不同黃化茶樹(shù)種質(zhì)中咖啡堿合成部位的研究

摘要：咖啡堿作為茶樹(shù)中的主要特征代謝物，是茶葉品質(zhì)風(fēng)味形成的重要組分和天然功能性成分。目前，茶樹(shù)中咖啡堿的功能作用、分布規(guī)律、合成途徑及關(guān)鍵基因已基本探明，但在亞細(xì)胞水平上，咖啡堿的合成部位有待進(jìn)一步明確。以白雞冠茶樹(shù)及其自然雜交后代的不同黃化單株為材料，通過(guò)透射電鏡對(duì)葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)黃化葉片中葉綠體結(jié)構(gòu)均有不同程度的受損，且與葉片SPAD值及葉色表型緊密相關(guān)；通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定咖啡堿含量，發(fā)現(xiàn)黃化葉片中仍有大量咖啡堿積累，甚至超過(guò)正常綠色葉片。通過(guò)咖啡堿合成關(guān)鍵基因CsTCS1表達(dá)量測(cè)定、原位雜交及亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，CsTCS1在不同黃化茶樹(shù)種質(zhì)葉片中的表達(dá)信號(hào)強(qiáng)度存在差異，但表達(dá)部位基本相同，主要分布在柵欄組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中；在亞細(xì)胞水平上，茶樹(shù)葉片中咖啡堿的合成部位主要是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù)；黃化葉片；咖啡堿；合成部位；亞細(xì)胞水平

中圖分類(lèi)號(hào)：S571.1；Q52 """"""""""""文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A """"""""""""""文章編號(hào)：1000-369X（2024）04-575-10

Study on the Synthetic Site of Caffeine in Different Etiolated Tea Germplasms

ZHANG"Yazhen¹， ZHONG Sitong¹， CHEN Zhihui¹， KONG Xiangrui¹， SHAN Ruiyang¹，

ZHENG Shiqin¹， YU Wenquan^2*， CHEN Changsong^1*

1. Tea Research Institute， Fujian"Academy of Agricultural Sciences/Fujian Branch， National Center for Tea Improvement， Fuzhou 350012， China; 2. Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350003， China

Abstract："As the main characteristic metabolite in tea plants， caffeine contributes to tea quality and flavor formation and is a"natural functional component. Its function， distribution， biosynthetic pathway and related key genes in tea plants have been"basically identified， but its synthetic site at subcellular level needs to be further clarified. In this study， ‘Baijiguan’"and its half-sib offsprings with different etiolated leaves were used as materials. The results of transmission electron microscopy show that the chloroplast structures in etiolated leaves were damaged or destroyed， which was closely related to"the"SPAD value and leaf phenotype. High performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine the caffeine content. It was found that there was still a large amount of caffeine accumulation in etiolated leaves， even more than in normal green leaves."Then， the expression and location of CsTCS1， a key gene involved in caffeine synthesis， were studied"by real-time PCR， in-situ hybridization and subcellular localization. It was shown"that the expression level of CsTCS1"in different etiolated leaves varied obviously. But the expression site was basically consistent， mainly distributed in the nucleus and cytoplasm of palisade tissues."These results reveal"that the synthetic"site of caffeine at subcellular level in tea leaves were mainly nucleus and cytoplasm， but not chloroplasts.

Keywords："tea plants， etiolated leaf， caffeine， synthetic site， subcellular level

