃度為2.5 mmol/L）2 μL，1 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，滅菌雙蒸水16.87 μL。PCR反應程序為：94 ℃變性35 s；根據(jù)不同的引物，設退火溫度為54.4～59.0 ℃，反應45 s，72 ℃延伸30 s～1.5 min，共31個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應在T100梯度PCR儀（Bio-Rad，美國）上進行。

1.5 DNA擴增片段克隆及序列分析

三倍體銀鯽、復合四倍體鯽和興國紅鯉的PCR產(chǎn)物于質(zhì)量濃度1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，使用天根生化科技（北京）有限公司的通用型DNA純化回收試劑盒將目標條帶割膠回收，將回收的擴增片段與載體pGEM-T Easy載體系統(tǒng)［生工生物工程（上海）股份有限公司］連接，熱激轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞［生工生物工程（上海）股份有限公司］，涂布到含有LB/Amp/IPTG/X-Gal的平板上，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)，篩選出陽性克隆并進行LB液體培養(yǎng)，通過PCR菌液檢測，選取陽性克隆序列送至上海邁浦生物科技有限公司測序，測序結果用CLUSTALX軟件進行比對分析。

2 結果

2.1 DNA的制備

利用DNA提取試劑盒將樣本的基因組提取后，采用分光光度計測量濃度和曲線，再經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，DNA完整（見圖1），可以用于下一步試驗。

2.2 PCR擴增

通過對11對引物的篩選，最終得到了1對分子標記，即GHR-1F、GHR-1R，退火溫度為56 ℃，延伸時間為90 s。由圖2可見，特異性分子標記引物在興國紅鯉、復合四倍體鯽和三倍體鯽的PCR產(chǎn)物在凝膠電泳圖中條帶差異較明顯，其中，興國紅鯉擴增出1條1 400 bp左右的主要條帶；復合四倍體鯽擴增出2條主要條帶，小條帶為1 000 bp左右，大條帶為1 200 bp左右；三倍體鯽擴增出1條1 000 bp左右的主要條帶。

2.3 擴增序列的比對分析

將陽性克隆利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測（見圖3），挑選條帶單一、亮度較高的樣本進行測序。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，復合四倍體鯽擴增的2條主要條帶中，小條帶4J-XIAO為1 125 bp，大條帶4J-DA為1 399 bp；興國紅鯉擴增片段LI條帶大小為1 399 bp；三倍體鯽擴增片段JI條帶大小為1 125 bp（見圖4）。序列比對結果顯示，復合四倍體鯽擴增出的2條條帶的DNA序列分別與興國紅鯉、三倍體銀鯽的DNA序列相同。這表明復合四倍體鯽是興國紅鯉和三倍體銀鯽的子代，并且擁有興國紅鯉的一部分遺傳物質(zhì)，含有鯉魚生長相關的基因序列片段。

3 討論

3.1 DNA分子標記的應用

傳統(tǒng)的選擇育種方法在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中發(fā)揮了巨大的作用，但采用傳統(tǒng)方法育種周期往往很長，DNA分子標記技術的應用大大縮短了選擇育種的周期，并且不受生物發(fā)育階段、年齡等的影響，可重復性強［6］。DNA分子標記在水產(chǎn)動物遺傳育種的群體遺傳多樣性、親緣關系、分子標記輔助育種以及物種鑒定等方面應用廣泛。王青云等［7］基于RAD（restriction association site DNA）簡化基因組測序進行了瓦氏黃顙魚（Pelteobagrus vachellii）簡單重復序列（SSR）標記的開發(fā)，用于群體的遺傳多樣性、親緣關系及分子標記輔助育種等方面的研究。本研究組目前在分子標記方面也做了較多的研究應用工作，例如利用性別特異性分子標記進行遺傳性別鑒定，輔助培育新品種，進行了超雄羅非魚［8］、超雄黃顙魚［9］的繁殖育種，還開發(fā)了耐鹽性狀相關的分子標記，用于耐鹽羅非魚的育種［10］。

鞏高瑞等［11］根據(jù)內(nèi)含子序列的差異設計引物，采用通過PCR技術在黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交種中擴增出不同的條帶，有效區(qū)分了上述三者。劉敏等［12］建立了基于RAPD（隨機擴增多態(tài)DNA）技術開發(fā)SCAR（特性性片段擴增區(qū)域）分子標記來鑒別異精雌核發(fā)育草魚與普通草魚的方法。顏金鵬等［13］研究發(fā)現(xiàn)，利用PCR技術擴增出可以區(qū)分異源四倍體鯽鯉不同雌核發(fā)育群體的DNA片段。本研究通過比較鯽和鯉生長相關基因的差異，尋找差異位點，設計了多對引物，最終開發(fā)出一個生長相關的DNA分子標記，基于PCR技術進行擴增可以快速區(qū)分親本興國紅鯉和異育銀鯽“中科3號”及其子代復合四倍體鯽，為今后育種工作中苗種或成魚的鑒定提供了一種高效、低成本的方法。與本研究結果類似，簡林江等［14］利用SSR標記分別在雙親大黃魚、魚狀黃姑魚及其雜交子代中進行擴增，發(fā)現(xiàn)其雜交子代同時含有雙親的特異性條帶，通過這些條帶可以快速鑒定雙親和雜交種。

