宜賓油樟皂制備及其抑菌能力的研究*

李秀萍，陸 兵，郭云霞，張敬慧，程 偲，李小燕

(宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 宜賓 644003)

油樟(Cinnamomum longepaniculatum(Gamble)N.Chao)是屬于樟科樟屬的常綠喬木[1]。四川宜賓為我國的油樟主產(chǎn)地，素有“油樟王國”之稱，宜賓現(xiàn)有油樟約3.3萬公頃，占我國和全球油樟資源比例分別為85%和65%[2],所以生長于該地的油樟也被稱為“宜賓油樟”。宜賓油樟的營養(yǎng)器官——根、莖、葉均可用于提取樟油[3]，但不同部位提取的樟油成分含量有較大差異。2020年宜賓油樟油的產(chǎn)量約為1.2萬噸，分別占四川省、全國和全球的90%以上、70%以上和50%左右，可見宜賓油樟油產(chǎn)量極其豐富。油樟精油包含桉葉素、萜品醇、水芹烯、芳樟醇、松油醇等活性成分[4]，具有抗炎、抗氧化[5-7]、抗自由基[8]、抗菌和抗癌[9]的作用，同時鎮(zhèn)痛[10]、治療皮膚真菌病[11]、驅(qū)蚊、止癢、提神的功效。此外，樟油還被報道具有抗細菌、真菌和病毒的廣譜抑菌活性[12-14]。陶翠等[15]對油樟葉揮發(fā)油抗須毛癬菌,犬小孢子菌和石膏小孢子菌的效果進行研究，發(fā)現(xiàn)其對這三種真菌有較強的的殺菌作用。張超等[16]以油樟葉為原料，用有機溶劑提取得到油樟揮發(fā)油，用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌三種常見致病菌的抑制活性研究，發(fā)現(xiàn)其對這三種細菌有不同程度的抑制作用。隨著人們健康意識的提高，特別是此次新型冠狀病毒的爆發(fā)與持續(xù)，使人們越來越認識到日常生活中消毒殺菌對預(yù)防各種病原菌的重要作用。但是人們平時日常消毒殺菌主要依靠消毒液、酒精等產(chǎn)品，這些產(chǎn)品雖然能消毒殺菌，但卻也帶來了令人不適的氣味，且對人體直接使用，會對人體皮膚造成損害。而油樟精油具有上述優(yōu)點，因此可以油樟精油與肥皂結(jié)合，制成油樟精油皂，用于人們?nèi)粘Ｏ词?、洗澡和洗衣等消毒殺菌。鑒于還沒有文獻對樟油皂進行報道，本文以通過優(yōu)化以椰子油、橄欖油和棕櫚油為皂基配方，以及油樟精油添加量，制得宜賓油樟皂，并對宜賓油樟皂進行理化檢測、感官評價與抑菌能力的探究，為將資源豐富的宜賓樟油用于開發(fā)宜賓油樟皂提供科學(xué)依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

油樟精油，購于宜賓縣泥溪鎮(zhèn)；椰子油、橄欖油、棕櫚油，規(guī)格均為1000 mL，均購于宜賓綠源超市。氫氧化鈉、瓊脂等試劑均為市售分析純，大腸桿菌為實驗室保藏菌株。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-1304IIA2超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)公司；BJPX-400恒溫培養(yǎng)箱，卓絕醫(yī)療器械有限公司；CJ-881磁力攪拌器，金壇市醫(yī)療器廠；YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅醫(yī)療生物公司；PHS-2FpH計，上海儀電科學(xué)儀器公司；JD400-3電子分析天平，沈陽龍騰電子有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 宜賓油樟皂制備工藝流程

椰子油、橄欖油、棕櫚油 → 于燒杯中水浴加熱(50～60 ℃) → 分次加入NaOH溶液(50 ℃) → 加入蒸餾水 → 攪拌皂化(500 r/min) → 出現(xiàn)結(jié)膏點 → 加入油樟精油 → 攪拌3 min → 入模 → 冷卻 → 風(fēng)干 → 脫模 → 宜賓油樟皂

1.3.2 皂基配比的優(yōu)化

宜賓油樟皂以椰子油、橄欖油和棕櫚油作為基礎(chǔ)油脂，根據(jù)不同的油脂性狀特點，以此來確定基礎(chǔ)油脂的比例。皂基油脂配比，需要參考硬度值，即為為INS。INS硬度值，是在扣除水分及其他添加物以外，不同的油脂配方的皂，皂在相同濕度環(huán)境、相同的時間，皂體呼吸空氣中的水分之后易于熔化后變軟的程度。油脂配方的INS值在160～180最佳，以此為基礎(chǔ)優(yōu)化宜賓油樟皂皂基的配比。

表1 皂基配比的優(yōu)化Table 1 Optimization of soap base ratio

1.3.3 不同濃度宜賓油樟皂的制備

按1.3.1的制備步驟，在最佳皂基中分別加入0%、0.5%、1%、1.5%和2%的油樟精油，制備一系列濃度的宜賓油樟皂，依次標記為A～E組,進行理化性質(zhì)檢測，并用于后續(xù)實驗。

