冬季油樟產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的分離鑒定及其抗氧化和揮發(fā)性成分分析

摘要：目的 深入挖掘油樟內(nèi)生真菌資源，從冬季油樟根、莖、葉中篩選產(chǎn)黃酮菌株并對(duì)其抗氧化和揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。方法 采用組織培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)方法分離鑒定油樟內(nèi)生真菌，借助顯色反應(yīng)和NaNO2-Al（NO3）3比色法篩選具有產(chǎn)黃酮能力菌株，利用清除自由基初步評(píng)估產(chǎn)黃酮最優(yōu)菌株的抗氧化活性，并通過氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）分析菌株的發(fā)酵產(chǎn)物成分。結(jié)果 共獲得61株內(nèi)生真菌，隸屬于3門23科29屬，子囊菌門（Ascomycota）為優(yōu)勢(shì)門，肉座菌科（Hypocreaceae）和小叢殼科（Glomerellaceae）為優(yōu)勢(shì)科，木霉屬（Trichoderma）和炭疽菌屬（Colletotrichum）為優(yōu)勢(shì)屬。不同組織間內(nèi)生真菌種類和數(shù)量存在明顯差異，其中莖部菌株多樣性、均勻度和豐富度指數(shù)均最高，且莖部和葉部相似性系數(shù)最高。通過產(chǎn)黃酮篩選到WG5（Trichoderma）和WG15（青霉屬，Penicilium）2株內(nèi)生真菌，其中WG15總黃酮含量較高且表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，DPPH和ABTS自由基清除率的IC50分別為0.52和0.49 mg/L。揮發(fā)性物質(zhì)分析顯示，2株菌株代謝產(chǎn)物存在共性和差異，主要包括酯類、酸類、醇類和酚類等物質(zhì)，共有苯乙醇、2，6-二叔丁基苯酚和棕櫚酸成分。結(jié)論 WG15具有較好的產(chǎn)黃酮和抗氧化能力，可用于后續(xù)其他功能的開發(fā)，為內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的活性研究提供了菌種資源。

關(guān)鍵詞：油樟；內(nèi)生真菌；物種鑒定；功能探索；多樣性

中圖分類號(hào)：R931 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Isolation and identification of flavonoid-producing endophytic fungi with antioxidant and volatile components from Cinnamomum longepaniculatum in winter

Liu Wenwen1，2， Liu Xiaofeng3， Shen Aijun2， Feng Ruizhang1， Hu Lianqing2， Chen Lu2 ， Wei Qin1， and Zhou Wanhai1，2

（1 Sichuan Oil Cinnamon Engineering Technology Research Center， Yibin University， Yibin 644007; 2 Faculty of Agriculture， Forestry and Food Engineering， Yibin University， Yibin 644007; 3 College of Health Industry， Sichuan Tianyi College， Deyang 618000）

Abstract Objective To explore the endophytic fungi resources of C. longepaniculatum， flavonoids-producing strains were screened from the roots， stems and leaves of C. longepaniculatum in winter， and their antioxidant and volatile components were analyzed. Methods The endophytic fungi of C. longepaniculatum were isolated and identified by tissue culture， morphological observation and molecular biology. The strains with flavonoid production capacity were screened by color reaction and the NaNO2-Al（NO3）3 colorimetric method. The antioxidant activity of the strains with optimal flavonoid production was preliminary evaluated by scavenging free radicals， and the fermentation products were analyzed by GC-MS. Results " "A total of 61 strains of endophytic fungi were obtained， belonging to 3 phyla， 23 families and 29 genera. Ascomycota was the dominant phyla; Hypocreaceae and Glomerellaceae were the dominant families. Trichoderma and Colletotrichum were the dominant genera. There were significant differences in the number and species of endophytic fungi among different tissues， among which the diversity， evenness and richness indices of stem strains were the highest and the similarity coefficients of stem and leaf strains were the highest. Two endophytic fungi strains， WG5 （Trichoderma） and WG15 （Penicilium）， were screened by flavonoids production， and the total flavonoids content of WG15 was high and showed good antioxidant activity. The IC50 of DPPH and ABTS free radical scavenging were 0.52 and 0.49 mg/L， respectively. Volatile substances analysis showed that the metabolites of the two strains had similarities and differences， mainly including esters， acids， alcohols and phenols， including phenylethyl alcohol， 2，6-di-tert-butylphenol and palmitic acid. Conclusion WG15 has good flavonoid-producing and antioxidant capacity， which can be used for further development of other functions and provides a strain resource for the study of the activity of secondary metabolites in endophytic fungi.