咖啡堿，又名1，3，7-三甲基黃嘌呤，是植物中一類(lèi)重要的嘌呤生物堿，對(duì)人體具有興奮、利尿等作用^[1]。咖啡堿是嘌呤生物堿的主體成分，占比95%以上，不僅參與茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，而且與茶氨酸、兒茶素等次級(jí)代謝物共同決定了茶葉的品質(zhì)和風(fēng)味?？Х葔A主要存在于茶樹(shù)葉片，且以幼嫩部位含量最高，占總干重的2%～3%^[2]。咖啡堿的合成也主要在幼嫩葉中進(jìn)行，且合成速度隨葉片老化而逐漸下降^[3]。目前，茶樹(shù)中咖啡堿生物合成途徑已基本闡明，可分為供體途徑和核心途徑兩個(gè)部分，黃嘌呤骨架來(lái)源于嘌呤核苷酸，初始底物為黃嘌呤核苷，甲基供體是S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）。咖啡堿合成的核心途徑由黃嘌呤核苷開(kāi)始，在3種N-甲基轉(zhuǎn)移酶（N-methyltransferase，NMT）和N-甲基核苷酶的作用下，分別經(jīng)三步甲基化和一步核苷降解反應(yīng)，依次生成7-甲基黃嘌呤核苷、7-甲基黃嘌呤、可可堿和咖啡堿^[4-5]。其中，黃嘌呤核苷N-甲基轉(zhuǎn)移酶（7-NMT）和7-甲基黃嘌呤N-甲基轉(zhuǎn)移酶（3-NMT）具有幾乎相同的性質(zhì)，又統(tǒng)稱(chēng)為咖啡堿合成酶（Tea caffeine synthase，TCS）^[6-7]。研究表明，CsTCS1（GenBank AB031280.1）是茶樹(shù)咖啡堿合成的關(guān)鍵酶，具有合成可可堿和咖啡堿的雙重作用，其功能已得到廣泛證實(shí)和深入研究^[8-10]。

如上所述，目前學(xué)者們從生物化學(xué)和分子生物學(xué)水平，對(duì)茶樹(shù)中咖啡堿的功能作用、分布規(guī)律、合成途徑及關(guān)鍵基因等方面進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究，并取得了顯著進(jìn)展。但在細(xì)胞水平，尤其是亞細(xì)胞水平上，咖啡堿合成部位的研究較少。研究表明，植物次生代謝合成途徑中涉及的酶類(lèi)或中間產(chǎn)物往往定位于不同細(xì)胞器中，因此在亞細(xì)胞水平上次生代謝呈現(xiàn)出區(qū)室化現(xiàn)象，這不僅可以有效降低合成過(guò)程中的酶抑制效應(yīng)，減輕產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒害性，促進(jìn)其合成累積，還可通過(guò)控制代謝流的大小和方向，分散細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)，從而在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用^[11-12]。

早期研究認(rèn)為茶樹(shù)咖啡堿合成與葉綠體密切相關(guān)，推測(cè)合成后的咖啡堿可能與綠原酸結(jié)合形成復(fù)合物，集中貯存在液泡中^[13]。而在黃化茶樹(shù)種質(zhì)葉片中，葉綠體結(jié)構(gòu)異常，甚至解體，卻仍有大量咖啡堿的積累^[14-16]。由此可見(jiàn)，咖啡堿合成的亞細(xì)胞定位仍存在爭(zhēng)議，有待進(jìn)一步明確。因此，本研究擬以不同黃化茶樹(shù)種質(zhì)為材料，開(kāi)展咖啡堿合成部位研究。通過(guò)葉片超微結(jié)構(gòu)觀察、咖啡堿含量測(cè)定、關(guān)鍵基因CsTCS1的表達(dá)量及表達(dá)部位的檢測(cè)，以期明確咖啡堿合成的亞細(xì)胞部位，為全面解析茶樹(shù)中咖啡堿代謝過(guò)程奠定理論基礎(chǔ)。

1"材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以白雞冠茶樹(shù)及其自然雜交后代單株為材料，包括白雞冠茶樹(shù)單株（BJG）、綠色單株（L），以及自然生長(zhǎng)環(huán)境下呈現(xiàn)出穩(wěn)定的葉色黃化表型的雜交后代黃綠色單株（HL）、黃色單株（H）和黃紅色單株（HH），種植于福建省福安市（119°34′"E，27°12′"N）福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶園。分別取芽下第一葉或一芽二葉用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 葉綠素相對(duì)含量測(cè)定

使用葉綠素計(jì)SPAD-502plus對(duì)芽下第一葉進(jìn)行葉綠素相對(duì)含量（SPAD值）的測(cè)定，避開(kāi)葉脈，每組樣品設(shè)置8個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取平均值，并利用SPSS軟件中的單因素ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