1.3.4 宜賓油樟皂理化指標檢測和感官評價

1.3.4.1 水分和揮發(fā)物含量測定

稱取一定量的宜賓油樟皂，放置于干燥的蒸發(fā)皿中，將它們一起稱重后，放到烘箱內(nèi)105 ℃干燥1 h。將其取出，用攪拌棒將宜賓油樟皂壓碎至細粉狀。再將其放回烘箱中，105 ℃干燥3 h后，取出，置于干燥器內(nèi)，冷卻至室溫稱量。重復(fù)操作，每次置于烘箱內(nèi)1 h，直至恒重，并記錄最后稱量結(jié)果。按下式對水分和揮發(fā)物含量進行計算，以三次平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示至整數(shù)個位作為測定結(jié)果。

式中：W為水分和揮發(fā)物含量，%；m0為宜賓油樟皂質(zhì)量，g；m1為烘干前蒸發(fā)皿與宜賓油樟皂的總質(zhì)量，g；m2為烘干后蒸發(fā)皿與宜賓油樟皂的總質(zhì)量，g。

1.3.4.2 宜賓油樟皂pH值測定

精確稱取1.3.3中的A～E組宜賓油樟皂1.000 g于燒杯中,用蒸餾水溶解，倒至100 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度線。取適量的宜賓油樟皂溶液，用pH計進行pH測定。

1.3.4.3 宜賓油樟皂感官評價

隨機選取20人對油樟手工皂的皂型效果和氣味進行感官評價。皂型效果主要評價：表面有無開裂，質(zhì)感硬、適中、軟。氣味主要評價：有無酸敗氣味。20人評價結(jié)束后，對評價結(jié)果進行統(tǒng)計，將占比最高的感官評價作為最終結(jié)果。

1.3.5 宜賓油樟皂抑菌能力探究

1.3.5.1 宜賓油樟皂的稀釋液制備

分別稱取1.3.3中的A～E組宜賓油樟皂各5.000 g，加入無菌水，充分震蕩搖勻，配置成50%的不同油樟精油濃度的宜賓油樟皂溶液。

1.3.5.2 大腸桿菌菌懸液的制備

在無菌操作臺中，用接種環(huán)從大腸桿菌培養(yǎng)皿上輕刮菌苔1環(huán)，收集到內(nèi)盛25 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，配制成大腸桿菌濃度為105 cfu/mL的菌懸液。

1.3.5.3 大腸桿菌染菌平板的制作

在無菌操作臺中，將已滅菌且冷卻至50 ℃的大腸桿菌培養(yǎng)基倒入無菌的培養(yǎng)皿中，每個皿的培養(yǎng)基為15～20 mL。在大腸桿菌培養(yǎng)基凝固后，每皿中加入1.3.5.2中的大腸桿菌菌懸液0.1 mL，用無菌涂布棒將菌懸液涂布均勻，靜置30 min。

1.3.5.4 宜賓油樟皂抑菌活性測定[17]

將直徑為10 mm的滅菌圓形濾紙，分別放入1.3.5.1不同油樟精油濃度的宜賓油樟皂溶液和無菌水中浸泡2 h，然后瀝干至不滴水的濕潤狀態(tài)。將浸有不同油樟精油濃度的宜賓油樟皂溶液的濾紙片分別貼在1.3.5.3中涂布有大腸桿菌的培養(yǎng)基上。另每培養(yǎng)皿貼2片以無菌水浸泡的濾紙作為空白對照。將大腸桿菌培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)，24 h后觀察。通過濾紙周圍是否有明顯的抑菌圈，確定抑菌效果。每個實驗進行3次平行。

1.3.5.5 宜賓油樟皂最小抑菌濃度的測定

取1.3.5.1中E組的宜賓油樟皂溶液，加無菌水進行二倍梯度稀釋，分別稀釋成原溶液濃度的100%、50%、25%、12.5%和6.25%的宜賓油樟皂稀釋溶液。分別取不同稀釋度的宜賓油樟皂稀釋溶液1 mL與已滅菌且冷卻至50 ℃的大腸桿菌培養(yǎng)基混合均勻后，倒入到培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，即可得到含不同宜賓油樟皂稀釋度的平板。在平板上，加入大腸桿菌菌懸液0.1 mL，涂布均勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)24 h后，觀察菌體生長情況。有大腸桿菌生長標記為(+)，無大腸桿菌生長標記為(-)，以不生長大腸桿菌的最低濃度為宜賓油樟皂的最低抑菌濃度(MIC)。每個實驗進行3次平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 皂基的配比優(yōu)化實驗結(jié)果

在椰子油:橄欖油:棕櫚油配比分別為30%:40%:30%、30%:30%:40%、40%:30%:30%下，對不同皂基的配比進行比較，確定宜賓油樟皂的最優(yōu)皂基配比。皂基的配比優(yōu)化實驗結(jié)果見表2。

表2 皂基的配比優(yōu)化實驗結(jié)果Table 2 Experimental results of soap base ratio optimization