3.2 異精雌核發(fā)育

蔣一珪等［15］在1983年通過試驗發(fā)現(xiàn)，異源精子對方正銀鯽雌核發(fā)育子代有生物學效應，因此將這種雌核發(fā)育稱為異精雌核發(fā)育，子代簡稱為異育銀鯽，由此開啟了魚類遠緣雜交的新途徑。

本試驗中的復合四倍體鯽是在利用興國紅鯉精子刺激異育銀鯽“中科3號”雌核發(fā)育的子代中產(chǎn)生的，從外觀來看，復合四倍體鯽出現(xiàn)了父本的性狀，其體形較大，有短須，推測興國紅鯉精子與三倍體銀鯽的卵子發(fā)生了遺傳物質(zhì)的交流，這應該是異精效應作用的結果［16］。

通過異精雌核生殖發(fā)育手段可以獲取潛在的優(yōu)良性狀來得到優(yōu)良苗種。張慶飛等［17］的研究發(fā)現(xiàn)，彭澤鯽♀×興國紅鯉♂四倍體的子代相對于彭澤鯽雌核發(fā)育的子代表現(xiàn)出較好的生長性能。桂建芳等［18］在人工繁育的高體型異育銀鯽群體中發(fā)現(xiàn)了16尾人工復合四倍體異育銀鯽，其生長速度較普通異育銀鯽快，但是復合四倍體異育銀鯽個體間的生長有差異，原因可能是鯉魚精子經(jīng)過減數(shù)分裂，發(fā)生了交換和重組，存在遺傳差異。本研究在復合四倍體鯽中同時擴增出與興國紅鯉和異育銀鯽生長相關的基因片段，推測在異精雌核發(fā)育過程中有少量的父本興國紅鯉精子的染色體與母本異育銀鯽卵子的染色體發(fā)生了融合，從而產(chǎn)生了復合四倍體鯽，從分子水平上表明復合四倍體鯽獲取了鯉魚生長方面的優(yōu)良品質(zhì)，因此其體形較大，生長速度較快。目前雜交育種方法運用廣泛，但是缺乏系統(tǒng)的理論與技術支撐，王石等［19］探索出了遠緣雜交的一步法和多步法育種技術，對于魚類雜交育種的發(fā)展具有重要意義。

目前在銀鯽單性生殖機制的研究方面已取得一些重要突破，全基因組測序首次揭示，單性雌核生殖六倍體銀鯽是雙三倍體，闡述了銀鯽單性生殖成功的演化機制［20-22］。石倩等［23］研究發(fā)現(xiàn)，超數(shù)微小染色體在銀鯽單性生殖演化中可能發(fā)揮了作用，這為研究超數(shù)微小染色體在單性生物演化中的作用提供了新的思路，對于未來單性生物的研究具有重要意義。

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Development of molecular markers for detecting multiple tetraploid allogynogenetic crucian carp and its parentage based on PCR technology

GU Nan， LI Yongqiang， LIU Feng

（Shanghai Fisheries Research Institute，Shanghai Fisheries Technical Extension Station，Shanghai 200433，China）

Abstract：" In order to establish a simple and rapid method to distinguish between multiple tetraploid allogynogenetic crucian carp and its parentage，DNA molecular markers were developed and a pair of primers was screened based on the difference of growth-related genes between Carassius auratus and Cyprinus carpio sequences.The DNA fragments of 1 399 bp and 1 125 bp were amplified in Xingguo red carp（C. carpio var. singuonensis） and C. auratus gibelio “CASⅢ”，respectively.Moreover，both 1 399 bp and 1 125 bp were amplified in multiple tetraploid allogynogenetic crucian carp.In summary，this molecular marker provides a relatively fast and efficient method for distinguishing between C. carpio var. singuonensis，C. auratus gibelio “CASⅢ” and multiple tetraploid allogynogenetic crucian carp，and also provides assistance for the identification of fry or adult fish in future breeding research.

Key words： multiple tetraploid; molecular marker; Cyprinus carpio var. singuonensis; natural triploid; allogynogenesis