1.3 葉片超微結(jié)構(gòu)的觀察

取芽下第一葉新鮮組織，切成米粒大小（約1 mm²），立即投入2.5%戊二醛溶液中室溫固定2 h，4 ℃保存，用于樣本制備。固定片用0.1 mol·L^-1磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH 7.4）洗滌15 min，重復(fù)2～3次。然后將樣品重新固定在含有0.1 mol·L^-1"PBS的1%鋨酸中2 h，重復(fù)按上述方法洗滌。將樣品組織依次用30%、50%、70%、80%、95%、100%、100%濃度的乙醇溶液進(jìn)行脫水，每次1 h。依次用V_{無(wú)水乙醇}∶V_丙酮分別為3∶1、1∶1和1∶3進(jìn)行脫水，每次0.5 h；然后依次用不同比例的丙酮與812包埋劑（3∶1?1∶1?1∶3）于37 ℃下進(jìn)行滲透包埋2～4 h，繼續(xù)用純812包埋劑處理5～8 h后，倒入包埋板于60 ℃烤箱聚合48 h，制成樹(shù)脂塊后，用超薄切片機(jī)切成60～80 nm的薄片，用150目方華膜銅網(wǎng)撈片。銅網(wǎng)于2%醋酸鈾飽和乙醇溶液避光染色8 min；70%乙醇清洗3次；超純水清洗3次；2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min；超純水清洗3次，濾紙稍吸干。銅網(wǎng)切片放入銅網(wǎng)盒內(nèi)室溫干燥過(guò)夜。最后用日立HT7700透射電鏡（HITACHI，日本）進(jìn)行細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.4 咖啡堿含量的測(cè)定

取一芽二葉材料冷凍干燥后研磨成粉，精確稱(chēng)取0.2 g，用70%甲醇-水溶液于70 ℃水浴浸提10 min，3 500 r·min^-1離心10 min取上清液，過(guò)0.45 μm有機(jī)微孔濾膜后，用于HPLC上機(jī)測(cè)定。檢測(cè)方法如下：色譜柱為Phenomenex C₁₂色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈；線性梯度洗脫，0～42 min，4%～18.7%"B，42～43 min，18.7%～4%"B；柱溫40 ℃，流速1.0 mL·min^-1，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量10 μL。具體方法參考文獻(xiàn)[17]。每組樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取平均值，并利用SPSS軟件中的單因素ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

1.5 CsTCS1基因表達(dá)量的測(cè)定

取一芽二葉立即置于﹣80 ℃液氮速凍，按照南京諾唯贊公司RNA提取試劑盒（FastPure Universal"Plant Total RNA Isolation Kit）的方法進(jìn)行茶樹(shù)葉片總RNA提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量和完整性，利用Biospec-Nano（島津，日本）測(cè)定RNA濃度。按照北京天根公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastKing gDNA Dispelling"RT SuperMix）進(jìn)行cDNA合成，置于﹣20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)CsTCS1基因編碼區(qū)序列，利用NCBI在線軟件Primer-blast設(shè)計(jì)qPCR特異引物（上游：ACTACGGGGAAGGTGAACG；下游：GCGAATGTGTTTGGACCCG），以CsGAPDH為內(nèi)參基因（上游：TTGGCATCGTTGAGGGTCT；下游：CAGTGGGAACACGGAAAGC）。按照南京諾唯贊公司Taq Pro Universal"SYBR qPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)體系，利用CFX Connect熒光定量PCR儀（伯樂(lè)，美國(guó)）進(jìn)行qPCR反應(yīng)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用方法來(lái)計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量^[18]。

1.6"CsTCS1原位雜交分析

根據(jù)CsTCS1基因編碼區(qū)序列，將引物末端加地高辛標(biāo)簽，進(jìn)行探針合成。取芽下第一葉新鮮組織，切成塊后立即置于50%"FAA固定液（福爾馬林、冰醋酸和50%乙醇混合液，三者體積分?jǐn)?shù)分別為5%、5%、90%）中固定12 h以上。在通風(fēng)櫥內(nèi)切取約3 mm厚的組織，經(jīng)由低到高濃度梯度的乙醇溶液進(jìn)行脫水，使用透明劑二甲苯進(jìn)行浸蠟包埋。用切片機(jī)切片（約4 μm厚），攤片機(jī)撈片后，62 ℃烤箱烤片2 h。將切片依次放入脫蠟透明液15 min、脫蠟透明液15 min、無(wú)水乙醇5 min、無(wú)水乙醇5 min、85%乙醇5 min、75%乙醇5 min，再用焦碳酸二乙酯（DEPC）水浸泡清洗。切片于修復(fù)液中煮沸10～15 min，自然冷卻后基因筆畫(huà)圈，滴加蛋白酶K（20 μg·mL^-1）于37 ℃消化。純水沖洗后用PBS洗3次，每次5 min。探針雜交過(guò)程如下：（1）滴加預(yù)雜交液，40℃孵育1 h；（2）傾去預(yù)雜交液，滴加含探針雜交液，恒溫箱雜交過(guò)夜；（3）洗去雜交液，2×SSC，40 ℃洗10 min；1×SSC，40℃洗10 min；0.5×SSC室溫洗10 min；（4）滴加封閉血清液，室溫孵育30 min；（5）傾去血清封閉液，滴加堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記鼠抗地高辛抗體，37 ℃孵育2 h后，用TBS洗4次，每次5 min；（6）滴加BCIP/NBT顯色液，顯微鏡觀察陽(yáng)性后，用純水沖洗；（7）自然風(fēng)干后，用甘油明膠封片，置于顯微鏡下觀察。

