基于網絡藥理學對發(fā)花茶?；钚猿煞值念A測分析

摘要：茶梗對茯茶發(fā)花的感官品質產生明顯影響，為探究茯茶中發(fā)花茶梗的活性成分及作用靶點，通過純化的冠突曲霉菌LJSC.2006（GenBank accession number：MZ147020）對茶梗發(fā)花，以非靶向代謝組學（LC-MS/MS）、網絡藥理學進行預測分析，運用分子對接驗證?；谄钚《伺袆e分析（OPLS-DA）篩選獲得發(fā)花茶梗與原茶梗的非靶向代謝組學差異代謝產物295種，其中碳水化合物41種、有機酸37種、酚類及其衍生物33種、萜類化合物27種、胺類26種、含氮雜環(huán)化合物24種、酯類21種、糖苷類19種、黃酮及其衍生物15種、氨基酸及其衍生物14種、類固醇及其衍生物9種、生物堿9種、酚酸6種、香豆素及其衍生物6種、兒茶素及其衍生物1種和其他7種。網絡藥理學分析結果表明，發(fā)花茶梗有16個潛在活性成分，作用于248個靶點，通過蛋白質互作（PPI）篩選得到13個潛在核心靶點。根據分子對接結果，初步預測香豆雌酚、高良姜素、木犀草素和藏紅花酸是發(fā)花茶梗的主要核心活性成分。EGFR、ESR1、SRC和PTGS2是發(fā)花茶梗作用的主要核心靶點。

關鍵詞：冠突曲霉LJSC.2006；茶梗；非靶向代謝組學；網絡藥理學

中圖分類號：S571.1；R972⁺.6 """""""""""文獻標識碼：A """""""""""文章編號：1000-369X（2024）04-665-18

Prediction"and Analysis of Active Components"in"Tea Stem Fermented Product Based on Network"Pharmacology

HE Haotian¹， XIAO Juanjuan¹， TANG Yiyu¹， LUO Mi¹，"LIU Zhonghua^{1，2，3，4*}， YU Lijun^{1，2，3，4*}

1. Key Lab of Education Ministry of Hunan Agricultural University for Tea Science，"Changsha 410128， China; 2. National Research Center of Engineering and Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients， Changsha 410128， China; 3. Co-Innovation Center of Education Ministry for Utilization of Botanical Functional Ingredients， Changsha 410128， China; 4. Key Laboratory for Evaluation and Utilization of Gene Resources of Horticultural Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs of China，Changsha 410128， China

Abstract："Tea stem has"a significant impact on the sensory quality for"Fucha fermentation product. To explore the active ingredients"and"targets of tea stems"in Fucha， Aspergillus cristatus"LJSC.2006"（GenBank accession number： MZ147020）"was used to ferment tea stem and obtain the end products."Non-targeted metabolomics （LC-MS/MS），"network pharmacology， and molecular docking"were used to verify the experimental results. Based on partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）， 295"kinds"of non-targeted metabolites with differential expression between the fermented"tea stem"and raw tea stem"were identified， including 41 carbohydrates， 37 organic acids， 33 phenols and derivatives， 27 terpenoids， 26 amines， 24 nitrogen-containing heterocyclic compounds， 21 esters， 19 glyeosides， 15 flavonoids and derivatives， 14 amino acids and derivatives， 9 steroids and derivatives， 9 alkaloids， 6 phenolic acids， 6 coumarins and derivatives， 1 catechin and derivatives and 7 others. The network pharmacological analysis show that there were 16 potential active ingredients"acting on 248"targets， and 13 potential central"targets were obtained through Protein-Protein"Interaction （PPI） screening."According to the results of molecular docking， coumestrol， galangin， luteolin and crocetin were the main central"active ingredients."EGFR， ESR1， SRC and"PTGS2"were the main"targets of tea stem"fermented by Aspergillus cristatus.