Key words Cinnamomum longepaniculatum; Endophytic fungi; Functional verification; Functional exploration; Diversity

內(nèi)生真菌廣泛存在于健康植物組織細(xì)胞及細(xì)胞間隙中，與寄主植物有著密切的共生關(guān)系[1]。由于不同生境孕育了不同的真菌類群，內(nèi)生真菌多樣性顯示出宿主和組織特異性。研究表明，內(nèi)生真菌能產(chǎn)生生物堿、多糖、黃酮和酚類等活性物質(zhì)，被認(rèn)為是生物活性代謝物的豐富來(lái)源[2-3]，各類次生代謝物在各項(xiàng)報(bào)道中證明具有抗氧化、抑菌、殺蟲和調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)等功能，可用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景[4]。

油樟[Cinnamomum longepaniculatum （Gamble） N. Chao]是我國(guó)特有的樟科樟屬常綠喬木，已被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物，宜賓為該植物的主產(chǎn)地，占全國(guó)油樟總資源的75%以上?，F(xiàn)代天然產(chǎn)物化學(xué)及藥理學(xué)研究顯示，油樟各組織含揮發(fā)油、有機(jī)酸、黃酮、多糖和內(nèi)酯等結(jié)構(gòu)類型的次生代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抗氧化和抗癌等活性[5]?，F(xiàn)關(guān)于油樟內(nèi)生真菌的報(bào)道僅有春季油樟不同組織內(nèi)生真菌多樣性分析[6-7]。

黃酮類化合物是植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抗氧化和抗炎等重要藥理活性，羥基功能團(tuán)分子結(jié)構(gòu)賦予了黃酮類物質(zhì)良好的抗氧化作用[8]。傳統(tǒng)黃酮類來(lái)源已無(wú)法滿足現(xiàn)有需求，以微生物為宿主合成代謝黃酮類產(chǎn)物已成為熱門趨勢(shì)，真菌能利用黃酮作為底物，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化獲得高活性生物功能衍生物[9]，現(xiàn)已揭示黃酮類在真菌中的生物合成途徑[10-11]，且有報(bào)道表明內(nèi)生真菌具有富產(chǎn)黃酮類化合物的功能，部分此功能菌株已被分離純化，如從Siraitia grosvenorii內(nèi)生真菌的發(fā)酵液及菌絲體[12]、海南東寨港紅樹林植物分離獲得的Penicillium sp. H1N1內(nèi)生真菌[13]、北桑寄生分離純化的8株Alternaria tenuissima、Dothiorella gregaria、Penicillium aethiopicum、Nothophoma quercina和Hypoxylon perforatum內(nèi)生真菌[14]中均提取到黃酮類代謝產(chǎn)物，Tang等[15]利用比色法首次從野生金龍膽草內(nèi)生真菌中篩選到11株產(chǎn)黃酮菌株，其中CBL50總黃酮含量達(dá)到（78.2±4.12） mg/L。因植物提取黃酮受環(huán)境和時(shí)空特異性的限制，成本高且耗時(shí)長(zhǎng)，因此，產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌是尋找新型抗氧化劑的重要資源。為充分利用地方經(jīng)濟(jì)作物油樟，本研究嘗試分離純化冬季油樟不同組織中內(nèi)生真菌，并篩選產(chǎn)黃酮菌株，測(cè)定其抗氧化能力和揮發(fā)性成分，為挖掘油樟功能真菌和開發(fā)活性因子奠定基礎(chǔ)，豐富油樟微生物資源庫(kù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

