水稻核糖體失活蛋白家族基因OsRIP8的生物信息學(xué)與功能分析

摘要：核糖體失活蛋白（RIPs）是一種能使真核細胞核糖體功能被抑制的毒蛋白。OsRIP8是屬于該家族的一個功能未知基因。為研究該基因生物學(xué)功能，通過數(shù)據(jù)庫對其進行生物信息學(xué)分析，利用qRT-PCR驗證其表達模式，同時構(gòu)建OsRIP8-RNAi 干涉載體并利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻，采用PCR技術(shù)鑒定出轉(zhuǎn)基因陽性植株，分析陽性植株的表達和農(nóng)藝性狀，初步揭示該基因的功能。結(jié)果表明，水稻OsRIP8蛋白為不穩(wěn)定親水蛋白，不含信號肽及完整的跨膜結(jié)構(gòu)域，蛋白結(jié)構(gòu)以α螺旋為主；在OsRIP8基因啟動子區(qū)域存在著與植物生長發(fā)育、生物與非生物脅迫以及植物激素響應(yīng)有關(guān)的元件；OsRIP8基因的共表達基因富集到多種大分子的生物合成與蛋白代謝等途徑；qRT-PCR分析結(jié)果表明，OsRIP8基因在發(fā)育的小穗及抽穗前1 d的花藥中優(yōu)先表達；RNAi干涉后OsRIP8基因的表達下調(diào)造成植株花粉育性和結(jié)實率顯著降低。暗示該基因?qū)λ拘∷氲陌l(fā)育具有重要作用，可能參與調(diào)控花粉發(fā)育過程。

關(guān)鍵詞：水稻；核糖體失活蛋白；生物信息學(xué)分析；功能分析；基因表達

中圖分類號：S511.01" 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）04-0071-09

收稿日期：2023-04-12

基金項目：貴州省科學(xué)技術(shù)基金（編號：黔科合基礎(chǔ)［2020］1Z020）；貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科技基金（編號：黔農(nóng)科院青年基金［2019］01號）；貴州省科技計劃（編號：黔科合支撐［2022］重點028號）；貴州省水稻研究所青年基金（編號：黔水稻所青年基金［2021］018號）。

作者簡介：徐 婭（1991—），女，貴州貴陽人，碩士，助理研究員，研究方向為水稻生殖發(fā)育生物學(xué)。E-mail：xu_ya_1991@163.com。

通信作者：李樹杏，碩士，正高級農(nóng)藝師，研究方向為水稻栽培生理學(xué)。E-mail：24406882@qq.com。

核糖體失活蛋白（RIPs）是一類通過去除核糖體RNA的腺嘌呤殘基從而使核糖體結(jié)構(gòu)被破壞無法正常結(jié)合蛋白質(zhì)合成時的延伸因子，進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物合成受抑制的一類毒蛋白，大部分存在于植物體中［1］。根據(jù)核糖體失活蛋白的大小、結(jié)構(gòu)及組成，一般將RIPs分為3個類型［2］。第Ⅰ類分子量約為30 ku，為單肽鏈，具有RNA N-糖苷酶活性，該類型分布最為廣泛，但由于缺少與細胞結(jié)合的配體B鏈而不能進入細胞內(nèi)，對無細胞結(jié)構(gòu)系統(tǒng)的蛋白合成有抑制作用，對完整細胞的毒性很?。?］。第Ⅱ類分子量約為60 ku，由A鏈和B鏈組成，其中A鏈與Ⅰ型RIPs的多肽鏈相似，B鏈具有凝集素（lectin）活性，能識別并結(jié)合細胞膜上的特異受體［4］。第Ⅲ類RIPs是先合成無活性前體，經(jīng)酶解加工后產(chǎn)生2個大小分別為16.5、8.5 ku的亞基，該類型RIPs較為少見，僅在玉米和大麥中被鑒定出來［5-6］。諸多研究發(fā)現(xiàn)，RIPs對病毒、真菌和昆蟲均能產(chǎn)生抗性［7-10］，這為作物病蟲害防治提供了新的解決思路，故而RIPs的功能研究受到植物抗病蟲害領(lǐng)域研究者的普遍關(guān)注。

