Aspergillus cristatus LJSC.2006的分離鑒定及對(duì)茯茶發(fā)花品質(zhì)的影響

摘要：為探究自行分離純化菌株LJSC.2006對(duì)湖南茯茶主要黑毛茶發(fā)花品質(zhì)的影響，綜合菌落平皿形態(tài)、孢子電鏡掃描特征、菌絲體分子標(biāo)記鑒定結(jié)果，確定菌株LJSC.2006為冠突曲霉菌（Aspergillus cristatus LJSC.2006，GenBank登錄號(hào)：MZ147025）。運(yùn)用感官審評(píng)、生化成分分析、HS-SPME/GC-MS揮發(fā)性組分分析等方法比較黑毛茶及其發(fā)花茶樣的滋味、香氣品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)黑毛茶發(fā)花后干茶色澤加深，金花滿披，菌香顯露，滋味醇和；滋味成分黃酮、茶多酚、可溶性糖、游離氨基酸、酯型兒茶素、楊梅素、槲皮素含量總體呈下降趨勢(shì)；香氣成分增加，醛類、酯類相對(duì)含量增多，苯乙烯和雪松醇為黑毛茶共有香氣成分，（E）-芳樟醇-3，7-氧化物和苯乙酮為發(fā)花茶樣共有香氣成分；黑毛茶發(fā)花后，水楊酸甲酯、（E，E）-2，4-庚二烯醛、（E）-芳樟醇-3，7-氧化物、（E）-呋喃氧化芳樟醇、（E）-2-壬醛、（E）-2-已烯醛、（E）-2-（Z）-6-壬二烯醛、苯乙酮、（E）-2-壬烯醛及香葉酸甲酯等10種特征性揮發(fā)成分相對(duì)含量明顯上升，綜合形成了金花散茶的菌花香。

關(guān)鍵詞：冠突曲霉菌；菌種鑒定；黑毛茶；金花散茶；發(fā)花品質(zhì)

中圖分類號(hào)：S571.1；TS272.5⁺4 """"""""""文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A""""""""""""文章編號(hào)：1000-369X（2024）04-639-16

Isolation and Identification of Aspergillus cristatus"LJSC.2006 and Its Effect on Fu Tea’s Quality

XIAO Juanjuan¹， CHENG"Ying²， LIU Yan³， LIU Qiaofang¹， JIANG Ating¹， HUANG Jian'an^{1，4，5，6}，WANG Kunbo^{1，4，5，6}， LIU Zhonghua^{1，4，5，6}， WANG Zhenhong^2*， YU Lijun^{1，4，5，6*}

1. Key Lab of Ministry Education of Hunan Agricultural University for Tea Science， Changsha 410128， China; 2. College of Resources and Environment， Xizang Agricultural and Animal Husbandry University， Linzhi 860000， China; 3. Yiyang Testing Institute of Product"and Commodity Quality Supervision， Yiyang 413099， China; 4. National Research Center of Engineering and Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients， Changsha 410128， China; 5. Co-Innovation Center of Education Ministry for Utilization of Botanical Functional Ingredients， Changsha 410128， China; 6. Key Laboratory for Evaluation and Utilization of Gene Resources of Horticultural Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs of China， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China

Abstract："This study investigated"the effect of self-isolated and purified strain LJSC.2006 on the quality of Hunan Fu tea， a primary dark tea. Strain LJSC.2006 was identified as Aspergillus"cristatus"（Aspergillus"cristatus"LJSC.2006， GenBank accession number： MZ147025） through colony plate morphology， spore electron microscopy， and mycelial molecular marker identification."Sensory evaluation， biochemical composition analysis and head space solid phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry methods were applied to assess the flavor and aroma qualities of dark tea raw materials and fermented Jinhua loose tea. The results indicate that compared with the primary dark tea， the"fermented"loose tea sample exhibited a"deeper color， the golden flowers，"a"richer fungus aroma， and a mellower taste. After fermentation by Aspergillus cristatus"LJSC.2006， there was a decrease in the levels of flavor quality components such as tea polyphenols， soluble carbohydrates， free amino acids， flavonoids， ester-catechins， myricetin， quercetin and kaempferol. The aroma components， esters and aldehydes of the loose tea samples"increased after fermentation. Styrene and cedrol were the common aroma components in the primary dark tea. （E）-linalool 3，7-oxide and acetophenone were the common aroma components in the fermented loose tea. Additionally， ten characteristic volatile components relative content were significantly increased， including methyl salicylate， （E，E）-2，4-heptadienal， （E）-linalool-3，7-oxide， （E）-furan oxidized linalool， （E）-2-nonanal， （E）-2-hexenal， （E，Z）-6-nonanal， acetophenone， （E）-2-nonanal， and methyl vanillate， which together contributed to the distinctive fungal fragrance of Jinhua loose tea.

