10個(gè)抗稻瘟病基因在黃淮稻區(qū)粳稻品種(系)中的分布

摘 "要：利用Pi5、Pii、Pib、Pita、Pita2、Pish、Pi54、Pia、Pizt、Pikm 10個(gè)抗瘟基因的分子標(biāo)記，對94份黃淮稻區(qū)粳稻品種（系）進(jìn)行了分子檢測。結(jié)果表明，10個(gè)基因在供試品種中的分布頻率分別為15.96%、15.96%、87.23%、37.23%、73.40%、85.11%、59.57%、32.98%、29.79%、37.23%。在供試品種中，檢測出5個(gè)抗瘟基因的品種最多，占供試品種總數(shù)的35.1%；檢測出4、6、2、3、7、8、1個(gè)抗瘟基因的品種分別有23、19、6、6、4、2、1個(gè)。本研究初步明確了10個(gè)抗瘟基因在94份黃淮稻區(qū)水稻品種（系）的分布情況，為抗稻瘟病輔助育種提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃淮稻區(qū)；抗稻瘟病基因；分子標(biāo)記；HRM

中圖分類號：S511.2+2 " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1673-6737（2024）04-0001-09

Distribution of 10 Blast Resistant Genes in Japonica Varieties（Lines） of Huang-huai Region

CHEN Feng1 ， FANG Wen-wen1 ， LIU Wei2 ， Wang Sha-sha3 ， WANG Hai-feng1 ， XU Jian-di1 ，

ZHU Wen-yin1 ， JIANG Ming-song1 ， ZHANG Hua4 ， ZHANG Shi-yong1*

（1 Institute of Wetland Agriculture and Ecology， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China;

2 Linyi Jinqiudaliang Agricultural Technology Co.， Ltd.， Linyi Shandong 276000， China;

3 Dongying Yibang Agricultural Technology Development Co.， Ltd.， Dongying，257000，China;

4 Tancheng Jinghua Seed Industry Co.， Ltd.， Tancheng Shandong 276100， China）

Abstract： Molecular detection was conducted on 94 japonica rice varieties（lines） from the Huanghuai region using molecular markers of 10 blast resistance genes， including Pi5， Pii， Pib， Pita， Pita2， Pish， Pi54， Pia， Piztand Pikm. The results showed that the distribution frequencies of 10 genes in the tested varieties were 15.96%， 15.96%， 87.23%， 37.23%， 73.40%， 85.11%， 59.57%， 32.98%， 29.79% and 37.23% respectively. Among the tested varieties， the variety with the highest detection of 5 blast resistance genes accounted for 35.1% of the total number of tested varieties; There are 23， 19， 6， 6， 4， 2， 3， 7， 8， and 1 varieties with blast resistance genes detected， respectively. This study preliminarily identified the distribution of 10 blast resistant genes in 94 rice varieties（lines） from the Huanghuai region， providing a reference basis for blast resistant assisted breeding.

Key words： Huanghuai district; Resistance genes to rice blast disease; Molecular markers; HRM

水稻是我國重要的糧食作物，近一半的人口以稻米為主食。稻瘟病是水稻生產(chǎn)上主要病害，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。利用廣譜抗稻瘟病基因培育抗病品種，具有重要意義[2]。20世紀(jì)60年代中期，日本率先開展了抗稻瘟病基因研究工作，鑒定了最初的8個(gè)抗性位點(diǎn)上的14個(gè)基因，并建立了一套抗稻瘟病基因分析用的鑒別體系[3]。截至2019年，已報(bào)道了100余個(gè)抗稻瘟病基因位點(diǎn)，這些基因成簇地分布于除第3染色體外的所有水稻染色體上，其中，Pb1，Pia，Pib等37個(gè)基因已被成功克隆[4]。