早期已報道的RIPs多以煙草為受體植物進行試驗，Huang等從麻瘋樹幼苗中分離出核糖體失活蛋白（curcin 2）的cDNA，將其轉(zhuǎn)入煙草后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株立枯絲核菌的抗性增加顯著［11］；Krishnan等將來自于藥用植物栝樓的天花粉蛋白（TCS）重組后轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草植株對于黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒（TMV）的感染較對照有所延遲且癥狀較輕［12］。后來轉(zhuǎn)RIPs基因的受體植物拓展至水稻等糧食作物上，例如在Qian等的研究中，在水稻中異源表達苦瓜素（α-MC）可有效防止轉(zhuǎn)基因水稻中稻瘟病的發(fā)生［13］；Kim等認(rèn)為幾丁質(zhì)酶與核糖體失活蛋白具有很強的協(xié)同作用，他們將水稻幾丁質(zhì)酶基因同玉米核糖體失活蛋白基因協(xié)同在轉(zhuǎn)基因水稻中表達，最終獲得紋枯病抗性植株［14］。這些研究均圍繞外源基因展開。近些年有幾個水稻自身RIP基因被克隆出來，這些RIPs在體外試驗以及轉(zhuǎn)基因植株中對病蟲害都具有一定的抗性。在水稻中過表達水稻RIP基因OsRIP8后，水稻對干旱和鹽脅迫的耐受性比野生型顯著提高［15］；de Zaeytijd等發(fā)現(xiàn)在被褐飛虱侵染的水稻植株中，OsRIP1的表達被高度誘導(dǎo)，其重組蛋白對褐飛虱有一定的毒力，能在體外滅活昆蟲核糖體［16］；Wytynck等構(gòu)建了過表達OsRIP1以及nuRIP的轉(zhuǎn)基因株系，溫室條件下過表達nuRIP的植株莖長顯著縮短。此外，還研究了轉(zhuǎn)基因幼苗對干旱、鹽、脫落酸和茉莉酸甲酯處理的響應(yīng)性能，結(jié)果表明，這2種RIP均可影響茉莉酸甲酯介導(dǎo)的脅迫反應(yīng)［17］。Jiang等和Wytynck等2個團隊先后鑒定了水稻全基因組中的核糖體失活蛋白［18-19］，絕大部分未見功能報道。

本研究發(fā)現(xiàn)水稻RIPs家族基因OsRIP8在水稻小穗中高表達，暗示其對于水稻生殖發(fā)育具有重要作用。采用生物信息學(xué)的方法對水稻OsRIP8蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和基因表達模式等進行分析，構(gòu)建OsRIP8干涉載體并轉(zhuǎn)化水稻獲得表達量下調(diào)的轉(zhuǎn)基因植株，對轉(zhuǎn)基因植株及野生型植株農(nóng)藝性狀進行觀察與統(tǒng)計對比，初步揭示OsRIP8在水稻中的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試水稻品種 本研究采用的水稻品種是粳稻中花11號（Zhonghua11，ZH11），于2019年種植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田。

1.1.2 菌株與載體 本研究所用菌株有克隆菌株大腸桿菌DH5α，水稻遺傳轉(zhuǎn)化菌株農(nóng)桿菌EHA105。常用載體有T載體pMD18-T（TaKaRa公司）；RNAi載體為pDS1301。

1.1.3 試劑與儀器 抽提RNA所用的RNAiso、RNase-free DNaseⅠ、擴增基因序列所用LA Taq酶及熒光定量所用 的SYBR Premix EX Taq Master Mix、 ROX Reference DyeⅡ均購自TaKaRa公司；消化30 min去除DNA。反轉(zhuǎn)錄使用的酶M-MLV購自Promega公司，引物為oligo（dT）。所用儀器是ABI StepOneTM 實時熒光定量PCR儀。