Keywords："Aspergillus cristatus"LJSC.2006， tea stem， non-targeted metabolomics， network pharmacology

茯磚茶通過冠突曲霉菌^[1]對茶葉基質的內含成分進行發(fā)花轉化，使得其具有調節(jié)腸道菌群^[2]、降脂減肥^[3]、調節(jié)免疫^[4]等功效。相關研究表明，茶樹不同部位的嫩莖內含成分比幼嫩芽葉更為豐富^[5-6]，且春季新梢茶梗的氨基酸大量積累^[7]，可為茯磚茶發(fā)花期間的品質轉化提供物質條件。由傳統(tǒng)加工經驗可知，茯磚茶茶坯中含有一定量的嫩梗有助于金花茂盛生長，提升茶湯甜醇回甘的滋味品質。對湖南不同廠家的黑毛茶進行散茶發(fā)花試驗發(fā)現，含梗的金花散茶滋味更加醇和、回甘度提升^[8-9]。由此可知，茯茶中的茶梗對其滋味醇甜度的增加具有重要貢獻。

網絡藥理學是基于物質代謝組學的活性成分與功能靶點的網絡模型分析^[10]，將復雜的藥理作用抽象表達為網絡，進而分析網絡模型，揭示“成分-靶點-疾病”的復雜關系，預測相關活性成分和可能作用的機制。茶葉領域已有代謝組學及網絡藥理學的綜合研究，分析了綠茶多重生物活性成分的“藥物-靶點-通路-疾病”相互作用網絡^[11]，茶花對高脂誘導小鼠酒精性脂肪肝的藥理作用機制^[12]，茯磚茶對非酒精性脂肪肝的干預作用及靶點^[13]和降血糖^[14]的作用機制。通過將代謝組學與網絡藥理學進行有機結合，為茶葉相關生化成分的體內外驗證試驗提供了研究方向與理論基礎。

茶梗是茯茶品質形成的重要組成部分，但其發(fā)花過程中的物質代謝組學與其網絡藥理學的內在聯(lián)系，暫未看到相關研究的文獻報道。為深入探明發(fā)花茶梗代謝物的變化及潛在功用，本研究以從一級黑毛茶中篩分出的幼嫩茶梗為主要原料，對其進行散茶發(fā)花、獲得發(fā)花茶梗。以發(fā)花茶梗的非靶向代謝組學為基礎，結合網絡藥理學分析預測發(fā)花茶梗的活性成分與潛在的作用靶點，并進行分子對接驗證，以期為發(fā)花茶梗的目標功能成分的開發(fā)提供指導。

1"材料與方法

1.1 試驗材料與設備

1.1.1 供試材料

冠突曲霉Aspergillus cristatus"LJSC.2006（從優(yōu)質茯磚茶中分離純化得到，儲藏于湖南農業(yè)大學茶學教育部重點實驗室）在M40Y瓊脂斜面上保存，28 ℃培養(yǎng)7 d，儲存于4 ℃冰箱備用。

試驗發(fā)花用的茶梗（來自湖南華萊生物科技有限公司，湖南省安化縣）從一級黑毛茶中獲得，經過齒切、篩分，初步實現葉梗分離。通過靜電揀梗獲得相對較純的茶梗，再齒切茶梗獲得長短規(guī)格相對一致的茶坯，其茶梗占比90%左右，用于散茶發(fā)花。

1.1.2 試劑

甲醇、甲酸、醋酸銨均為色譜純，購自美國Thermo Fishe公司。

1.1.3"主要設備

Q Exactive? HF-X質譜儀、Vanquish UHPLC色譜儀、Hypesil Gold column（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱，Thermo Fisher公司；D3024R低溫離心機，Scilogex公司（美國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶梗固態(tài)發(fā)花

茶梗散茶發(fā)花參考Xu等^[15]的方法進行，基本工藝流程：茶?！Q樣→復水→滅菌→接種→發(fā)酵（發(fā)花）→干燥→發(fā)花茶梗。具體操作：1 000 g茶梗復水至含水量達到30%左右，轉入發(fā)酵容器121 ℃滅菌20 min，置于超凈工作臺備用；28 ℃活化培養(yǎng)冠突曲霉菌液至其孢子懸液濃度達1×10⁶～1×10⁷個·mL^-1；對每100 g茶梗接種7.5 mL孢子懸液，混勻后在28 ℃、濕度為80%的恒溫恒濕微生物培養(yǎng)箱中發(fā)酵16 d；收集發(fā)花16 d的茶梗（G16）儲存在無菌聚乙烯袋中，未發(fā)花的茶梗（G0）作為對照處理樣，一同置于﹣80 ℃冷凍保存以備分析測試。