Keywords： Aspergillus cristatus， fungi strain identification， primary dark tea， Jinhua loose tea， fermented quality

“金花”菌是茯茶“發(fā)花”品質(zhì)特征形成的優(yōu)勢(shì)益生菌，其數(shù)量與質(zhì)量是衡量茯茶品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)^[1]?！敖鸹ā本貌枞~中的內(nèi)含物質(zhì)進(jìn)行生命活動(dòng)，并使發(fā)花茯茶菌香凸顯、澀感降低、醇和回甘^[2]。藥理學(xué)研究表明，茯茶富集了茶多糖、茶褐素等生物活性物質(zhì)，具有降血糖^[3]、降血脂^[4]、改善糖脂代謝^[5]、調(diào)節(jié)腸道菌群^[6]、調(diào)節(jié)免疫^[7]等功效。湖南茯茶加工主要是以櫧葉齊、云臺(tái)大葉、桃源大葉3個(gè)茶樹品種制得的黑毛茶為原料，毛茶鮮葉采摘成熟度較高，內(nèi)含成分豐富，制茶品質(zhì)優(yōu)良，黑毛茶加工后一些廠家還會(huì)進(jìn)行七星灶熏煙、剔梗等工序處理，形成了安化黑茶的特征風(fēng)味^[8]。

研究顯示，“金花”菌存在變種或亞種^[9]，安化茯茶品質(zhì)的差異可能與金花菌種的發(fā)酵密切相關(guān)。當(dāng)前“金花”菌的鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)觀察或?qū)ζ鋬?nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）序列比對(duì)分析，導(dǎo)致鑒定結(jié)果存在爭(zhēng)議，出現(xiàn)“一菌多名”的現(xiàn)象^[1]。齊祖同等^[10]早期從茯磚茶中將“金花”菌分離鑒定為冠突散囊菌（Eurotium cristatum），目前多采用該命名法，但根據(jù)最新國(guó)際植物命名法規(guī)，已將散囊菌屬（Eurotium）內(nèi)菌種移入曲霉屬（Aspergius）^[11]。呂嘉櫪等^[12]通過形態(tài)觀察結(jié)合ITS區(qū)序列比對(duì)分析，將從陜西茯茶中分離得到的“金花”菌鑒定為針刺曲霉（Aspergillus spiculosus）、阿姆斯特丹曲霉（Aspergillus amstelodami）、謝瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）。已有研究表明，β-微管蛋白（β-tubulin，BenA）基因、鈣調(diào)蛋白（Calmodulin，CaM）基因及RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，RPB2）基因可用于曲霉屬真菌的區(qū)分和鑒定^[11]。譚玉梅等^[13]利用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，將貴州地區(qū)茯磚茶中的8株金花菌鑒定為冠突曲霉。本研究基于湖南茯茶的差異特征，收集湖南多個(gè)茯茶加工廠、歷史年份跨度大的茯茶產(chǎn)品，從中分離純化出表觀形態(tài)特征差異顯著的金花菌株LJSC.2006，綜合形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)金花菌株LJSC.2006進(jìn)行準(zhǔn)確分類鑒定，進(jìn)而以其作為唯一菌種對(duì)湖南茯茶加工的3種主要黑毛茶原料進(jìn)行發(fā)花，分析發(fā)花前后茶葉滋味品質(zhì)、香氣組分的差異，以期為今后茯茶新菌種資源LJSC.2006的工廠化生產(chǎn)與綜合應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

優(yōu)質(zhì)茯磚茶原料來自湖南省益陽茶廠有限公司、湖南省白沙溪茶廠股份有限公司、湖南華萊生物科技有限公司、中茶湖南安化第一茶廠有限公司，從中分離純化金花菌株LJSC.2006，使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA）試管斜面保存，儲(chǔ)存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。黑毛茶樣品由湖南安化代表性茶廠提供（編號(hào)1、3、5、7、9、11），金花散茶參照Xu等^[14]方法發(fā)花得到（編號(hào)2、4、6、8、10、12），具體信息如表1所示。菌種分離純化、鑒定培養(yǎng)、散茶發(fā)花等均在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 主要試劑

RNase A、Taq"Buffer（含Mg²⁺）、dNTP Mixture、λ"DNA/Hind Ⅲ、Taq"DNA Polymerase、GelStain核酸染料、DNA Marker購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；N，N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙腈（色譜純）購(gòu)自美國(guó)天地有限公司；沒食子酸、可可堿和兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；槲皮素、楊梅素和山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自成都曼斯特生物科技公司；異丙醇、氯仿、異戊醇、氯化芐、福林酚、甲醇、碳酸鈉、茚三酮、磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、三氯化鋁、蒽酮、硫酸（分析純）等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