1.2 生物信息學(xué)分析

1.2.1 水稻 OsRIP8蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析 水稻OsRIP8蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析通過 Protparam （https：//web.expasy.org/protparam/）所提供的蛋白序列分析工具，對OsRIP8蛋白的理化性質(zhì)（分子量、理論pI、正負(fù)電荷殘基總數(shù)及半衰期等）進行預(yù)測與分析。利用 ProtScale （https：//web.expasy.org/protscale/）預(yù)測疏水性/親水性，用SignalP （https：//services.healthtech.dtu.dk/service/Singal P- 3.01）對蛋白質(zhì)的信號肽進行預(yù)測，用TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）預(yù)測其跨膜結(jié)構(gòu)域，用NetPhos（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）預(yù)測磷酸化位點。通過SMART工具 （http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析 OsRIP8蛋白的結(jié)構(gòu)域，利用在線網(wǎng)站 PSIPRED （http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）對OsRIP8蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）同源建模網(wǎng)站預(yù)測 OsRIP8蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.2.2 水稻OsRIP8基因共表達基因的GO富集和KEGG富集分析 通過IC4R數(shù)據(jù)庫（http：//expression.ic4r.org/co-search）中的共表達數(shù)據(jù)，篩選皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient，PCC）大于0.8的基因作為OsRIP8基因的共表達基因。然后通過agriGO 網(wǎng)站（http：//systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/）以及Kobas網(wǎng)站（http：//kobas .cbi.pku.edu.cn/genelist/）對這些基因進行GO富集和KEGG富集分析。

1.2.3 水稻OsRIP8基因表達分析與啟動子順式作用元件分析 OsRIP8基因在明恢63（MH63）各發(fā)育階段的表達數(shù)據(jù)從CREP數(shù)據(jù)庫獲得（http：//crep.ncpgr.cn/）。選取OsRIP8基因起始密碼子ATG上游2 kb的DNA序列，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站進行OsRIP8啟動子順式作用元件分析。

1.3 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR檢測

水稻樣品RNA抽提采用TRIzol抽提試劑盒（Invitrogen，USA）進行，樣品（新鮮葉片或者稻穗等）經(jīng)液氮充分研磨，具體操作步驟詳見試劑盒說明書。提取完成后自然風(fēng)干，加入滅菌的DEPC水20 μL溶解，于Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，美國）檢測RNA質(zhì)量，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取抽提好的RNA 5 μL作為模板，加入1 μL DNase 和1 μL DNase Buffer，混勻，于37 ℃消化 30 min，以去除RNA樣品中的DNA污染。RNA的反轉(zhuǎn)錄采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行操作，具體操作詳見說明書。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RNAi轉(zhuǎn)基因植株的表達量檢測以及基因表達譜檢測，引物為QRIP8-F/R（表1），均采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀進行檢測分析，循環(huán)數(shù)設(shè)為40個，具體分析操作參照2×SYBR Premix EX Taq（TaKaRa）試劑盒以及儀器提供的標(biāo)準(zhǔn)定量PCR分析方法。每個樣品3次重復(fù)，以Ubiquitin作為內(nèi)參基因，引物信息見表1。

1.4 OsRIP8-RNAi干涉載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

OsRIP8-RNAi干涉轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建：采用pDS1301，根據(jù)基因的編碼序列（CDS）設(shè)計擴增產(chǎn)物為447 bp的特異引物IRIP8-F/R，見表1。特異片段經(jīng)PCR擴增后連T載體，測序確定片段正確后，釆用雙酶切獲得目的片段，并分別連到pDS1301的多克隆位點。

采用CaCl2法將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌菌株EHA105中，挑取陽性農(nóng)桿菌菌液保存?zhèn)溆?。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻愈傷遺傳轉(zhuǎn)化受體材料為ZH11，具體操作流程參照Wu等建立的高效水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系［20］。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株DNA提取、PCR陽性檢測

水稻樣品DNA提取采用改進的CTAB法（小樣快速制備法），具體操作步驟參照Hills 等的方法［21］，沉淀自然風(fēng)干后，加30～50 μL ddH2O溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RNAi轉(zhuǎn)基因植株通過PCR進行陽性檢測，以潮霉素引物Hpt-F/R對RNAi轉(zhuǎn)基因植株進行PCR陽性檢測（表1）。選取陽性植株進行加代種植以及后續(xù)試驗。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定及農(nóng)藝性狀統(tǒng)計