1.7 CsTCS1亞細(xì)胞定位分析

設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的上游引物（cagtGGTCTCacaacatggagctagctactgcgggg）及下游引物（cagtGGTCTCatacatccatcaatcttggaaagcactaggatgatac）。經(jīng)PCR反應(yīng)、DNA切膠回收、酶切及連接反應(yīng)，將目標(biāo)基因CsTCS1連接至pBWA（V）HS-GFP載體；進(jìn)一步經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌、菌落PCR和測(cè)序驗(yàn)證后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，通過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)，將重懸菌液注射煙草葉片下表皮，弱光培養(yǎng)2 d，并做好標(biāo)記；將標(biāo)記葉片制成玻片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。以上試驗(yàn)委托武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同黃化茶樹(shù)種質(zhì)葉片的表型比較分析

以白雞冠茶樹(shù)及其自然雜交后代的不同黃化單株為材料，其新梢葉色表型如圖1所示。通過(guò)測(cè)定芽下第一葉的葉綠素相對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)不同黃化單株葉片的SPAD值為4.57～24.93，呈現(xiàn)為L(zhǎng)＞HH＞HL＞BJG＞H。與葉色表型一致，隨著葉片黃化程度的加深，其SPAD值也相應(yīng)降低。其中L的葉片SPAD值顯著高于BJG、HL、H和HH，差異可達(dá)2.1～5.5倍；HH的SPAD值顯著高于其他黃化葉片（BJG、HL和H）；BJG與HL的葉色相近，其SPAD值無(wú)顯著差異。H的SPAD值最低，黃化程度最深。

2.2 不同黃化茶樹(shù)種質(zhì)葉片的超微結(jié)構(gòu)的比較

通過(guò)透射電鏡對(duì)不同黃化茶樹(shù)種質(zhì)的葉片超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)BJG、HL、H、HH與L的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在明顯差異：正常綠色葉片具有清晰完整的葉綠體結(jié)構(gòu)，而葉色黃化變異后的葉片中葉綠體數(shù)量減少，面積變小，葉綠體結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)為不同程度的損傷（圖2）。其中，BJG與HL的葉片超微結(jié)構(gòu)相似，可觀察到少量的基粒片層結(jié)構(gòu)，但基粒片層堆疊顯著減少，類(lèi)囊體無(wú)法正常堆疊形成明顯的基粒結(jié)構(gòu)。隨著葉片黃化程度的加深，H中葉綠體結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，僅剩單層類(lèi)囊體結(jié)構(gòu)，無(wú)明顯基粒片層堆疊。有趣的是，H和HH中淀粉粒數(shù)量明顯增加；與H相比，HH葉片的葉綠體結(jié)構(gòu)有較多保留，可以觀察到部分類(lèi)囊體堆疊。此外，還可發(fā)現(xiàn)在不同黃化茶樹(shù)葉片中，葉綠體結(jié)構(gòu)的受損程度與葉片SPAD值變化規(guī)律一致。以上結(jié)果說(shuō)明葉綠體結(jié)構(gòu)的變化與葉色黃化變異緊密相關(guān)。