SEM-6380LV型掃描電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；IX71倒置式顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Gene Genius型號(hào)凝膠成像系統(tǒng)，英國(guó)Syngene公司；Veriti PCR儀，新加坡Applied Biosystems公司；LC1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；UV-1750型紫外可見分光光度計(jì)、LC-M20A型分析型高效液相色譜、GC/MS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、PDMS/DVB固相微萃取頭，美國(guó)Supelco公司。

1.4 冠突曲霉菌分離鑒定

1.4.1 分離純化

采用真菌分離純化培養(yǎng)技術(shù)，根據(jù)菌落質(zhì)地、顏色等形態(tài)特征從優(yōu)質(zhì)茯磚茶中進(jìn)行初步分離，再經(jīng)3～5次劃線、分離、純化，得到菌落形態(tài)純凈的菌株接種于PDA平皿固體培養(yǎng)基，于28 ℃、相對(duì)濕度80%的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～7 d，再轉(zhuǎn)接于試管斜面培養(yǎng)3～4 d，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 平板菌落形態(tài)及光學(xué)顯微鏡觀察

菌落形態(tài)觀察：分離純化的冠突曲霉菌采用三點(diǎn)法接種于PDA固體培養(yǎng)基中，于28 ℃、相對(duì)濕度80%的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～10 d，定期觀察其菌落發(fā)展、發(fā)育形態(tài)。

光學(xué)顯微鏡觀察：將無菌蓋玻片以約45°角度插入PDA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌絲擴(kuò)展至蓋玻片處，從4 d開始，每隔2～3 d取下代表性蓋玻片，在載玻片上點(diǎn)1～2滴棉藍(lán)染色液，沿蓋玻片一側(cè)小心放上，趕出氣泡、于光學(xué)顯微鏡下觀察孢子及菌絲體形態(tài)。

1.4.3 電鏡觀察

將目標(biāo)菌種接種至PDA固體培養(yǎng)基，于28 ℃、相對(duì)濕度80%的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14～21 d，從成熟的菌落表面刮下孢子、涂布、干燥制片，用掃描電鏡觀察其分生孢子、子囊孢子及其他結(jié)構(gòu)。

1.4.4 PCR擴(kuò)增

將分離純化得到的LJSC.2006進(jìn)行平板涂布，28 ℃培養(yǎng)3～4 d，用無菌不銹鋼小鏟收集菌絲體，超聲波振蕩、氯化芐法提取并純化基因組DNA；引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[15-18]（表2），基因序列擴(kuò)增反應(yīng)體系為2×San Taq"PCR Mix"2.5 μL，模板DNA 5 μL（50 ng），上下游引物（10 pmol·μL^-1）各1 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL，擴(kuò)增程序參考史云峰等^[19]方法。PCR產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4.5 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

下載Hubka等^[11]關(guān)于曲霉屬曲霉組分類系統(tǒng)的各種衍生模式（Ex-type）菌株及外類群榛色鉤囊菌Hamigera avellanea（Thom amp; Turesson）Stolk amp; Samson的上述基因序列，在MEGA"7中分別與菌株LJSC.2006對(duì)應(yīng)基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。將基因比對(duì)結(jié)果合并后在MEGA"7中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。最大似然法（Maximum likelihood）采用Kimura 2-parameter+G模型，自展（Bootstrap）1 000次檢驗(yàn)。

1.5"發(fā)花茶樣制備

金花散茶制備參考Xu等^[14]的方法進(jìn)行，基本工藝流程：黑毛茶→稱樣→復(fù)水→滅菌→接種→發(fā)花→干燥→金花散茶成品。

工藝參數(shù)：（1）稱取黑毛茶100.00 g置于三角瓶中；（2）黑毛茶均勻噴水至終含水量約為30%，靜置2～4 h待水分分布均勻；（3）將三角瓶封口后于121 ℃滅菌20 min，取出置于超凈工作臺(tái)中冷卻至室溫；（4）接入7.5 mL活化的LJSC.2006菌液（菌液的孢子懸液密度為每毫升1×10⁶～1×10⁷個(gè)）；（5）于28 ℃、相對(duì)濕度80%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)花10～14 d，觀察到冠突曲霉菌孢子分布整瓶茶樣后終止發(fā)酵；（6）70～80 ℃烘90～120 min至含水量小于10%，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6"感官審評(píng)方法