對RNAi轉(zhuǎn)基因植株以ZH11為對照，觀察記錄突變體和RNAi轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)藝性狀，包括結(jié)實率、萌發(fā)率、花粉育性等。收取種子后，對結(jié)實率等農(nóng)藝性狀進行考察分析，每個家系選取20個單株進行考種，采用Excel 2013進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異顯著性分析。

使用1% I2-KI溶液檢測花粉育性（即淀粉積累）。材料取自RNAi轉(zhuǎn)基因植株和野生型，每個家系取25個單株，每個單株取3個不同稻穗上的3朵小花。將碘液滴加在玻片上，然后將花粉粒剝離并置于滴有碘液的玻片上，用鑷子擠壓，使花粉游離在玻片上，染色2～3 min后蓋上蓋玻片鏡檢觀察。同樣剝?nèi)〖磳㈤_放的小花，放置于滴有萌發(fā)液的載玻片上進行萌發(fā)，取樣數(shù)量、方法與碘染相同。萌發(fā)環(huán)境濕度需大于90%，溫度為35 ℃。制好的片子用光學(xué)顯微鏡（BX53，Olympus，日本）觀察，用SPOT FLEXTM CCD（Diagnostic Instrument，美國）進行顯微攝影，獲得的花粉育性數(shù)據(jù)采用Excel 2013統(tǒng)計并進行差異顯著性分析。

1.7 水稻OsRIP8基因的克隆

根據(jù)OsRIP8的CDS加入酶切位點及保護堿基設(shè)計克隆引物CRIP8-F/R（表1），以中花11的 cDNA 為模板進行擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用回收試劑盒回收后進行TA克隆，轉(zhuǎn)化后對菌液進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻OsRIP8蛋白的性質(zhì)

水稻OsRIP8基因的基因組序列全長5 387 bp，包括4個內(nèi)含子、5個外顯子。CDS 全長1 062 bp，編碼353個氨基酸。OsRIP8蛋白分子量為 39.621 7 ku，理論pI為8.7，負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為43，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為47，分子式：C1 764H2 820N486O517S16，總原子數(shù)為5 603，脂肪酸指數(shù)為90.88，不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）為 41，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。OsRIP8蛋白磷酸化位點有35個，包括 Ser 17個、Thr 12個和 Tyr 6個（圖1-A）。信號肽平均分值（S值）為 0.004 7，說明該蛋白不含有信號肽（圖1-B）。平均親水性（GRAVY）為 -0.256，為親水蛋白（圖1-C）。該蛋白不存在完整的跨膜結(jié)構(gòu)（圖1-D）。

2.2 水稻OsRIP8蛋白的結(jié)構(gòu)

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，OsRIP8蛋白有3種二級結(jié)構(gòu)，其中α螺旋有167個氨基酸殘基參與，占 47.31%；延伸鏈有45個氨基酸殘基參與，占12.75%；無規(guī)則卷曲有141個氨基酸殘基參與，占39.94% （圖2-A）。從三級結(jié)構(gòu)可以看出，水稻OsRIP8蛋白的三級結(jié)構(gòu)以α螺旋為主（圖2-B）。

2.3 水稻OsRIP8基因共表達基因的GO富集和KEGG富集

為探索OsRIP8可能的調(diào)控機制，在IC4R數(shù)據(jù)庫中檢索與其表達相關(guān)系數(shù)超過0.8的基因，得到共表達基因609個。共表達基因功能注釋主要富集在大分子分解代謝過程（GO：0043632）、蛋白質(zhì)氨基酸去磷酸化（GO：0006470）、調(diào)節(jié)細胞蛋白質(zhì)代謝過程（GO：0032268）、翻譯調(diào)控（GO：0006417）、基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（GO：0010608）、細胞大分子分解代謝過程（GO：0044265）、絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性（GO：0004722）、磷酸蛋白磷酸酶活性（GO：0004721）、水解酶活性（GO：0016799）、磷酸酯水解酶活性（GO：0042578）（圖3-A）。KEGG 富集40個代謝通路，包括泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解，甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸代謝，異喹啉生物堿的生物合成，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工，莨菪烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，鞘糖脂生物合成，糖胺聚糖降解，生物素代謝，角質(zhì)、蠟質(zhì)的生物合成，氮代謝，脂肪酸合成與代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等多種物質(zhì)代謝過程（圖3-B）。