由表2可知，三種不同宜賓油樟皂皂基配比的水分和揮發(fā)物含量均為13%，均符合中國輕工行業(yè)標準QB/T 2485-2008《香皂》(水分和揮發(fā)物含量 ≤ 30%)。三種不同皂基的pH值均在8左右，說明用于皂化的氫氧化鈉均已消耗完全，與不同皂基配比無關(guān)，此時顯示出的弱堿性是由氫氧化鈉與油脂發(fā)生皂化反應(yīng)后生成的鈉鹽造成的。從皂型效果來看，皂基配比①最好，而皂基配比②太過干燥而開裂，皂基配比③太過濕潤而具有粘感。因此，選取皂基配比①，即椰子油:橄欖油:棕櫚油配比為30%:40%:30%作為宜賓油樟皂的最優(yōu)皂基配比。

2.2 不同濃度的宜賓油樟皂理化指標和感官評價實驗結(jié)果

在椰子油：橄欖油：棕櫚油配比為30%:40%:30%時，添加0%、0.5%、1%、1.5%和2%的油樟精油，制得不同油樟精油濃度的宜賓油樟皂，并對其進行理化指標測定和感官評價，其結(jié)果見表3。

表3 不同濃度的宜賓油樟皂理化指標和感官評價實驗結(jié)果Table 3 Physical and chemical indexes and sensory evaluation results of different concentrations of Yibin camphor soap

由表3可知，添加不同濃度的油樟精油后，宜賓油樟皂的水分和揮發(fā)物含量在12%～18%之間，仍符合中國輕工行業(yè)標準QB/T 2485-2008《香皂》(水分和揮發(fā)物含量≤30%)，pH值在7.92～8.26之間，說明油樟精油添加對pH無影響。同時A～E組宜賓油樟皂的皂型均無開裂，質(zhì)感良好，無酸敗氣味。由此可以看出宜賓油樟皂對油樟精油的可溶性較大，適合制作不同濃度的宜賓油樟皂。

2.3 宜賓油樟皂抑菌活性實驗結(jié)果

取油樟精油濃度分別為0%、0.5%、1%、1.5%、2%的宜賓油樟皂，加無菌水，分別配制成50%的宜賓油樟皂溶液，以無菌水作為空白對照，考察其對大腸桿菌的抑菌活性，宜賓油樟皂抑菌活性結(jié)果見表4。

表4 宜賓油樟皂抑菌活性實驗結(jié)果Table 4 Experimental results of antimicrobial activity of Yibin camphor soap

由表4可知，當宜賓油樟皂中油樟精油添加量為0%和0.5%時，與無菌水空白對照一樣，在大腸桿菌平板上的濾紙片周圍均無明顯抑菌圈出現(xiàn)，說明對大腸桿菌無抑菌活性。油樟精油含量大于等于1%時，隨著油樟精油濃度的升高，有明顯的抑菌圈，說明對大腸桿菌的抑制效果越來越明顯。其中油樟精油添加量為1.5%、2%時，對大腸桿菌的抑制作用最為明顯。

2.4 宜賓油樟皂最小抑制濃度的測定實驗結(jié)果

將油樟精油濃度為2%的宜賓油樟皂，加適量無菌水配制成50%的溶液，再加無菌水進行二倍梯度稀釋，分別稀釋成原溶液濃度的100%、50%、25%、12.5%和6.25%的宜賓油樟皂稀釋溶液，考察宜賓油樟皂的最小抑制濃度，其結(jié)果見表5。

表5 宜賓油樟皂最小抑制濃度的測定實驗結(jié)果Table 5 Experimental results of the determination of the minimum inhibitory concentration of Yibin camphor soap

由表5可知，油樟精油添加量為2%的宜賓油樟皂，當其稀釋度為6.25%、12.5%和25%時，大腸桿菌生長，此時無抑菌作用；當其稀釋度為100%和50%時，大腸桿菌不生長，此時有抑菌作用。因此油樟精油添加量為2%的宜賓油樟皂最小抑制濃度為50%。

3 結(jié) 論

在皂基優(yōu)化實驗，通過比較不同配比皂基含水和揮發(fā)物含量、pH和皂型效果，確定了皂基最優(yōu)配比為椰子油:橄欖油:棕櫚油為30%:40%:30%。不同油樟精油添加量制成的宜賓油樟皂的含水和揮發(fā)物含量在12%～18%，符合中國輕工行業(yè)標準QB/T 2485-2008《香皂》(水分和揮發(fā)物含量≤30%)，pH在8.0左右，屬于弱堿性，皂型效果良好，無酸敗氣味。將宜賓油樟皂配成50%濃度的溶液，加濾紙浸泡，發(fā)現(xiàn)當油樟精油添加量為0%和0.5%時，濾紙周圍為抑菌圈，對大腸桿菌無抑菌活性；當油樟精油添加量在1%～2%時，有明顯抑菌圈，對大腸桿菌有抑菌活性。2%油樟精油濃度的宜賓油樟皂進行二倍稀釋，發(fā)現(xiàn)其最小抑制濃度為50%。通過以上實驗，得到了制備宜賓油樟皂的工藝條件，驗證了其抑菌活性，為宜賓油樟皂的生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。