感官審評(píng)參考GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》進(jìn)行，審評(píng)小組由3名具有長(zhǎng)期審評(píng)經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)技術(shù)人員和2名茶學(xué)專業(yè)研究生組成。將12個(gè)茶樣分為黑毛茶和發(fā)花散茶組，分組評(píng)定其外形、湯色、香氣、滋味、葉底，發(fā)花組加評(píng)金花菌的附著程度和顆粒顏色，對(duì)茶樣每項(xiàng)審評(píng)因子進(jìn)行打分，最終結(jié)果進(jìn)行加權(quán)計(jì)算獲得總分。

1.7"化學(xué)品質(zhì)成分分析

水浸出物含量、茶多酚含量、游離氨基酸含量的測(cè)定分別參照GB/T 8305—2013、GB/T 8313—2018、GB/T 8314—2013進(jìn)行；可溶性糖含量測(cè)定采用硫酸-蒽酮比色法，黃酮含量測(cè)定采用三氯化鋁比色法^[20]。

沒食子酸、咖啡堿、可可堿、兒茶素含量檢測(cè)參照Samanidou等^[21]方法，試液制備采用常規(guī)浸提（GB/T"8313—2018），浸提液過0.45 μm纖維膜備測(cè)。A相為0.2%磷酸，B相為乙腈甲醇溶液（V_甲醇∶V_乙腈=95∶5），色譜柱為Welchrom C₁₈柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流速0.8 mL·min^-1，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，進(jìn)樣量10 μL。

楊梅素、槲皮素、山柰酚含量的測(cè)定參考李家華等^[22]方法，色譜柱為Welchrom C₁₈柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），流動(dòng)相A為0.2%磷酸，B相為100%甲醇，梯度洗脫，流速為1 mL·min^-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

1.8"香氣成分檢測(cè)

GC-MS檢測(cè)方法：稱取2.0 g磨碎茶樣于20 mL萃取瓶中，封口，于80 ℃水浴平衡10 min，然后將老化好的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，吸附50 min后取出，隨即插入儀器進(jìn)樣口，于250 ℃解析5 min，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集分析。

GC條件：HP-88石英毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm），進(jìn)樣口溫度240 ℃，流速1.37 mL·min^-1。升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃保持5 min；以3 ℃·min^-1升至140 ℃，保持5 min；以5 ℃·min^-1升至210 ℃，保持10 min；以5 ℃·min^-1升至240 ℃，保持10 min。不分流進(jìn)樣，載氣為He。

MS條件：離子源（EI），離子源溫度200 ℃，轉(zhuǎn)接口溫度220 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍為荷質(zhì)比（m/z）45～500。

1.9"數(shù)據(jù)處理

采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，使用SPSS"19.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示有顯著差異；使用GraphPad Prism"7、聯(lián)川生物云平臺(tái)、SIMCA"14.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)圖形制作；根據(jù)總離子流圖、NIST"17譜庫(kù)檢索，根據(jù)保留時(shí)間和質(zhì)譜確認(rèn)揮發(fā)性成分，結(jié)合文獻(xiàn)、篩選相似度大于80%的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析；采用峰面積歸一化法計(jì)算揮發(fā)性成分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 金花菌LJSC.2006的形態(tài)學(xué)及分子鑒定

2.1.1 菌落平皿生長(zhǎng)形態(tài)

金花菌LJSC.2006菌株4、7、10 d生長(zhǎng)形態(tài)如圖1A～圖1F所示，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落色澤加深、形態(tài)增大、色素分泌增多；菌落外圈呈黃色，中央由褐黃色轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤稚?，背面外圈由淺黃色轉(zhuǎn)為黃色，中央黃色轉(zhuǎn)為深褐色；同心圓狀菌落直徑明顯增大，中央內(nèi)陷，逐漸呈現(xiàn)輻射狀褶皺，內(nèi)圈有黑色小水珠分泌，褐色色素大量擴(kuò)散于培養(yǎng)基中。黑毛茶接種LJSC.2006菌發(fā)花過程中，能明顯觀察到“金花”生長(zhǎng)，且散茶“金花”繁密程度（圖1G）優(yōu)于輕壓茯茶（1H）。

2.1.2"光學(xué)顯微鏡下孢子的發(fā)育進(jìn)程

光學(xué)顯微鏡視野中（圖1I～圖1L）可觀察到菌絲有隔膜，呈不對(duì)稱分枝，子囊果混生于菌絲中，呈近球形或梨形（圖1I）；閉囊殼無子座，無孔口，內(nèi)有大量球形或近球形子囊呈不規(guī)則排列（圖1J）；成熟后，閉囊殼無規(guī)則破裂釋放包含子囊孢子的子囊，子囊呈球形或近球形（圖1K、圖1L）。