2.4 水稻OsRIP8基因啟動子元件

在水稻OsRIP8基因啟動子區(qū)域，除存在RNA聚合酶結(jié)合位點 TATA-box、CAAT-box 等基本調(diào)控元件外，還存在與植物生長發(fā)育相關(guān)的其他元件，如胚乳特異性元件、分生組織特異性元件，與脅迫相關(guān)的干旱誘導(dǎo)元件、光誘導(dǎo)元件，還有一些激素響應(yīng)元件，如生長素響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件（表2）。從OsRIP8基因啟動子區(qū)域具有的順式作用元件種類和數(shù)量推測，OsRIP8基因的表達可能受光、激素、脅迫的誘導(dǎo)，且參與植物器官的生長與發(fā)育。

2.5 水稻OsRIP8基因的克隆

從粳稻品種中花11號中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用于基因克隆。設(shè)計克隆引物，以cDNA為模板對OsRIP8進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，獲得與預(yù)期大?。? 059 bp） 一致的特異性條帶。純化回收PCR 產(chǎn)物進行TA 克?。▓D4），挑選單菌落測序，測序結(jié)果與密歇根州立大學(xué)水稻基因組注釋項目（MSU-RGAP）公布的OsRIP8的 CDS 完全一致，確定擴增產(chǎn)物就是目的基因OsRIP8。

2.6 水稻OsRIP8基因的表達譜驗證

以芯片表達數(shù)據(jù)分析結(jié)果來看，OsRIP8表現(xiàn)為幼穗優(yōu)先表達模式（圖5-A）。為驗證其表達模式，取抽穗前1 d的根、莖、劍葉；P3～P8期（1 mm長到抽穗前）的小穗；抽穗前1 d的花藥；開花前1 d的內(nèi)外稃；開花前1 d除去花藥的其他組織。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）進行表達量檢測，結(jié)果表明OsRIP8在P6（花粉母細胞減數(shù)分裂期）到P8（花粉完熟期）期的小穗以及開花前1 d的花藥中表達量較高（圖5-B），和芯片數(shù)據(jù)一致。

2.7 OsRIP8-RNAi T1代轉(zhuǎn)基因植株的獲得和表型分析

通過Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）尋找OsRIP8基因的特異片段， 以此設(shè)計OsRIP8基因的RNAi引物（表1），以中花11（ZH11）的P6期小穗cDNA為模板，PCR擴增出相應(yīng)片段，大小為447 bp，采用SpeⅠ/SacⅠ和KpnⅠ/BamHⅠ雙酶切的方法將獲得的片段連接到RNAi載體pDS1301上，構(gòu)建好的RNAi載體采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化ZH11種子誘導(dǎo)的愈傷組織，得到OsRIP8的RNAi轉(zhuǎn)基因植株11株。通過潮霉素進行篩選，獲得獨立的T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株9株。熒光定量PCR檢測其干涉效率。最后，選擇轉(zhuǎn)基因陽性單株中表達量低、中、高3個層次的單株進行傳代種植（圖6-A）。

選取T0代株系中的RIP8-2、RIP8-8、RIP8-10在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗基地進行加代種植，對T1代不同株系進行陽性檢測（圖6-B），對純合家系進行農(nóng)藝性狀的考察。發(fā)現(xiàn)OsRIP8-RNAi T1代轉(zhuǎn)基因植株在營養(yǎng)生長階段與野生型相比無明顯異常，而碘染的結(jié)果表明其成熟花粉育性與野生型相比明顯下降，在成熟花粉萌發(fā)正常的情況下（圖 6-C至圖6-F），其結(jié)實率與對照相比極顯著降低（表3）。

3 討論

盡管關(guān)于RIPs的研究早在20世紀(jì)90年代就有報道，當(dāng)時大多是分離出表達量很高的一些毒蛋白例如蓖麻毒蛋白［22］，后來隨著全基因組測序和生物信