1.2.2"茶梗感官審評

茶梗感官審評方法參考羅密等^[9]的散茯茶審評方法，對原茶梗及發(fā)花茶梗的外形、湯色、香氣、滋味、葉底5個因子進行審評，加評金花菌的附著程度和顆粒顏色。稱取3.0 g干茶樣于150 mL審評杯，依次加入100 ℃的純凈水，加蓋浸泡5 min后，茶湯依次瀝入評茶碗中，評湯色、嗅香氣、嘗滋味后，加評葉底。

1.2.3 非靶向代謝組學試驗方法

非靶向代謝組學樣品的制備和提?。喝?00 mg樣本置于EP管，加入500 μL的80%甲醇水溶液渦旋振蕩，冰浴靜置5 min，15 000 r·min^-1、4 ℃離心20 min；取一定量上清液，加質譜級水稀釋至甲醇含量53%；15 000 r·min^-1、4 ℃離心20 min，收集上清液，進樣LC-MS分析^[16]。每個試驗樣本取等體積混勻作為質量控制（Quality control，QC）樣本，以評估LC-MS/MS的重現性和穩(wěn)定性。

基于UHPLC-Q Exactive? HFX-LC-MS/MS分析：使用Vanquish UHPLC系統(tǒng)（Thermo Fisher Germany，Waltham，MA，USA）進行LC-MS/MS分析，該系統(tǒng)具有Hypesil Gold column色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm；Thermo Fisher，Milford，MA，USA），該柱與Q Exactive? HFX質譜儀（Thermo Fisher Germany，Waltham，MA，USA）耦合。正模式的流動相A為0.1%甲酸，流動相B為甲醇；負模式的流動相A為5 mmol·L^-1醋酸銨、pH"9.0，流動相B為甲醇；梯度洗脫程序：0～1.5 min （2%"B）、1.5～12 min（2%～100%"B）、12～14 min（100%"B）、14.0～14.1 min（100%～2%"B）、14.1～17.0 min（2%"B）直至結束。進樣量1 μL、柱溫40 ℃、流速0.2 mL·min^-1。

Q Exactive? HFX質譜儀在質荷比（m/z）200～1 500全掃描范圍內以負電離和正電離模式運行。ESI源設置：噴淋電壓，3.2 kV；護套氣體流量，40 psi；輔助氣體流速，10 L·min^-1；毛細管溫度，320 ℃；離子導入射頻電平40%；輔助燃氣加熱器溫度，350 ℃；MS/MS二級掃描為數據相關掃描。

發(fā)花茶梗代謝產物的鑒定：將茶梗發(fā)花樣及原茶梗對照樣的非靶向代謝組學原始數據文件導入CD 3.1搜庫軟件中處理，對代謝物進行保留時間、質荷比等參數篩選，設置保留時間偏差0.2 min和質量偏差5 mg·L^-1，進行峰對齊；為使鑒定更準確，設置質量偏差5 mg·L^-1、信號強度偏差為30%、信噪比為3、最小信號強度、加和離子等，進行峰提取、比對和集成?；贚inux操作系統(tǒng)（CentOS版本6.6）及軟件R、Python進行數據處理，使用mzCloud數據庫、mzVault數據庫和MassList數據庫對鑒定到的代謝物進行定性比較和注釋，選用3個數據庫中在質量容差范圍內能匹配上的代謝物，共1 296種。

代謝產物的檢索和整理：利用HMDB（https：//hmdb.ca）、ChemSpider（https：//www.chemspider.com）、PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）等化合物數據庫，對發(fā)花茶梗中已鑒定到的代謝產物的分子線性輸入規(guī)范結構式（Simplified molecular input line entry system，SMILES）、CAS號、化學名稱、化合物分類等信息收集整理。

1.2.4 網絡藥理學分析方法

活性成分篩選及靶點預測：將茶梗發(fā)花樣及原茶梗樣的非靶向代謝組學差異代謝物的 SMILES輸入SWISS"ADME網站（http：//www.swissadme.ch），以胃腸道吸收（GI absorption）顯示為“High”，類藥性（Drug-likeness，DL）項下的Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge至少滿足3個“Yes”為標準進行初篩。將初篩的差異代謝物的CAS號輸入TCMSP平臺（https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、DL≥0.18^[17-18]，篩選出潛在活性成分。將茶梗發(fā)花樣潛在活性成分的SMILES輸入Swiss Target Prediction網站^[19]"（http：//www.swissta-rgetprediction.ch），設置物種為“Homo Sapiens”，對潛在活性成分的干預靶點進行分析，導出Swiss"Target"Prediction"數據表，以Probability≥0.1篩選出潛在靶點。將潛在活性成分和潛在靶點導入Cytoscape 3.8.2，剔除Degree≤1的節(jié)點，得到“潛在活性成分-潛在靶點”網絡圖。