12月上旬于四川省宜賓市高縣月江森林經(jīng)營(yíng)所油樟母本園（28°47'77\"N，104°59'76\"E）采集40齡健康油樟的根、莖、葉組織，裝于無(wú)菌取樣袋中，4 ℃冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室作為試驗(yàn)材料。PDA培養(yǎng)基、麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基用于內(nèi)生真菌的分離。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化

自來(lái)水沖洗各組織表面2 h，無(wú)菌水沖洗3次，95%乙醇漂洗1 min，無(wú)菌水沖洗1次，4%（有效氯含量）次氯酸鈉漂洗4 min，最后用95%乙醇漂洗1 min，無(wú)菌水沖洗5次，每次30 s。取最后一次清洗用的無(wú)菌水20 μL涂布于分離培養(yǎng)基上，檢測(cè)消毒是否徹底。表面消毒處理后的組織置于無(wú)菌濾紙上吸干水分，利用無(wú)菌剪刀將根和莖裁剪成1 cm小段，葉剪成0.5 cm×0.5 cm小片，分別接種到不同分離培養(yǎng)基上，各培養(yǎng)基3個(gè)重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)。待培養(yǎng)基上單菌落長(zhǎng)出后，在對(duì)應(yīng)新鮮平板上劃線純化至菌落形態(tài)單一，依次編號(hào)并斜面保種，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 內(nèi)生真菌的ITS鑒定及多樣性分析

按照真菌組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取分離菌株DNA，采用通用引物擴(kuò)增ITS序列（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'、ITS4：5' TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）（引物由上海生工生物工程有限公司合成）對(duì)提取的內(nèi)生真菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL PCR擴(kuò)增體系：21 μL ddH2O，25 μL 2×Taq PCR Master Mix，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)數(shù)為35次，72 ℃終延伸10 min，4 ℃停止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將合格樣本送至上海生工生物工程公司測(cè)序，所得序列信息提交至NCBI網(wǎng)站BLAST程序進(jìn)行序列同源性比對(duì)，確定分離菌株分類地位，構(gòu)建進(jìn)化樹，設(shè)定bootstrap為1 000。

評(píng)價(jià)內(nèi)生真菌多樣性選用多樣性指數(shù)H’、均勻度指數(shù)E’、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)C、豐富度指數(shù)D，計(jì)算公式為：多樣性指數(shù)H’=-PiInPi；均勻度指數(shù)E’=H’/lnS；優(yōu)勢(shì)度C=（Ni/N）2；豐富度指數(shù)D=（S-1）/lnN。式中：N為所有屬數(shù)的個(gè)體數(shù)，Ni為第i個(gè)屬數(shù)的個(gè)體數(shù)；Pi=Ni/N；S為屬數(shù)。采用相似性系數(shù)SC描述2個(gè)組織間真菌物種組成的相似程度，計(jì)算公式為：SC=2j/（a+b），式中：j表示2個(gè)組織共同的真菌屬數(shù)，a和b分別表示不同組織的真菌屬數(shù)。

1.2.3 供試樣品的制備

接種適量菌餅至PDB培養(yǎng)基中，28 ℃ 110 r/min培養(yǎng)3～5 d，在無(wú)菌操作臺(tái)中利用無(wú)菌紗布過濾分離菌絲和發(fā)酵液。發(fā)酵液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，然后用乙酸乙酯等體積萃取，再將萃取液減壓蒸餾濃縮成干膏，甲醇復(fù)溶，配置成不同質(zhì)量濃度樣品用于后續(xù)研究。

1.2.4 產(chǎn)黃酮類內(nèi)生真菌篩選

參考鄭紫云等[16]顯色反應(yīng)初步篩選產(chǎn)黃酮菌株，包括NaOH反應(yīng)、乙酸鎂甲醇反應(yīng)、FeCl3反應(yīng)和鹽酸-鎂粉反應(yīng)，并利用NaNO2-Al（NO3）3比色法測(cè)定總黃酮含量[15]。

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定

配制0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50和2.00 mg/mL的樣品液用于抗氧化活性的測(cè)定，抗壞血酸（VC）作為陽(yáng)性對(duì)照。ABTS自由基清除活性和DPPH自由基清除活性均采用蘇州科銘有限公司總抗氧化能力試劑盒測(cè)試，參照說(shuō)明書操作。各樣品重復(fù)3次?？偪寡趸芰τ?jì)算公式為：總抗氧化能力（ABTS/DPPH）=（A空白-A測(cè)定）/A空白×100%，其中A表示各組的吸光度。