息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，很多無法被直接純化的RIPs被鑒定出來，其中就包括水稻全基因組中的RIPs［18-19］。水稻中OsRIP1、OsRIP18和nuRIP等3個基因曾有功能分析報道，除此之外絕大多數(shù)水稻RIPs基因的功能仍不清楚。本研究在對水稻RIPs基因家族進行表達分析時發(fā)現(xiàn)該家族基因OsRIP8在水稻幼穗中優(yōu)先表達，對其進行進一步的生物信息學(xué)分析和初步的功能分析。結(jié)果表明，OsRIP8在花粉母細胞減數(shù)分裂期的小穗中表達量最高，該基因表達下調(diào)導(dǎo)致花粉育性降低，結(jié)實率下降，推測該基因參與水稻生殖發(fā)育。

OsRIP8蛋白不含信號肽，這種沒有信號肽的RIPs基因很可能定位于植物核糖體附近的細胞質(zhì)中［23］。OsRIP8蛋白屬于親水蛋白且不含完整的跨膜結(jié)構(gòu)域，推測其不參與物質(zhì)的跨膜運輸。GO及KEGG富集分析結(jié)果表明，OsRIP8的共表達基因主要富集在大分子分解代謝、蛋白質(zhì)代謝過程的調(diào)節(jié)，參與調(diào)控磷酸酶、磷酸酯水解酶活性，參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯調(diào)控；主要富集的代謝通路包含蛋白質(zhì)水解、各種氨基酸代謝、各類生物堿、鞘糖脂、角質(zhì)和蠟質(zhì)的生物合成。推測OsRIP8共表達基因可能參與翻譯和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及酶活調(diào)節(jié)來控制各類大分子的代謝及生物合成。在水稻OsRIP8基因啟動子區(qū)域包括與植物生長發(fā)育有關(guān)的元件，如胚乳特異性元件、分生組織特異性元件、晝夜節(jié)律控制元件；與脅迫有關(guān)的干旱誘導(dǎo)元件、光誘導(dǎo)元件；還有一些激素響應(yīng)元件，如生長素響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、赤霉酸響應(yīng)元件等。赤霉素和光周期是植物花期調(diào)控中的2條通路［24］，結(jié)合OsRIP8基因表達模式，推測該基因受光、激素、脅迫的誘導(dǎo)，參與植物花期調(diào)控及植物的生長與發(fā)育。OsRIP8-RNAi T1代株系可育花粉比例在57.25%～84.63%之間且萌發(fā)正常，但相應(yīng)的結(jié)實率卻在36.88%～52.25%之間，且在其啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了和胚乳發(fā)育有關(guān)的元件GCN4-motif及O2-site，因此推測OsRIP8基因除了影響花粉發(fā)育外可能也參與雌配子或者胚乳的發(fā)育。GCN4-motif是一種在谷作物種子貯藏蛋白啟動子中高度保守的順式元件，對控制醇溶蛋白和谷蛋白的胚乳特異性表達起著核心作用［25-26］。本研究只涉及試驗材料的創(chuàng)建和初步的表型觀察，該基因在水稻生殖發(fā)育中的具體功能和機制還有賴于更多遺傳材料的創(chuàng)建和進一步研究。下一步將補充CRISPR/cas9突變體植株及超表達植株，對這些轉(zhuǎn)基因植株在小穗和胚乳發(fā)育時期分別進行干旱、光和激素誘導(dǎo)處理，對其花粉、胚囊和胚乳發(fā)育及花期等性狀進行對比，進一步明確OsRIP8在水稻生殖發(fā)育中的功能。

4 結(jié)論

OsRIP8基因在花粉母細胞減數(shù)分裂期到花粉完熟期的小穗中高表達；OsRIP8的表達下調(diào)造成植株花粉育性和結(jié)實率降低。暗示該基因?qū)λ拘∷氲陌l(fā)育具有重要作用，可能受光、激素、脅迫的誘導(dǎo)參與調(diào)控水稻生殖發(fā)育過程。

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