蛋白質互作（Protein-protein"interaction，PPI）網絡分析及潛在核心靶點篩選：將茶梗發(fā)花樣的潛在靶點信息的基因名導入STRING（https：//www.string-db.org），物種選擇“Homo sapiens”，進行蛋白質互作網絡分析。保存PPI圖，并將分析數據導入Cytoscape 3.8.2進行解析。以解析結果中的點度中心性（Degree centrality，DC）、中介中心性（Between centrality，BC）和接近中心性（Closeness centrality，CC）值進行篩選，先以三者的中位數進行初篩，再調整篩選數值復篩，得到潛在核心靶點。

發(fā)花茶梗的基因本體（Gene ontology，GO）功能富集分析與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of"genes and genomes，KEGG）通路分析：將茶梗發(fā)花樣的潛在靶點和潛在核心靶點的基因名導入DAVIO數據庫（https：//david.ncifcrf.gov）進行數據分析。下載生物過程（Biological process，BP）、細胞組分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）等文件進行GO功能富集分析；下載KEGG分析文件進行KEGG通路分析。在微生信可視化云平臺（http：//bioinformatics.com.cn）中根據所得數據繪制GO分析柱狀圖及KEGG分析氣泡圖。

“潛在活性成分-潛在核心靶點-潛在核心通路”網絡圖的構建：將茶梗發(fā)花樣的潛在活性成分、潛在核心靶點和潛在核心通路分別導入Cytoscape 3.10.1，剔除Degree=0的節(jié)點，得到“潛在核心成分-潛在核心靶點-潛在核心通路”網絡圖。

“核心活性成分-核心靶點”的分子對接及對接結果可視化：將茶梗發(fā)花樣的核心活性成分設為配體，茶梗發(fā)花樣的核心靶點設為受體。從PubChem網站中下載配體的SDF文件，用Chem3D"15.0對其進行能量最低處理并改為PDB格式。從RCSB PDB網站（https：//www."rcsb.org）中下載受體的PDB文件，利用Pymol 2.5.7軟件對受體進行去水、去配體處理。采用AutoDockTools-1.5.7對配體與受體進行分子對接，并用Pymol 2.5.7進行分子對接可視化驗證。

1.2.5 數據整理與統(tǒng)計分析

通過Microsoft Excel"2019對試驗數據進行整理，并計算出差異倍數（Fold Change，FC）；利用SPSS"26.0進行單因素ANOVA檢驗，獲得P值（P"value）；利用SIMCA"14.1進行正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），并得到變量投影重要性（Variable important of projective，VIP）。以P＜0.05、VIP≥1、FC≥2或FC≤0.5為標準，對差異代謝物進行篩選，通過TBtools v2.042進行差異代謝物熱圖繪制。

2"結果與分析

2.1"茶梗發(fā)花后的感官品質變化

從感官審評拍攝的圖片（圖1）可發(fā)現：茶梗發(fā)花后，其感官品質特征變化明顯，干茶色澤由原來的黃褐色轉為金黃色，布滿金花；內質審評發(fā)現，湯色由黃亮轉為橙紅較亮，葉底色澤由黃綠色轉變?yōu)楹诤謳Ъt，香氣由花果香轉變成典型的菌香；滋味由醇和轉變?yōu)榇己?、回甘?/p>

2.2"發(fā)花茶梗的非靶向代謝組學分析

對發(fā)花茶梗及其原茶梗的非靶向代謝組學結果進行OPLS-DA分析。如圖2A所示，主成分1和主成分2分別解釋了模型中總體方差的70.80%和4.41%，發(fā)花茶梗G16和原茶梗G0明顯分離并位于中軸兩側，在第一主成分上有明顯分離趨勢，說明經過冠突曲霉發(fā)花后茶梗內含物質差異明顯。對該模型的穩(wěn)定性做進一步研究，采用排列檢驗200次的交叉驗證模型進行檢驗。如圖1B所示，Q²回歸線與縱軸的相交點小于零（R²=0.928，Q²=﹣0.244），說明模型不存在過擬合，驗證有效，認為該結果可用于發(fā)花茶梗與原茶梗的代謝物差異分析。