2.1.3 孢子電鏡形態(tài)觀察

在掃描電鏡下對(duì)LJSC.2006菌進(jìn)行觀察（圖1M～圖1P），分生孢子頭呈較疏松的掃帚狀，孢梗莖長(zhǎng)100～250 μm，直徑7～12 μm；分生孢子串生在分生孢子頭上，主要呈橢球形，外壁粗糙且生有小刺，長(zhǎng)度在4～5 μm，直徑為3～4 μm（圖1M）；子囊果球形或近球形，直徑在100～150 μm（圖1N），易破裂釋放子囊，子囊呈球形或近球形（圖1O）；子囊成熟后釋放子囊孢子，子囊孢子呈雙凸鏡形，表面粗糙，具尖疣，“赤道”部分繞有兩圈縱向的“冠狀”凸起，每個(gè)孢子大小約（4～5） μm×（5～6） μm（圖1P）。

2.1.4"系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建及分析

僅使用ITS區(qū)不能對(duì)曲霉屬曲霉組內(nèi)的物種進(jìn)行有效區(qū)分。本研究經(jīng)過對(duì)ITS、BenA、CaM、RPB2雙向測(cè)序、拼接，最終獲得菌株LJSC.2006的ITS、BenA、CaM、RPB2序列。將BenA、CaM及RPB2序列比對(duì)結(jié)果合并，以榛色鉤囊菌（H. avellanea）為外類群構(gòu)建系

統(tǒng)發(fā)育樹，其他參考菌株的基因序列信息參考文獻(xiàn)[11]。由圖2可知，菌株LJSC.2006和A. cristatus"NRRL4222在99%置信度下屬于同一分支。根據(jù)形態(tài)特征和分子生物學(xué)特征，將LJSC.2006鑒定為冠突曲霉菌（A."cristatus）。

2.2 LJSC.2006對(duì)發(fā)花茶樣滋味品質(zhì)的影響

2.2.1 感官品質(zhì)分析

LJSC.2006為冠突曲霉菌家族中的成員，可能為新變種，用純化的LJSC.2006菌株對(duì)湖南主體黑毛茶進(jìn)行發(fā)花。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，湖南主體黑毛茶經(jīng)LJSC.2006發(fā)花后，感官品質(zhì)均顯著提升，提高了綜合評(píng)分（表3）。發(fā)花后，干茶色澤加深，油潤(rùn)度提高，條索勻齊度更佳，表面滿披金花（顆粒金黃飽滿）。發(fā)花后茶樣均有濃郁菌花香，不同黑毛茶樣品香氣品質(zhì)有所差異，經(jīng)熏煙處理的白沙溪茶廠茶樣ZBP、TBP黑毛茶發(fā)花后，還保留了獨(dú)特的松煙香。茶湯以橙黃明亮為主，發(fā)花茶樣湯色整體趨于一致，云臺(tái)山櫧葉齊ZAP發(fā)花后湯色由淺變深，白沙溪櫧葉齊ZBP湯色由渾濁轉(zhuǎn)明亮。此外，發(fā)花茶樣滋味更醇和、醇較厚，苦澀味減少；葉底色澤加深、葉質(zhì)變?nèi)彳洝?/p>

2.2.2 常規(guī)生化成分分析

由常規(guī)生化成分含量分析結(jié)果可知（表4），黑毛茶經(jīng)LJSC.2006發(fā)花后，水浸出物含量以上升為主，茶多酚和游離氨基酸含量下降，黃酮和可溶性糖含量無明顯的規(guī)律性變化。水浸出物含量增幅最大為TBP（12.21%），除YBP外，其余黑毛茶樣品發(fā)花后水浸出物含量不同程度上升。除了YAP、TBP發(fā)花后黃酮含量略微上升，其他黑毛茶樣品發(fā)花后黃酮含量均下降，YBP發(fā)花后降幅最大，達(dá)17.74%；ZBP發(fā)花后可溶性糖含量增幅最大，達(dá)29.52%，TAP發(fā)花后可溶性糖含量降幅最大，達(dá)17.31%；YBP發(fā)花后茶多酚含量降幅最大，達(dá)34.66%；TAP發(fā)花后游離氨基酸含量降幅最大，達(dá)35.02%。