1.2.6 發(fā)酵液揮發(fā)性成分分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析菌株發(fā)酵液揮發(fā)性成分，其中氣相色譜采用毛細(xì)管氣相色譜柱HP-5（30 m×0.25 μm），載氣為高純N2，流量26.56 mL/min，

程序升溫，80 ℃ 3 min→5 ℃/min升溫至90 ℃ 2 min

→升溫至170 ℃ 2 min→升溫至220 ℃ 2 min。進(jìn)樣口溫度240 ℃，進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣，尾吹流量25 mL/min。質(zhì)譜采用電子轟擊離子源（EI）方式，離子源溫度為200 ℃，離子化電壓70 eV，掃描范圍50～650 m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌分離純化及分子生物學(xué)鑒定

從油樟根、莖和葉組織中共分離得到內(nèi)生真菌61株，通過與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)并構(gòu)建發(fā)育樹（表1和圖1），可知菌株隸屬于3門5綱11目23科29屬，菌屬包括曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicilium）、籃狀菌屬（Talaromyces）、木霉屬（Trichoderma）、Gliocladiopsis、鐮孢屬（Fusarium）、炭疽菌屬（Colletotrichum）、Plectosphaerella、小貝氏孢屬（Beltraniella）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）、Leptosillia、黑孢霉屬（Nigrospora）、間座殼屬（Diaporthe）、Pseudoplagiostoma、Thozetella、鏈格孢屬（Alternaria）、Microsphaeropsis、Curvularia、Ophiosphaerella、Didymocyrtis、Crassiparies、葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）、新殼梭孢屬（Neofusicoccum）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、瓶霉屬（Saksenaea）、Phanerochaete、Bjerkandera、栓菌屬（Trametes）、蟻巢傘屬（Termitomyces）。優(yōu)勢(shì)門為子囊菌門（Ascomycota），其分離頻率RF為88.52%；優(yōu)勢(shì)科為肉座菌科（Hypocreaceae，RF 13.11%）和小叢殼科（Glomerellaceae，RF 13.11%）；優(yōu)勢(shì)屬為木霉屬和炭疽菌屬，RF亦為13.11%。

2.2 不同組織內(nèi)生真菌群落組成和多樣性分析

通過圖2可知，不同組織內(nèi)生真菌種類和數(shù)量間存在明顯差異。油樟根部共獲得內(nèi)生真菌21株，分屬于2門3綱6目9科10屬，RF超過10%的菌科包括肉座菌科（38.10%）、曲霉科（Aspergillaceae，14.29%）、叢赤殼科（Nectriaceae，14.29%），RF超過10%的菌屬包括木霉屬（38.10%）和Gliocladiopsis（14.29%）；從莖部共獲得內(nèi)生真菌22株，分屬于2門3綱7目11科15屬，RF超過10%的菌科有間座殼科（Diaporthaceae，18.18%）、叢赤殼科（13.64%）、Pleosporineae（13.64%），RF超過10%的菌屬包括間座殼屬（18.18%）和鐮孢屬（13.64%）。從葉部共獲得內(nèi)生真菌18株，分屬于2門3綱5目7科7屬，RF超過10%的菌科包括小叢殼科（38.89%）、梨孢假殼科（Apiosporaceae，16.67%）、Pleosporineae（16.67%）、Sporocadaceae（11.11%），RF超過10%的菌屬包括炭疽菌屬（38.89%）、黑孢霉屬（16.67%）、鏈格孢屬（16.67%）和擬盤多毛孢屬（11.11%）。通過圖3可知，根、莖、葉特有菌科分別為7、8和4個(gè)，Sporocadaceae和Pleosporineae為莖葉共有菌科，叢赤殼科為根和莖共有菌科，小叢殼科是根和葉共有菌科；根、莖、葉特有菌屬分別為9、13和4個(gè)，炭疽菌屬為根和葉共有菌屬，鏈格孢屬和擬盤多毛孢屬為莖和葉共有菌屬。3個(gè)組織間未見共有菌屬和菌科。表2顯示，油樟不同組織間內(nèi)生真菌多樣性具有差異，其中莖部?jī)?nèi)生真菌多樣性、均勻度及豐富度指數(shù)分別為2.56、0.94和4.85，均高于其他部位。葉部?jī)?nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)度最高，為0.23。相似性系數(shù)表明，莖部和葉部相似性系數(shù)最高，為0.18，與根部?jī)?nèi)生菌不存在相似度（表3）。