為進一步闡明發(fā)花茶梗G16與原茶梗G0代謝產物的具體差異，以VIP≥1、P＜0.05、FC≥2或FC≤0.5為標準進行篩選。共得到295種差異代謝物，16個分類，其中碳水化合物41種、有機酸37種、酚類及其衍生物33種、萜類化合物27種、胺類26種、含氮雜環(huán)化合物24種、酯類21種、糖苷類19種、黃酮及其衍生物15種、氨基酸及其衍生物14種、類固醇及其衍生物9種、生物堿9種、酚酸6種、香豆素及其衍生物6種、兒茶素及其衍生物1種和其他7種化合物。采用TBtools v2.042軟件進行熱圖制作（圖3），可直觀地觀察發(fā)花茶梗G16與原茶梗G0差異代謝物的含量變化情況。由圖3可知，茶梗經冠突曲霉菌發(fā)花后，經篩選得到的發(fā)花茶梗的差異代謝物種類豐富；與原茶梗相比，其含量變化主要表現為上升趨勢。

茶梗發(fā)花后的差異代謝物的種類及數量變化情況如表1所示。254個代謝產物含量上升，41個代謝產物含量下降。不同種類差異代謝物呈現上升數量高于下降數量的現象，但氨基酸及其衍生物與糖苷類呈現下降趨勢，其中氨基酸及其衍生物下降數量與上升數量差異明顯，下降數量是上升數量的2.5倍。

2.3"發(fā)花茶梗潛在活性成分篩選與潛在靶點預測

為探究發(fā)花茶梗的潛在活性成分，利用Swiss ADME數據庫和TCMSP平臺對以上篩選

得到的295種差異代謝物進行潛在活性成分篩選，其中胃腸道吸收程度（GI absorption）與口服生物利用度（OB）分別反映了被吸收入人體血液循環(huán)中的潛在活性成分占其口服攝入量的吸收程度與吸收比例^[17]；類藥性五規(guī)則（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）與類藥性（DL）反映了差異代謝物是否具備作為潛在藥物的能力^[18]。共篩選出16個潛在活性成分，如表2所示，黃酮及其衍生物有6個，碳水化合物、酚類、萜類和生物堿均有2個，含氮雜環(huán)化合物和酯類分別有1個潛在活性成分，以上潛在活性成分在圖3中含量均顯著上升。該結果表明，發(fā)花茶梗的潛在活性成分可能主要為黃酮及其衍生物。

為探究發(fā)花茶梗的潛在活性成分可能作用的蛋白靶點，通過Swiss Target Prediction對以上16個潛在活性成分的靶點信息進行預測，以Probability≥0.1作為篩選標準，通過去除重復的靶點后得到447個靶點信息。由此可知，發(fā)花茶梗的潛在活性成分可能影響的靶點較為豐富，但前人尚未對以上篩選得到的活性成分與靶點的潛在關聯(lián)進行系統(tǒng)研究，后續(xù)研究可對其進行相關試驗論證。

為使發(fā)花茶梗的潛在活性成分和潛在靶點的潛在關系可視化，將潛在活性成分及預測靶點導入Cytoscape 3.10.1，剔除Degree≤1的節(jié)點，得到“潛在活性成分-潛在靶點”網絡圖（圖4）。分析網絡圖拓撲參數，共生成264個節(jié)點，858條邊，紅色圓形代表潛在活性成分，黃色菱形代表靶點基因。圖中有16個潛在活性成分，248個潛在靶點。網絡圖中的節(jié)點以度（Degree）值表達，Degree值表示網絡中節(jié)點與節(jié)點相連的邊數，Degree值越大，潛在活性成分形狀越大，在網絡圖中關聯(lián)的靶點越多，進一步說明該潛在活性成分對人體靶點的干預潛力越大。圖中每個活性成分作用于多個靶點，其中Galangin（Degree 119）影響靶點最多，Miltirone（Degree 4）影響靶點最少。