2.2.3 HPLC化學(xué)組分分析

HPLC分析結(jié)果顯示（表5），黑毛茶經(jīng)LJSC.2006發(fā)花后，沒食子酸含量除ZBP外均顯著上升，咖啡堿含量變化以上升為主，可可堿升降皆有，兒茶素、楊梅素、槲皮素、山柰酚含量呈下降趨勢(shì)，但變化存在差異。黑毛茶發(fā)花后，沒食子酸含量總體上升，TAP增幅最大，達(dá)1 006.12%。咖啡堿除YAP、YBP外，其他黑毛茶發(fā)花后茶樣含量均上升，ZBP增幅最大，達(dá)18.18%。YAP、YBP和ZAP發(fā)花后可可堿含量下降，YAP降幅最大，達(dá)65.00%；TBP發(fā)花后可可堿增幅最大，達(dá)18.75%。大多數(shù)茶樣中酯型兒茶素（ECG、GCG、EGCG）、非酯型兒茶素（EGC、EC、DL-C）含量顯著下降，酯型兒茶素中ECG、GCG、EGCG均在ZAP發(fā)花后降幅最大，分別為95.00%、89.95%、95.88%；非酯型兒茶素中EGC和EC均在ZBP發(fā)花后降幅最大，分別為61.94%、54.97%；DL-C在TAP發(fā)花后樣品中降幅最大，達(dá)41.63%，在YAP和ZAP發(fā)花后樣品中增幅較大，分別為204.03%和185.00%。楊梅素、槲皮素、山柰酚含量呈下降趨勢(shì)，楊梅素與槲皮素均在YBP發(fā)花后樣品中降幅最大，分別達(dá)68.10%、60.00%，山柰酚含量在ZAP發(fā)花后樣品中降幅最大，達(dá)20.95%。

2.3 LJSC.2006對(duì)發(fā)花茶樣香氣組分的影響

2.3.1 主要香氣組分及相對(duì)含量的變化分析

所有茶樣通過HS-SPME/GC-MS共檢測(cè)出72種香氣成分（表6），包括碳?xì)漕?4種、醇類16種、醛類10種、酮類10種、酯類6種、酚類4種、內(nèi)酯類1種、含氮化合物6種、雜氧化合

物5種，其中碳?xì)漕悺⒋碱?、醛類香氣物質(zhì)相對(duì)含量較高，其次是酮類和酯類。黑毛茶經(jīng)LJSC.2006發(fā)花后，發(fā)花茶樣醛類和酯類香氣成分含量增加，除YBH外，其他茶樣均出現(xiàn)雜氧化合物，其他組分香氣成分基本降低（圖3A）。黑毛茶與其發(fā)花茶樣共有香氣49種，發(fā)花茶樣特有香氣成分16種，黑毛茶特有香氣成分7種（圖3B），所有黑毛茶發(fā)花后香氣成分種類增多（圖3C）。12個(gè)茶樣共有香氣物質(zhì)13種，苯乙烯和雪松醇為黑毛茶共有香氣成分，但在發(fā)花后消失，（E）-芳樟醇-3，7-氧化物和苯乙酮為發(fā)花后新產(chǎn)生的共有香氣成分（圖3D、圖3E）。

2.3.2 黑毛茶及發(fā)花茶樣特征性香氣物質(zhì)分析

對(duì)所有揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析（PCA），該模型R²X=0.430，Q²=0.023，擬合效果良好。PCA結(jié)果表明，黑毛茶與發(fā)花茶樣香氣成分存在顯著差異（圖4A）。為進(jìn)一步分析LJSC.2006發(fā)花對(duì)不同黑毛茶香氣成分的影響，構(gòu)建OPLS-DA模型，該模型擬合參數(shù)為R²X=0.483，Q²=0.899，表明具有較好的分離和預(yù)測(cè)能力。基于OPLS-DA模型制作Biplot圖（圖4B）和置換檢驗(yàn)圖（圖4C，n=200），Biplot圖表明黑毛茶與金花散茶的揮發(fā)性成分有明顯差異；置換檢驗(yàn)圖中Q²回歸線與縱軸的相交點(diǎn)小于0（R²=0.933，Q²=﹣0.282），說明OPLS-DA模型不存在過擬合，模型驗(yàn)證有效，該結(jié)果可用于黑毛茶發(fā)花前后鑒別分析。