2.3 產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的篩選

根據(jù)顯色反應(yīng)（表4）篩選出變化明顯的2株產(chǎn)黃酮類化合物內(nèi)生真菌WG5和WG15。采用NaNO2-Al（NO3）3比色法建立蘆丁吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=0.008 2X+0.0075，R2=0.9923），以此為基礎(chǔ)測(cè)定WG5和WG15菌株發(fā)酵液中總黃酮含量。結(jié)果表明，WG15總黃酮含量為（9.93±0.35） mg/L，WG5總黃酮含量相對(duì)較低，為（1.51±0.19） mg/L。

WG5菌落在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，質(zhì)地疏松，菌絲呈白色且密集。菌絲有明顯節(jié)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含橫隔膜，有分枝，菌絲側(cè)邊有囊狀突起，孢子呈卵形或橢圓形（圖4）。WG15菌落中心呈綠色、粉末狀，外周顏色呈白色，菌絲內(nèi)含橫隔膜，有分枝，孢子呈橢圓、內(nèi)壁光滑（圖5）。

2.4 菌株粗提物抗氧化活性

通過圖6顯示，WG5和WG15發(fā)酵液在0.25～2.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)具有清除DPPH和ABTS自由基的能力，且此活性與濃度呈正相關(guān)。在最高濃度2.0 mg/mL時(shí)，2個(gè)菌株DPPH自由基清除率分別為49.22%±2.21%和75.80%±3.59%，其IC50分別為2.28和0.52 mg/mL。同時(shí)，在最高濃度2.0 mg/mL下，2個(gè)菌株ABTS自由基清除率分別為70.94%±3.08%和84.31%±1.97%，其IC50分別為0.91和0.49 mg/mL。

2.5 菌株發(fā)酵液揮發(fā)性成分分析

通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)譜庫(kù)檢索，鑒定出WG5發(fā)酵液中共13種成分，C2～C7化合物相對(duì)含量為23.08%

（3種），C8化合物相對(duì)含量為15.38%（2種），C9～C15化合物相對(duì)含量為46.15%（6種），揮發(fā)性成分主要是醇類、醛類、酮類、酚類等，其中醇類數(shù)量最多。鑒定出WG15菌株發(fā)酵液共有17種成分，C2～C7化合物相對(duì)含量為41.18%（7種），C8化合物相對(duì)含量為11.76%（2種），C9～C15化合物相對(duì)含量為35.29%（6種），揮發(fā)性成分主要是酯類、酸類、醇類和酚類等，其中酯類數(shù)量最多。2個(gè)菌株共有成分為苯乙醇、2，6-二叔丁基苯酚和棕櫚酸。