Pi5定位于第9染色體上S04G03和C1454之間的170kb區(qū)間內(nèi)，原始抗性供體為RIL260[5]。Pib，來自品種“BL1”，位于2號染色體長臂近末端區(qū)域，與RFLP標(biāo)記RZ123、C379和C2782B等連鎖，屬于“NBS-LRR”類抗病基因[6]。Pi-ta基因位于第12染色體靠近著絲點(diǎn)附近的區(qū)域，定位于BAC克隆BAC142E8[7]。Pi-ta2是Pi-ta的等位基因，且抗譜比Pi-ta廣[8]。Pish位于第1染色體，表現(xiàn)出葉瘟抗性[9]。Pi54位于水稻第11染色體，是一個(gè)NBS-LRR型的顯性抗稻瘟病基因[10]。Pia位于第11染色體，由兩個(gè)相鄰的NBS-LRR基因構(gòu)成[11]。Pizt位于第6染色體短臂，是一個(gè)具有廣譜抗性的基因，該基因所在染色體區(qū)段包含多個(gè)對不同稻瘟病生理小種具有抗性的等位基因，如Pi9、Pi-z、Pi-2以及感病等位基因[12]。Pikm是稻瘟病抗性位點(diǎn)Pik上的一個(gè)主效抗病等位基因，定位于11號染色體上，由兩個(gè)緊密連鎖的具有獨(dú)立功能NBS-LRR類基因（Pikm1-TS和Pikm2-TS）組成，對病菌具有較寬的抗譜[13]。Pi-i與Pi5位于第9染色體的同一位置，且抗譜一致，Pi-i介導(dǎo)的抗性需要乙烯合成過程中產(chǎn)生的氰化物的參與[14]。

楊林浩等利用Pi5、Pii、Pib等16個(gè)抗瘟基因特異性分子標(biāo)記對68份吉林省主栽水稻品種進(jìn)行了基因型鑒定[15]。房文文等利用Pita、Pita2、Pia等12個(gè)抗瘟基因的功能標(biāo)記，對78個(gè)山東省地方水稻品種進(jìn)行了分子檢測[16]。黃淮稻區(qū)常年水稻種植面積約133.3萬hm2，是我國重要的優(yōu)質(zhì)粳稻產(chǎn)區(qū)，抗瘟基因的鑒定是培育抗稻瘟病品種的基礎(chǔ)性工作。本研究利用Pi5、Pii、Pib等10個(gè)抗瘟基因的功能標(biāo)記，對94份黃淮稻區(qū)水稻品種（系）進(jìn)行了分子檢測，可為黃淮稻區(qū)抗稻瘟病分子標(biāo)記輔助育種提供參考依據(jù)。

1 "材料與方法

1.1 "試驗(yàn)材料

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所培育及從黃淮稻區(qū)引進(jìn)品種（系）共94份，品種名稱見表1。2022年種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濕地所濟(jì)寧試驗(yàn)基地，常規(guī)方法栽培。以麗江新團(tuán)黑谷為感病對照。

1.2 "抗瘟基因分子標(biāo)記

抗瘟基因分子標(biāo)記來源于參考文獻(xiàn)[15-16]，引物信息見表2。所用引物由深圳華大基因有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 "DNA提取

剪取3段供試水稻品種的葉片于2 mL離心管中，采用CTAB法提取DNA[15]。

1.4 "PCR擴(kuò)增

熒光PCR反應(yīng)體系：10×Taqbuffer（含20 mmol/L Mg2+）1 μL，250 μmol/L dNTP 0.2 μL，0.5UTaqDNAPolymerase0.1 μL，20×Evagreen0.125 μL，10 ng/μL DNA模板3 μL，0.1 mmol/L正、反向引物各0.2 μL，用ddH2O定容至10 μL。熒光PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。

普通PCR反應(yīng)體系：2×ES Taq Master Mix（Dye） 7.5 μL，DNA 3.0 μL，正、反向引物各0.5 μL，3.5μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55～60℃退火30 s（根據(jù)梯度PCR結(jié)果選擇最佳退火溫度），72 ℃延伸0.5～1.5 min，32次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.5 "瓊脂糖凝膠電泳檢測

抗瘟基因Pi5、Pii、Pib、Pish、Pita2的擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，150V穩(wěn)壓電泳30 min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

1.6 "HRM檢測

抗瘟基因Pita、Pia、Pi54、Pizt、Pikm的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熔解曲線（HRM）檢測。分析程序：95 ℃變性15 s；60 ℃退火15 s；以0.07 ℃/s的速率升溫，10 reading/℃采集熒光信號，至90 ℃保持1 s，采用Light Cycler 96 software軟件進(jìn)行熔解曲線分析。

2 "結(jié)果與分析

2.1 "稻瘟病抗性基因的分子檢測及在品種中的分布

利用Pi5、Pii、Pib、Pita、Pita2、Pish、Pi54、Pia、Pizt、Pikm的功能標(biāo)記對94份黃淮稻區(qū)水稻品種（系）進(jìn)行分子檢測，結(jié)果見表3。濟(jì)糯6號等15個(gè)品種含有Pi5和Pii，精華208等82個(gè)品種含有Pib，墾香稻010等35個(gè)品種含有Pita，墾香稻010等69個(gè)品種含有Pita2，精華208等80個(gè)品種含有Pish，墾香850等56個(gè)品種含有Pi54，墾香稻010等31個(gè)品種含有Pia，墾香850等28個(gè)品種含有Pizt，精華香糯等35個(gè)品種含有Pikm。部分基因分子標(biāo)記的檢測結(jié)果如圖1～圖6所示。