根據(jù)OPLS-DA判定模型，以VIP＞1.0為黑毛茶發(fā)花前后茶樣特征化合物的篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選28種差異揮發(fā)性成分（圖4D），t檢驗(yàn)（Students’t）中P＜0.05的香氣成分有25。這25種成分為湖南黑毛茶經(jīng)LJSC.2006發(fā)花前后差異香氣成分，分別為苯乙酮、（E）-2-辛烯醛、（E）-芳樟醇3，7-氧化物、（E）-2-壬醛、（E）-2-（Z）-6-壬二烯醛、苯乙烯、（E）-2-已烯醛、異植物醇、5-甲基十五烷、（E）-橙花叔醇、橙花醇、（E，E）-2，4-庚二烯醛、異丁酸葉醇酯、水楊酸甲酯、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚、苯乙醇、雪松醇、香葉酸甲酯、（E）-氧化芳樟醇（呋喃類）、2-甲氧基苯甲酸甲酯、苯甲醇、香葉基丙酮、鄰苯二甲醚、2-乙?；量?、對(duì)丙基苯甲醚；其中水楊酸甲酯、（E，E）-2，4-庚二烯醛、（E）-芳樟醇-3，7-氧化物、（E）-氧化芳樟醇（呋喃類）、（E）-2-壬醛、（E）-2-已烯醛、（E）-2-（Z）-6-壬二烯醛、苯乙酮、（E）-2-壬烯醛及香葉酸甲酯等10種特征揮發(fā)性成分在發(fā)花后明顯上升，綜合形成了金花散茶的菌花香。

3 討論

結(jié)合真菌菌落形態(tài)、顯微觀察、孢子電鏡照片及菌絲體的多種類分子鑒定，從優(yōu)質(zhì)茯磚茶中自行分離出的金花菌被鑒定為冠突曲霉菌。與已有冠突曲霉菌的相關(guān)保守區(qū)域進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，LJSC.2006與已知的金花菌親緣關(guān)系密切，但也存在明顯的分支差異。本研究中分離的菌株LJSC.2006與彭曉赟等^[23]對(duì)湖南地區(qū)茯磚茶所鑒定的金花菌特征基本一致，子囊果之間無束狀菌絲相連，周圍菌絲分布不規(guī)則，子囊孢子表面粗糙、具尖疣，但菌株LJSC.2006生長(zhǎng)更快、色素分泌快且多。綜合分析其形態(tài)學(xué)特征及分子鑒定結(jié)果，推測(cè)菌株LJSC.2006可能為冠突曲霉菌的變種或亞種。金花菌是茯磚茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)菌種，不同產(chǎn)區(qū)茯磚茶中的金花菌存在種類多樣性，除冠突曲霉菌外，還有謝瓦氏曲霉（Aspergillus chevalieri），且兩者在形態(tài)學(xué)上十分相似^[24]。雖然形態(tài)學(xué)觀察在曲霉屬曲霉組的種類鑒定中具有重要的價(jià)值，但在外形相似的情況下，CaM、BenA或RPB2能夠提供更加準(zhǔn)確的鑒定依據(jù)^[11]。

以LJSC.2006對(duì)湖南安化主體黑毛茶進(jìn)行

散茶發(fā)花，發(fā)花后的產(chǎn)品外形與風(fēng)味品質(zhì)均有提升。干茶發(fā)花后表面均金花密布，菌香濃郁。經(jīng)熏煙處理的ZBP、TBP發(fā)花后在松煙香基礎(chǔ)上還有濃郁菌花香。ZAP和TAP發(fā)花后，水浸出物含量上升，黃酮、茶多酚、游離氨基酸、可溶性糖含量下降，苦澀味的酯型兒茶素顯著減少，沒食子酸含量上升，茶湯滋味向醇厚、醇和轉(zhuǎn)變，與Xiao等^[25]對(duì)冠突曲霉降低茶葉中苦澀味的研究結(jié)果相一致。發(fā)花過程中微生物生長(zhǎng)繁殖所消耗的碳源和氮源主要來自茶葉中的糖類和氨基酸，帶嫩梗的ZAP、YAP中兩者含量更高，發(fā)花后其滋味更醇和。黃酮醇類物質(zhì)楊梅素、槲皮素、山柰酚等含量以下降為主，經(jīng)過剔梗處理的YBP和TAP楊梅素、槲皮素含量較高，且發(fā)花后下降幅度最為顯著，可能是楊梅素、槲皮素在葉片中含量較高，冠突曲霉菌分泌的水解酶促進(jìn)了其轉(zhuǎn)化降解^[24]?？煽蓧A、咖啡堿等生物堿在茶葉中呈現(xiàn)苦味，結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，變化較小^[26]。