2.3 不同黃化茶樹(shù)種質(zhì)葉片的咖啡堿含量與CsTCS1基因表達(dá)量分析

基于BJG與HL在表型、SPAD值及葉片超微結(jié)構(gòu)等方面的相似性，選取白雞冠茶樹(shù)自然雜交后代的不同黃化單株L、HL、H和HH為材料用于后續(xù)試驗(yàn)。通過(guò)HPLC測(cè)定咖啡堿含量，發(fā)現(xiàn)不同黃化茶樹(shù)種質(zhì)中的咖啡堿含量存在差異，變化幅度為31.65～36.30 mg·g^-1，其中以H中咖啡堿含量最高，其次是L和HL，HH中咖啡堿含量最低（圖3A）。通過(guò)qPCR測(cè)定CsTCS1基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)CsTCS1在H中表達(dá)量最高，其次是HL、L和HH（圖3B）。且CsTCS1基因表達(dá)模式與咖啡堿含量分布規(guī)律一致，其相關(guān)性系數(shù)為0.889^**（P＜0.01）。因此將CsTCS1作為咖啡堿合成的關(guān)鍵酶用于后續(xù)咖啡堿合成部位的研究。

2.4 不同黃化茶樹(shù)種質(zhì)葉片中CsTCS1的表達(dá)部位分析

利用原位雜交技術(shù)對(duì)CsTCS1在細(xì)胞及亞細(xì)胞水平上的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行探究，如圖4所示，帶有AP標(biāo)記的抗地高辛抗體與地高辛標(biāo)記的CsTCS1雜交體結(jié)合，經(jīng)BCIP/NBT染色顯出的陽(yáng)性表達(dá)為藍(lán)紫色，表達(dá)量越高，顯色越深。結(jié)果表明，在不同黃化茶樹(shù)種質(zhì)葉片的各類(lèi)型細(xì)胞中均檢測(cè)到了CsTCS1的表達(dá)信號(hào)，且表達(dá)部位基本相同，以葉肉細(xì)胞中柵欄組織的表達(dá)信號(hào)最強(qiáng)，其次是維管束；此外，TCS1在

上表皮、下表皮和海綿組織也有分布。與qPCR結(jié)果一致，CsTCS1在H中的表達(dá)信號(hào)最強(qiáng)，尤以柵欄組織和維管束最為明顯（圖4A）。在亞顯微水平上，以細(xì)胞核中CsTCS1的表達(dá)信號(hào)最強(qiáng)（圖4B，白色箭頭標(biāo)注），在質(zhì)膜上也有表達(dá)信號(hào)。對(duì)葉脈中CsTCS1的表達(dá)部位進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)CsTCS1表達(dá)信號(hào)在上表皮、下表皮、木質(zhì)部和韌皮部均有分布（圖4C）。

2.5 茶樹(shù)CsTCS1的亞細(xì)胞定位分析

為了進(jìn)一步確定CsTCS1蛋白在亞細(xì)胞水平上的表達(dá)部位，將空載和融合有CsTCS1基因的GFP表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，侵染煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，觀察CsTCS1在煙草表皮細(xì)胞中的分布情況。如圖5所示，對(duì)照（空載體）的GFP熒光信號(hào)在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜上均有分布；而目標(biāo)蛋白的熒光信號(hào)主要分布在細(xì)胞核和質(zhì)膜上（白色箭頭標(biāo)注），與葉綠體自發(fā)的紅色熒光信號(hào)基本無(wú)重合。表明CsTCS1主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)上，這與CsTCS1原位雜交的結(jié)果一致。