Pib在供試品種中的分布頻率最高，達(dá)87.23%，其次是Pish、Pita2、Pi54、Pita、Pikm、Pia、Pizt，分布頻率分別為85.11%、73.40%、59.57%、37.23%、37.23%、32.98%、29.79%，分布頻率較低的是Pi5和Pii，均為15.96%（圖7）。

2.2 "黃淮稻區(qū)粳稻品種中含有的抗稻瘟病基因的數(shù)量分析

由表3和圖8可知，揚(yáng)粳113檢測出1個(gè)抗瘟基因Pib，占檢測品種總數(shù)的1.06%。精華208等6個(gè)品種檢測出2個(gè)抗瘟基因，占檢測品種總數(shù)的6.38%。連粳20等6個(gè)品種檢測出3個(gè)抗瘟基因。墾香850等23個(gè)品種檢測出4個(gè)抗瘟基因，占檢測品種總數(shù)的24.5%。墾香稻010等33個(gè)品種檢測出5個(gè)抗瘟基因，占檢測品種總數(shù)的35.1%。精華香糯等19個(gè)品種含有6個(gè)抗瘟基因，占檢測品種總數(shù)的20.2%。圣1818等4個(gè)品種檢測出7個(gè)抗瘟基因，占檢測品種總數(shù)的4.26%。圣香柔108、原稻392兩個(gè)品種檢測出8個(gè)抗瘟基因，占檢測品種總數(shù)的2.13%。

3 "討論與結(jié)論

分子標(biāo)記選擇具有操作簡便、用時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)，可進(jìn)行高通量的抗病篩選，這對縮短抗病育種年限，減少工作量具有重要意義。利用抗性基因的特異性分子標(biāo)記，可準(zhǔn)確快速鑒定是否含有抗性基因，這為在品種選育時(shí)聚合不同抗性基因，培育廣譜持久抗稻瘟病優(yōu)良品種打下了良好基礎(chǔ)。金國光等利用稻瘟病抗性基因Pi-9、Pi-km、Pi-ta、Pi-b、Pi-1和Pi-2等6個(gè)基因的分子標(biāo)記技術(shù)對196份吉林省水稻材料進(jìn)行檢測[17]。王生軒等對2015年河南省沿黃粳稻品種篩選試驗(yàn)的21份水稻新品系進(jìn)行Pi9、Pita和Piz-t 3個(gè)抗稻瘟病基因的分子鑒定[18]。房文文等利用Pita、Pizt和Pik2三個(gè)抗瘟基因功能標(biāo)記，通過高分辨率熔解曲線方法對64份山東水稻品種及優(yōu)異種質(zhì)資源進(jìn)行基因檢測，分析了抗病基因的分布情況[19]。基因聚合是實(shí)現(xiàn)水稻稻瘟病廣譜抗性的有效途徑之一。吳云雨等通過構(gòu)建粳稻背景下不同雙基因聚合系，結(jié)果表明雙基因聚合系PPLPigm / Pi1、PPLPigm / Pi54和PPLPigm / Pi33為長江下游粳稻的廣譜抗性基因組合模式[20]。本研究檢測了10個(gè)抗瘟基因在94個(gè)黃淮稻區(qū)水稻品種中的分布情況，為抗稻瘟病輔助育種提供了參考依據(jù)。對其他抗瘟基因的分布以及黃淮稻區(qū)粳稻的廣譜抗性基因組合模式等問題還有待進(jìn)一步研究。

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基金項(xiàng)目：山東省科技型中小企業(yè)創(chuàng)新能力提升工程（2023TSGC0432）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（鄉(xiāng)村振興科技創(chuàng)新提振行動(dòng)計(jì)劃）項(xiàng)目（2022TZXD0040）；中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)（YDZX2022088）；山東省農(nóng)業(yè)良種工程（2021LZGC020，2023LZGCQY018）；山東省水稻產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（SDAIT-17-17）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（CXGC2024B01）。

收稿日期：2024-02-20

作者簡介：陳峰（1979—），男，碩士，副研究員，主要從事水稻遺傳育種研究。

*通訊作者：張士永（1968—），男，研究員，主要從事水稻育種研究。