圖4表明發(fā)花茶梗具備作用于多個蛋白靶點的潛力，后期可對圖中蛋白靶點相關聯(lián)的通路進一步探究。

2.4"發(fā)花茶梗的PPI構建及潛在核心靶點篩選

將圖4的發(fā)花茶梗的潛在靶點基因名導入STRING進行PPI分析，保存其潛在靶點互作網絡圖（圖5）并下載數據分析文件，將其導入Cytoscape 3.8.2，計算靶點的點度中心性（DC）、中介中心性（BC）和接近中心性（CC）。首先以三者的中位數進行初篩，再調整數值進行篩選，最后以DC≥0.50、BC≥0.01、CC≥0.55為標準篩選出核心靶點。結果見表3，共篩選出13個潛在核心靶點，其聚集于圖5的PPI圖中最密集處，靶點與靶點之間相互關聯(lián)，互有影響，推測發(fā)花茶梗的潛在活性成分主要作用于潛在核心靶點來發(fā)揮功用。

2.5"發(fā)花茶梗的GO功能和KEGG通路分析

為探究發(fā)花茶梗的內含成分在基因功能與信號通路中的作用，將發(fā)花茶梗的潛在靶點（圖3）與潛在核心靶點（表4）分別錄入DAVIO數據庫，對潛在靶點與潛在核心靶點的GO功能和KEGG通路進行分析。

GO分析由生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）組成。發(fā)花茶梗的GO分析共得到1 003個條目，BP有675個條目，CC有128個條目，MF有200個條目。分別選取發(fā)花茶梗潛在靶點與潛在核心靶點的BP、CC、MF的P值較小的前10個條目繪制梯度水平條形圖（圖6A、圖6C）。通過分析潛在靶點與潛在核心靶點的相同條目，可以得出發(fā)花茶梗具有的潛在GO功能，BP主要為信號轉導（Signal transduction）、細胞凋亡過程的負調控（Negative regulation of apoptotic process）；CC主要為細胞質（Cytoplasm）、胞漿（Cytosol）、質膜（Plasma membrane）、膜筏（Membrane raft）；MF主要為蛋白質結合（Protein binding）、相同蛋白質結合（Identical protein binding）、酶結合（Enzyme binding）。由以上分析可得出，發(fā)花茶梗的內含成分可能主要在細胞的細胞質與細胞膜等部位，通過蛋白質結合和酶結合等分子功能對信號轉導與細胞凋亡的負調控等生物過程進行調節(jié)。

發(fā)花茶梗的KEGG分析共富集了149條通路，分別選取發(fā)花茶梗潛在靶點與潛在核心靶點P值較小的前20個的代謝通路繪制氣泡圖（圖6B、圖6D），并且將潛在靶點與潛在核心靶點的重合通路設為潛在核心通路。通過分析以上通路，可以得出發(fā)花茶梗的潛在核心通路有癌癥途徑（Pathways in cancer）、化學致癌-受體活化（Chemical carcinogenesis-receptor activation）、癌癥中的蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、內分泌抵抗（Endocrine resistance）、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）。由以上分析可以得出，發(fā)花茶?？赡苤饕饔糜诎┌Y通路中的蛋白聚糖與受體，并且對人體內分泌的調節(jié)和EGFR酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性也具

有調控潛力。此外，潛在靶點影響的P值最小的通路為神經活性配體-受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction），潛在核心靶點影響的P值最小的通路為脂質和動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis），且兩者Gene Ratio值也相對較高，由此也可推測以上通路雖未歸為潛在核心通路，但具有被發(fā)花茶?；钚猿煞指深A的潛力。

2.6"發(fā)花茶梗的“潛在核心成分-潛在核心靶點-潛在核心通路”網絡構建

將發(fā)花茶梗的潛在活性成分、潛在核心靶點和潛在核心通路導入Cytoscape 3.10.1進行網絡圖制作，將Degree=0的節(jié)點去除，結果見圖7。網絡圖中有潛在活性成分12個，潛在核心靶點10個，潛在核心通路5個。對網絡圖7拓撲參數進行分析，結果顯示Degree值前三的潛在活性成分均為黃酮及其衍生物，Coumestrol（Degree 8）、Luteolin（Degree 6）、Galangin（Degree 6）；Degree值前三的潛在核心靶點為EGFR（Degree 14）、ESR1（Degree 12）、SRC（Degree 11）；前3個潛在核心通路為Pathways in cancer（Degree 8）、Proteoglycans in cancer（Degree 6）、Chemical carcinogenesis receptor activation（Degree 6）。可以得出，發(fā)花茶梗的潛在核心活性成分可能主要作用于與癌癥相關的靶點與通路，進而發(fā)揮茶梗潛在的藥理功能。