3 討論

咖啡堿作為茶葉中的特征性次生代謝物，學(xué)者們對(duì)其合成途徑、代謝調(diào)控等方面開(kāi)展了

大量研究。前人研究結(jié)果表明，茶樹(shù)中的咖啡堿主要在葉片中進(jìn)行合成和積累，且以幼嫩部位含量最高^[2-3]。但在亞細(xì)胞水平上，咖啡堿的合成部位仍不明確。在早期研究中，Kato等^[19]以3-NMT為標(biāo)記蛋白，對(duì)茶樹(shù)中咖啡堿的亞細(xì)胞合成部位進(jìn)行了初步探究。通過(guò)茶樹(shù)幼嫩葉中的葉綠體分離及純化，對(duì)3-NMT酶活和葉綠素含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)3-NMT蛋白活性峰值與葉綠素分布峰值相對(duì)應(yīng)，表明咖啡堿合成與葉綠體密切相關(guān)。由于柵欄組織含有較多葉綠體，作者推測(cè)茶樹(shù)葉片柵欄組織的葉綠體可能是咖啡堿合成的主要場(chǎng)所。Breda等^[20]通過(guò)免疫組織化學(xué)方法和激光共聚顯微鏡焦掃描探究了茶樹(shù)幼嫩葉中咖啡堿的解剖定位，結(jié)果表明，咖啡堿分布在維管束細(xì)胞，主要是在前體韌皮部中積累，推測(cè)咖啡堿在葉綠體的光合細(xì)胞中形成后被轉(zhuǎn)運(yùn)至維管束細(xì)胞中積累。由此可見(jiàn)，茶樹(shù)中咖啡堿合成的亞細(xì)胞部位研究，仍停留于推測(cè)論證階段，缺乏直接的試驗(yàn)性證據(jù)。

近幾年，特異葉色茶樹(shù)種質(zhì)資源陸續(xù)被發(fā)掘利用，尤其是黃化茶樹(shù)成為新品種選育及推廣的熱點(diǎn)。相關(guān)研究表明，黃化茶樹(shù)葉片的葉綠體結(jié)構(gòu)異常，發(fā)生退化，甚至解體，基粒片層和類(lèi)囊體膜結(jié)構(gòu)發(fā)育受阻，卻仍有咖啡堿的積累，且大部分黃化茶樹(shù)葉片中的咖啡堿含量與普通綠色茶樹(shù)相當(dāng)^[14-16]。如果咖啡堿在葉綠體中合成，為什么黃化茶樹(shù)葉片中仍有咖啡堿累積？這與前人的“茶樹(shù)葉片中咖啡堿在葉綠體中合成”這一推測(cè)相悖，茶樹(shù)中咖啡堿合成的亞細(xì)胞定位仍有待進(jìn)一步明確。

因此，本研究以白雞冠茶樹(shù)自然雜交后代單株的一芽二葉為材料，通過(guò)葉綠素相對(duì)含量測(cè)定、葉片超微結(jié)構(gòu)觀察、咖啡堿含量及CsTCS1基因表達(dá)量測(cè)定、CsTCS1原位雜交及亞細(xì)胞定位，對(duì)不同黃化茶樹(shù)種質(zhì)中的咖啡堿合成部位進(jìn)行研究。結(jié)果表明，與正常綠色葉片相比，黃化茶樹(shù)葉片的葉綠素相對(duì)含量均顯著下降（圖1B），葉綠體數(shù)量及面積減少，其葉綠體結(jié)構(gòu)均受到不同程度的破壞（圖2）。在中黃2號(hào)^[14]、湘妃翠^[15]、白葉1號(hào)^[21]、華白1號(hào)^[22]、黃金芽^[23]和福黃1號(hào)^[24]等黃化茶樹(shù)中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，表明葉綠體結(jié)構(gòu)的變化是茶樹(shù)葉色黃化變異的直接原因^[25]。通過(guò)咖啡堿含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)咖啡堿積累與葉色黃化變異或葉綠體結(jié)構(gòu)變化并無(wú)直接關(guān)聯(lián)，即使在葉綠體受損程度最嚴(yán)重的黃化葉片中，仍有較高含量的咖啡堿積累，甚至顯著高于正常綠色葉片中的咖啡堿含量（圖3A），這與前人研究結(jié)果一致。王麗鴛等^[16]通過(guò)對(duì)葉色特異茶樹(shù)的生化成分測(cè)定，發(fā)現(xiàn)大部分黃（白）化茶樹(shù)品種的咖啡堿含量與正常綠色品種相當(dāng)。婁艷華等^[26]對(duì)14個(gè)黃（白）化茶樹(shù)品種（系）的葉綠素和生化成分含量進(jìn)行分析比較，也發(fā)現(xiàn)了不同黃（白）化茶樹(shù)品種（系）中葉綠素SPAD值與咖啡堿含量無(wú)明顯相關(guān)性。進(jìn)一步通過(guò)qPCR測(cè)定基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)咖啡堿合成途徑的關(guān)鍵基因CsTCS1與咖啡堿顯著正相關(guān)（圖3）。Mohanpuria等^[27]以4個(gè)茶樹(shù)品種的不同組織部位為材料，發(fā)現(xiàn)咖啡堿集中分布茶樹(shù)新梢幼嫩組織，包括頂芽、芽下第一葉、第二葉和嫩莖，而成熟葉及老葉中咖啡堿含量顯著減少；且茶樹(shù)中CsTCS1的基因表達(dá)也呈現(xiàn)出高度一致的變化規(guī)律。李金等^[28]以10個(gè)茶樹(shù)品種的一芽二葉為材料，通過(guò)測(cè)定咖啡堿含量及其合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，CsTCS1基因表達(dá)量與咖啡堿含量呈顯著正相關(guān)。前人諸多研究也均證實(shí)了CsTCS1在咖啡堿合成中的重要性，其基因表達(dá)水平在一定程度上決定了茶樹(shù)中咖啡堿的含量及嘌呤類(lèi)生物堿的組成^[8-10]。在早期研究中，Kato等^[19]以CsTCS1作為標(biāo)記蛋白對(duì)茶樹(shù)中咖啡堿的亞細(xì)胞合成部位進(jìn)行了探究，但由于研究方法及技術(shù)的局限，相關(guān)研究進(jìn)展緩慢。