3 討論與結(jié)論

分析植物內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性并篩選功能性菌株，為植物可持續(xù)開發(fā)和微生物資源利用奠定基礎(chǔ)。相對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)，可培養(yǎng)法雖不能完整揭示內(nèi)部微生物群落組成，但獲得的純菌株可用于微生物生理和代謝研究，是闡明菌株功能所必需。本研究利用組織培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)法從油樟不同組織中分離到3門29屬61株內(nèi)生真菌。前期課題組借助高通量技術(shù)發(fā)現(xiàn)油樟根、莖和葉部?jī)?yōu)勢(shì)菌屬分別為unclassified fungi、Passalora和unclassified Ascomycota，未知菌屬占比較大，同時(shí)從春季油樟分離獲得28屬62株內(nèi)生真菌，如鏈格孢屬、附球?qū)伲‥picoccum）和間座殼屬等[6-7]，上述研究結(jié)果均與本試驗(yàn)所分離鑒定的菌屬類型和數(shù)量存在差異，可知，不同季節(jié)和組織中內(nèi)生真菌群落多樣性存在共性和特異性。油樟不同組織多樣性指數(shù)和相似性系數(shù)分析顯示，莖部?jī)?nèi)生真菌多樣性和豐富度指數(shù)均最高，地上部分莖和葉間群落組成最接近，與地下組織根部組成差異較大，可能由于莖部充足的養(yǎng)分促使更多內(nèi)生真菌侵染定殖，但與春季油樟根部?jī)?nèi)生真菌種群多樣性最豐富的報(bào)道不一致[7]，同時(shí)不同組織化學(xué)成分、通氣狀況、空間大小等微環(huán)境的差異，直接影響宿主內(nèi)生真菌群落組成[17]，其他研究也證實(shí)根部?jī)?nèi)生菌資源主要與土壤菌群相似，葉和莖部?jī)?nèi)生真菌與外界空氣菌群相關(guān)，小黃花茶和云南廣南蒜頭果不同組織內(nèi)生真菌研究結(jié)果也類似[18-19]。本試驗(yàn)分離頻率較高的木霉屬、炭疽菌屬和鏈格孢屬等表現(xiàn)出獨(dú)特的促生、生物防治和生物施肥等功能，如炭疽菌屬能產(chǎn)生甾醇、萜烯、吡喃酮等至少109種次生代謝產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于抗菌、病蟲害防治等領(lǐng)域[20-21]，對(duì)于61株內(nèi)生真菌在宿主中發(fā)揮何種生態(tài)學(xué)作用還需深入探討。

本試驗(yàn)利用顯色反應(yīng)和NaNO2-Al（NO3）3比色法[15]獲得2株高產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌，分別屬于木霉屬和青霉屬。其中木霉屬具有產(chǎn)生多種生物活性次生代謝物的巨大潛力，此代謝物是新型除草劑和抗生素的重要來(lái)源，可促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)、磷元素吸收[22-23]；青霉素也是天然產(chǎn)物的重要來(lái)源[24]，因此，通過產(chǎn)黃酮功能篩選獲得的內(nèi)生真菌具有較高研究和應(yīng)用價(jià)值， WG15總黃酮產(chǎn)量最高，為（9.93±0.35） mg/L。寇曉琳等[25]從青錢柳中67株內(nèi)生真菌中確定4株具有產(chǎn)黃酮物質(zhì)功能，其中3株鑒定為鏈格孢屬，CY12屬于正青霉屬（Eupenicillium），PZ06產(chǎn)黃酮量最高，為3.61 mg/L，CP06最低為0.57 mg/L。鄭紫云等[16]從北桑寄生中篩選出3株產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌，分別鑒定為Botryosphaeria sp.（ZC020）、Phoma sp. （ZZ105）和Nemania sp.（ZS042），ZC020和ZS042總黃酮含量較高，分別為（44.58±0.72） mg/L和（31.98±0.18） mg/L。Tang等[15]利用NaNO2-Al（NO3）3比色法從中藥材金龍膽草中獲得高產(chǎn)黃酮菌株CBL11、CBL12和CBL9，產(chǎn)量分別為（50.78±2.4）、（10.64±1.01）和（10.17±0.11） mg/L。因此，WG15菌株黃酮含量居中等水平，后續(xù)還需利用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件，以此提高菌株黃酮產(chǎn)量。隨著黃酮類化合物藥用價(jià)值的提高，尋找黃酮產(chǎn)量更高、抗氧化活性強(qiáng)的內(nèi)生真菌勢(shì)在必行。