2.7"發(fā)花茶梗的分子對接結果及可視化驗證

在分子對接中，配體與受體構象穩(wěn)定性能量越低，相互作用的可能性越大，結合能≤﹣5.00 kcal·mol^-1表明分子之間具有良好的結合活性^[20]。將“潛在核心成分-潛在核心靶點-潛在核心通路”網絡圖中，潛在活性成分作為配體，潛在靶點作為受體，進行分子對接。以配體對接成功數大于3、受體對接成功數大于3、且配體與受體位于最低結合能時有氫鍵生成為標準，篩選出核心活性成分與核心靶點（表4）。核心活性成分與核心靶點對接結果的最低結合能均小于﹣5.00 kcal·mol^-1，表明發(fā)花茶梗的核心活性成分Coumestrol、Galangin、Luteolin、Crocetin與核心靶點EGFR、ESR1、SRC、PTGS2之間具有較高的結合活性。

將上述篩選得到的核心活性成分，香豆雌酚、高良姜素、木犀草素、藏紅花酸作為配體，核心靶點EGFR、ESR1、SRC、PTGS2作為受體，進行分子對接展示（圖8）。結果表明，配體與受體之間均能生成氫鍵，且部分對接結果存在配體與受體的多個氨基酸殘基相連的現象，表明核心成分與核心靶點之間具有較高的生物活性。

3"討論

本研究對發(fā)花茶梗與原茶梗的非靶向代謝組學分析結果，與茯磚茶和散茶發(fā)花進程中代謝物的變化趨勢不完全相同。代謝組學研究結果發(fā)現，發(fā)花茶梗的黃酮及其衍生物含量上升，與文獻[8-9，21]中關于散茶發(fā)花的HPLC分析結果的變化趨勢不同，但與Li等^[22]關于茯磚茶代謝產物在加工時期變化的研究結果趨勢相似；酚酸及其衍生物含量上升，與Xiao等^[21]和Li等^[22]研究的變化趨勢均不同；氨基酸及其衍生物與糖苷類含量降低，這與湯依鈺等^[8]和羅密等^[9]研究中的變化趨勢相似，產生以上變化的原因可能是試驗中基質和菌株的不同。推測冠突曲霉LJSC.2006對茶梗發(fā)花，可使其包括黃酮和酚酸類在內的化合物含量上升。同時，冠突曲霉需利用發(fā)花基質中的營養(yǎng)物質維持生長繁殖，使得茯茶中氨基酸和糖苷類化合物含量下降^[23]。