本研究進(jìn)一步通過(guò)原位雜交技術(shù)對(duì)不同黃化茶樹(shù)種質(zhì)中CsTCS1的表達(dá)部位進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，在不同黃化茶樹(shù)種質(zhì)葉片中，CsTCS1在黃化葉片H中的表達(dá)信號(hào)最強(qiáng)，與qPCR結(jié)果一致。無(wú)論是在葉綠體結(jié)構(gòu)完整的綠色葉片，或是葉綠體結(jié)構(gòu)受損的黃化葉片中，CsTCS1的表達(dá)部位基本相同。在細(xì)胞水平上，CsTCS1主要在柵欄組織細(xì)胞中表達(dá)，此外，在上表皮、下表皮、維管束細(xì)胞中也有分布。與前人研究結(jié)果一致，李遠(yuǎn)華等^[29]對(duì)福鼎大白茶、梅占、上梅州和龍井43茶樹(shù)葉片中的CsTCS1表達(dá)部位進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)不同品種中CsTCS1的表達(dá)信號(hào)存在差異，但表達(dá)位置基本相似，即主要分布在柵欄組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。福鼎大白茶、福鼎大毫茶和福安大白茶中CsTCS1的原位雜交信號(hào)也主要分布在葉片柵欄組織細(xì)胞^[30]。在亞細(xì)胞水平上，CsTCS1主要在細(xì)胞核中表達(dá)，此外，在細(xì)胞質(zhì)上也有分布（圖4）；CsTCS1蛋白在煙草表皮細(xì)胞的亞細(xì)胞定位分析也得出了一致的結(jié)果（圖5）。與CsTCS1具有較高序列相似度的苦茶堿合成酶也定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)^[31]。Teng等^[32]從富含可可堿的野生茶樹(shù)中鑒定獲得了可可堿合成酶，發(fā)現(xiàn)它定位于細(xì)胞核?？Х戎械目Х葔A合成關(guān)鍵酶也均定位于細(xì)胞質(zhì)^[33-34]。此外，茶樹(shù)中SAM合成酶及產(chǎn)物也均分布在細(xì)胞質(zhì)^[4]。綜上所述，咖啡堿合成途徑的相關(guān)酶類(lèi)均定位在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，是咖啡堿合成的主要部位。

本研究通過(guò)對(duì)不同黃化茶樹(shù)種質(zhì)葉片的細(xì)胞超微結(jié)果觀察和咖啡堿含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在葉綠體不同受損程度的葉片中，仍有大量咖啡堿積累，甚至超過(guò)正常綠色葉片。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)關(guān)鍵基因CsTCS1表達(dá)量的測(cè)定、原位雜交及亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)CsTCS1在不同黃化茶樹(shù)葉片中的表達(dá)信號(hào)強(qiáng)度存在差異，但表達(dá)部位基本相同，主要分布在柵欄組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。本研究明確了茶樹(shù)葉片中咖啡堿主要在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中合成，而不是葉綠體。這有助于全面闡釋茶樹(shù)中的咖啡堿代謝過(guò)程，為后續(xù)咖啡堿合成后的轉(zhuǎn)運(yùn)及儲(chǔ)存過(guò)程研究奠定理論基礎(chǔ)。

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