適量的自由基是維持正常生命活動(dòng)所必需，但自由基過多會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激而加速疾病進(jìn)程，如心腦血管疾病、糖尿病、阿爾茨海默癥和腫瘤等[26]，黃酮苯環(huán)上OH-易失去氫電子，通過減緩或阻斷脂質(zhì)過氧化發(fā)揮抗氧化功能，具有清除自由基的作用[27]。微生物已成為替代植物篩選天然抗氧化活性劑的巨大寶庫(kù)[28]。Uma Anitha等[29]對(duì)飛揚(yáng)草內(nèi)生真菌Achaetomium sp.抗氧化能力進(jìn)行了分析，顯示總黃酮的DPPH清除率為（66.890% ±1.385%）～（87.340%±0.289）%；Tang等[15]分離的CBL12內(nèi)生真菌對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除率分別為94.56%±0.29%和99.88%±0.27%，IC50值僅為（0.11±0.01）和（0.20±0.01） mg/mL；王蘭英等[30]從蜂巢珊瑚中獲得1株高抗氧化活性S-1-5內(nèi)生真菌，其DPPH和ABTS自由基清除率分別為70.60%和67.18%。喬自鵬等[31]研究顯示，勝紅薊莖部1株內(nèi)生真菌的清除DPPH自由基率可達(dá)87.23%，IC50為242.13 μg/mL；清除ABTS自由基率為94.72%，其IC50為58.38 μg/mL；鄭紫云等[16]篩選的3株北桑寄內(nèi)生真菌中ZS042的DPPH和ABTS自由基清除率均最高，分別為57.01%和88.17%。本試驗(yàn)WG15菌株DPPH和ABTS自由基清除率分別為75.80%和84.31%，IC50分別為0.52和0.49 mg/mL，可知，WG15菌株不僅具有較高的總黃酮含量，且顯示出良好的抗氧化活性，現(xiàn)有研究結(jié)果表明，黃酮類化合物能抑制細(xì)菌毒力因子的表達(dá)，表現(xiàn)出顯著抗菌和抗炎活性[32]，后續(xù)還將對(duì)功能菌株有效活性的組分展開深入探討。

微生物能產(chǎn)生成分復(fù)雜的揮發(fā)性有機(jī)混合物，通常利用頂空固相微萃取技術(shù)結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法鑒定真菌產(chǎn)揮發(fā)性有機(jī)物的種類和相對(duì)含量，耗時(shí)短、靈敏度高且精確度好。現(xiàn)已證實(shí)該成分共同作用表現(xiàn)出抑制病原菌、促進(jìn)植物生長(zhǎng)等功能。很多研究者已對(duì)真菌發(fā)酵混合物中單物質(zhì)成分作用展開了研究[33]，確定異山梨醇、甲基叔丁基醚、二甲基二硫醚、2-壬酮、二乙基己醇和苯甲醛等揮發(fā)性有機(jī)物具有抑菌活性，2，3-丁二醇和3-羥基-2-丁酮顯示促生和誘導(dǎo)植物抗病效應(yīng)。Malmierca等[34]分析了番茄內(nèi)生真菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的發(fā)酵液揮發(fā)性物質(zhì)，可知含有抑制灰葡萄孢病原菌的二萜類成分。Khruengsai等[35]從非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）的發(fā)酵液中鑒定到苯乙醇物質(zhì)，經(jīng)證實(shí)該菌株可抑制鐮刀病原菌的生長(zhǎng)。Mookherjee等[36]從茄子果實(shí)中篩選得到1株產(chǎn)果香味的白地霉（Geotrichum candidum），苯乙醇、乙酸異戊酯和萘是此真菌主要的抗菌活性物質(zhì)。本研究2株內(nèi)生真菌揮發(fā)性成分與上述揮發(fā)性物質(zhì)有相同之處，均產(chǎn)生苯乙醇、苯甲醛等成分，但2株菌株揮發(fā)性成分差異亦大，僅共有苯乙醇、2，6-二叔丁基苯酚和棕櫚酸。有研究表明，木霉屬的揮發(fā)性物質(zhì)中常存在具有“椰子香味”的吡喃酮-6-戊基-2H-吡喃-2-酮[37]，但本研究的WG15木霉屬揮發(fā)成分中并未檢測(cè)到該物質(zhì)，可能是檢測(cè)條件的改變或因真菌生長(zhǎng)環(huán)境的不同引起，后續(xù)需利用純品化合物驗(yàn)證菌株發(fā)酵液中揮發(fā)性有機(jī)物中單物質(zhì)活性功能。

參 考 文 獻(xiàn)

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