通過網絡藥理學對發(fā)花茶梗的潛在活性成分進行分析預測，獲知其主要活性成分為黃酮及其衍生物，香豆雌酚、高良姜素、木犀草素和藏紅花酸為核心活性成分，與癌癥、內分泌抵抗等代謝通路相關的EGFR、ESR1、SRC和PTGS2為其核心靶點。香豆雌酚是一種存在于豆制品中的類黃酮物質，目前已知其與雌激素受體（Estrogen receptor，ER）具有高親和力^[24]，在驗證香豆雌酚對去卵巢小鼠代謝功能障礙的保護作用中，證明其可影響ESR1與ESR2的蛋白表達，且香豆雌酚與ESR2親和力更強^[25]，但ESR1在乳腺癌細胞中的凋亡潛力可能高于ESR2^[26]。目前，香豆雌酚對EGFR、SRC、PTGS2研究尚未見前人研究論證，僅對以香豆雌酚作為活性成分的“黃芪-當歸-大棗”方劑進行探究，該方劑可降低氣血兩虛小鼠中PTGS2蛋白的表達，進而達到養(yǎng)氣補血的功效^[27]。高良姜素在姜科植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）根中和蜂膠中含量豐富，是一種重要的天然活性的黃酮化合物^[28-29]。其對ESR1的研究尚未提及，在已知驗證試驗中，高良姜素可抑制A549肺癌細胞的增殖，且與藥物吉非替尼聯(lián)用具有協(xié)同增效機制，但僅能顯著降低p-EGFR的蛋白表達，未能顯著改變EGFR的蛋白表達水平^[30]；高良姜素可通過抑制SRC等蛋白靶點，阻斷凝血素誘導的人神經母細胞瘤細胞系（SK-N-SH）中基質金屬蛋白酶（MMP-9）的表達，其可能是治療腦炎性疾病的潛在候選藥物^[31]；高良姜素還可通過抑制PTGS2的mRNA表達，有效地保護腎上皮細胞（NRK-52E）免受尿酸誘導的腎臟炎癥^[32]。木犀草素是廣泛存在于多種植物中的天然黃酮化合物^[33]，其藥理功能已被較為深入的探究，對EGFR、ESR1、SRC、PTGS2的研究均有涉及。Huang等^[34]將木犀草素作用于巨噬細胞的炎癥模型，可降低EGFR、SRC蛋白表達水平和mRNA表達水平，具有抗炎藥物的開發(fā)潛力；Yu等^[35]通過結合網絡藥理學與肝癌細胞（Hepatocellular carcinoma，HCC）體外試驗，驗證木犀草素可使ESR1上調，顯著抑制HCC細胞的增殖和遷移，誘導細胞凋亡，證明木犀草素具有抗肝癌的藥理作用；Wang等^[36]通過建立香煙煙霧和脂多糖誘導的ICR小鼠的慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型，證明三子養(yǎng)親湯中的木犀草素可顯著降低EGFR、PTGS2在模型組的蛋白表達水平，因此木犀草素可能具備治療COPD的潛力。藏紅花酸是存在于藏紅花（Crocus sativus L.）中的重要生物活性物質^[37]，對PTGS2的影響尚未有試驗論證。Zheng等^[38]通過構建鏈脲霉素（Streptozotocin）誘導的妊娠期糖尿?。℅estational diabetes，GDM）大鼠模型，證實藏紅花酸可顯著改變EGFR的mRNA表達水平，對鏈脲霉素誘導的GDM大鼠具有保護作用；Cui等^[39]通過對頭頸部鱗狀癌細胞（HNSCC）的體外試驗，證明藏紅花酸可顯著抑制HNSCC細胞的遷移和愈合效率，并降低ESR1的mRNA表達水平；但在Mohan等^[40]研究中，藏紅花酸并沒有顯著改變HCC中SRC的蛋白表達水平，但藏紅花酸具有抵抗HCC增殖的活性。以上核心活性成分與核心靶點之間，大部分已被前人通過構建相關體內或體外模型進行論證，得到了較為可信的生物數據，證明其與以上核心通路關系較為密切。本研究中“核心活性成分-核心靶點”的相關性仍未得到充分研究，接下來可將其作為未來藥理試驗的研究方向進一步分析論證。此外，本研究與前人對茯茶的網絡藥理學研究中篩選出的核心活性成分和核心靶點不同^[13-14]，推測這可能與本研究中的試驗菌株和發(fā)花基質存在關聯(lián)。

4"結論

茶梗發(fā)花后代謝產物種類豐富，且含量總體呈上升趨勢，但氨基酸及其衍生物與糖苷類的代謝物含量下降，并且氨基酸及其衍生物的代謝產物下降比例最為明顯；通過網絡藥理學與分子對接及其可視化驗證，發(fā)花茶梗的主要活性成分為黃酮及其衍生物，預測具有較高生物活性的香豆雌酚、高良姜素、木犀草素和藏紅花酸為核心活性成分，與癌癥、內分泌抵抗等代謝通路相關的EGFR、ESR1、SRC和PTGS2為核心靶點。推測經由冠突曲霉LJSC.2006通過對茶梗進行發(fā)花處理，發(fā)花后可使茶梗中的核心活性成分的含量升高，并使其作用于核心靶點，對癌癥和內分泌抵抗等潛在核心通路進行調控，進而對部分癌癥及內分泌相關疾病起到改善與緩解的功用。后續(xù)研究可嘗試對茶梗進行液態(tài)發(fā)酵，比較不同發(fā)花方式的代謝產物差異，并構建相關疾病的動物或細胞模型，驗證發(fā)花茶梗活性成分對核心靶點的影響機制，進而完善“核心活性成分-核心靶點-核心通路”協(xié)同作用的途徑與機制，可為后續(xù)開發(fā)茯茶功能產品提供新思路。

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