黑毛茶發(fā)花后花果香減弱，以菌香為主，部分帶有松煙香，與Li等^[27]研究結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)，橙花叔醇、苯乙醇、苯乙醛、香葉基丙酮、異丁酸葉醇酯等具有花香的物質(zhì)，以及帶果香的苯甲醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯相對(duì)含量降低，部分甚至消失，與審評(píng)結(jié)果相符。揮發(fā)性化合物水楊酸甲酯、芳樟醇和苯乙酮被認(rèn)為是茯磚茶“菌花香”“花香”和“薄荷”屬性的關(guān)鍵組分，這些香氣強(qiáng)度的增加與優(yōu)勢(shì)菌種冠突曲霉菌的代謝有關(guān)^[28]。黑毛茶發(fā)花后，呈冬青油、草藥香的水楊酸甲酯相對(duì)含量顯著升高^[29]。芳樟醇帶有柑橘果香、花香及木香，且香氣柔和、持久；芳樟醇氧化產(chǎn)物表現(xiàn)為較強(qiáng)的木香、花香、萜香、青香氣，（E）-氧化芳樟醇（呋喃類）、（E）-芳樟醇3，7-氧化物含量相對(duì)較高且發(fā)花后含量上升^[30]。（E，E）-2，4-庚二烯醛、（E）-2-壬醛、（E）-2-已烯醛等醛類化合物在金花散茶中含量較高，參與菌花香形成，對(duì)總體香氣有重要的潛在作用^[31]。雪松醇是一種倍半萜醇，帶有雪松木香甜而柔和的氣味，是茯磚茶中一種代表性化合物^[30]，但本研究發(fā)現(xiàn)其在發(fā)花后減少甚至消失，可能與冠突曲霉菌作為真菌將其轉(zhuǎn)化有關(guān)^[32]。

冠突曲霉菌LJSC.2006作為一種新型發(fā)花使用的金花菌種資源，對(duì)湖南茯茶加工的主體黑毛茶原料進(jìn)行散茶發(fā)花，發(fā)花進(jìn)程快，產(chǎn)品質(zhì)量可控。黑毛茶發(fā)花后感官品質(zhì)得到明顯提升，兒茶素類物質(zhì)減少，滋味醇較厚、醇和，剔梗處理使茶湯滋味更偏醇和；花果香轉(zhuǎn)變?yōu)榫ㄏ?，熏煙處理茶樣仍保有松煙香，形成以水楊酸甲酯、?em>E，E）-2，4-庚二烯醛、（E）-芳樟醇3，7-氧化物、（E）-氧化芳樟醇（呋喃類）、（E）-2-壬醛、（E）-2-已烯醛、（E）-2-（Z）-6-壬二烯醛、苯乙酮、（E）-2-壬烯醛、香葉酸甲酯為主體的菌花香。基于課題組前期研究，菌株LJSC.2001^[33]、LJSC.2005^[34]與LJSC.2006同為優(yōu)質(zhì)茯磚茶中分離純化的冠突曲霉菌，比較三者對(duì)茯茶的影響發(fā)現(xiàn)，發(fā)花均能減小不同黑毛茶在茶樹品種和工藝上的差異，且黑毛茶品質(zhì)越優(yōu)，其發(fā)花效果越佳；LJSC.2001、LJSC.2005與LJSC.2006在相同的茶葉基質(zhì)上發(fā)花后分別呈現(xiàn)淡黃偏白、黃亮、黃色偏深的菌花顆粒，除LJSC.2006發(fā)花茶樣湯色以橙黃為主，另兩株菌株發(fā)花茶樣的湯色均為紅橙色，滋味醇較厚、不易帶酸味，且LJSC.2006發(fā)花后茶樣香氣成分更豐富。后期可與當(dāng)前烘房發(fā)花的優(yōu)勢(shì)金花菌進(jìn)行比較，對(duì)其化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行生理生化方面的研究，進(jìn)一步探究差異性功能成分。

傳統(tǒng)茯茶加工流程復(fù)雜、周期長(zhǎng)，與外界環(huán)境進(jìn)行空氣置換，梅雨季節(jié)易滋生雜菌。散茶發(fā)花是以純化的冠突曲霉菌進(jìn)行調(diào)控發(fā)花，茶樣進(jìn)行滅菌處理、發(fā)花環(huán)境菌種單一，茶樣發(fā)花進(jìn)程快，杜絕了雜菌的生長(zhǎng)，產(chǎn)品質(zhì)量可控。此外，發(fā)花散茶在兼顧傳統(tǒng)茯茶功效的同時(shí)，還具有沖泡方便、金花茂盛、菌香明顯等特點(diǎn)，有利于后期各類發(fā)花散茶用于小罐茶、袋泡茶工廠化生產(chǎn)，將對(duì)茯茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展起到推動(dòng)作用。后期可選擇不同地區(qū)、不同品種的黑毛茶進(jìn)行發(fā)花，探究工藝與原料品種等因素對(duì)茯茶品質(zhì)的影響，進(jìn)一步提高茯茶生產(chǎn)加工技術(shù)。

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