陸地棉GHWAT1-35基因的克隆及亞細(xì)胞定位

摘 要：【目的】研究陸地棉GHWAT1-35基因在棉花纖維發(fā)育過(guò)程中的作用。

【方法】選用陸地棉系9花后不同時(shí)期的纖維為材料，克隆GHWAT1-35基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR）分析及亞細(xì)胞定位。

【結(jié)果】該基因全長(zhǎng)1 125 bp，編碼374個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為40.231 kDa，理論等電點(diǎn)為8.74。GHWAT1-35蛋白與亞洲棉親緣關(guān)系最近。GHWAT1-35基因在開(kāi)花后15 d表達(dá)量顯著升高，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。將GHWAT1-35基因與pCAMIA1300-35S-YFP載體重組，構(gòu)建融合表達(dá)載體，利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，注射到煙草后觀察到GHWAT1-35蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。

【結(jié)論】陸地棉系9 GHWAT1-35基因在開(kāi)花后15和20 DAP的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期，pC1300∷35S-WAT-YFP融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。

關(guān)鍵詞：陸地棉；WAT1；基因克??；生物信息學(xué)；亞細(xì)胞定位

中圖分類號(hào)：S562"" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"" 文章編號(hào)：1001-4330（2024）06-1310-08

0 引 言

【研究意義】棉花纖維品質(zhì)高低直接影響棉紡織品的質(zhì)量［1， 2］。纖維發(fā)育是棉花生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，其中涉及了多個(gè)基因的調(diào)控和作用［3］。因此，棉花質(zhì)量也成為原棉競(jìng)爭(zhēng)力的關(guān)鍵要素。研究陸地棉GHWAT1-35基因在棉花纖維發(fā)育過(guò)程中的作用，對(duì)挖掘棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Walls Are Thin 1（WAT1）是一種植物特異性蛋白，其功能早在擬南芥中已被揭示［4］。Ranocha等［5］研究發(fā)現(xiàn)，WAT1是一種液泡膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在擬南芥各個(gè)組織器官中均有表達(dá)，在莖和下胚軸表達(dá)量最高，這些組織均具有相對(duì)較高比例的次生壁細(xì)胞。NAC轉(zhuǎn)錄因子NST1和NST3是植物次生壁合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其參與轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)的激活，促進(jìn)次生壁的生物合成［6］。在擬南芥WAT1突變體中轉(zhuǎn)錄因子SND1和NST1的表達(dá)下調(diào)，其靶基因KNAT7和MYB103表達(dá)量也顯著降低，該2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在植物纖維次生壁合成過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。擬南芥WAT1是液泡膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可促進(jìn)生長(zhǎng)素進(jìn)入植物液泡中，從而維持植物內(nèi)部生長(zhǎng)素的平衡。擬南芥WAT1突變體植株木質(zhì)素含量降低、莖纖維次生細(xì)胞壁厚度降低、生長(zhǎng)素運(yùn)輸受阻、莖中生長(zhǎng)素含量顯著降低［7］。彭方林等［8］發(fā)現(xiàn)，At1g01070基因位于擬南芥的細(xì)胞質(zhì)膜上，超表達(dá)該基因篩選得到純和株系，發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)控?cái)M南芥的開(kāi)花時(shí)間，可促進(jìn)擬南芥幼株株高增加和幼根生長(zhǎng)。Ju等［9］發(fā)現(xiàn)，WAT1參與陸地棉果枝發(fā)育過(guò)程，在魯棉研28號(hào)和新陸中77號(hào)2個(gè)品種之間植株結(jié)構(gòu)差異顯著，前者果枝節(jié)間距較長(zhǎng)，株型疏松；后者果枝節(jié)間距較短，株型緊湊。RNASeq和qRT-PCR結(jié)果表明，生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在魯棉研28號(hào)中是正調(diào)控的，但在新陸中77號(hào)中受到負(fù)調(diào)控，魯棉研28號(hào)的生長(zhǎng)素明顯含量高于新陸中77號(hào)。Tang等［10］在GhWAT123沉默的陸地棉中發(fā)現(xiàn)，水楊酸（SA）相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)，導(dǎo)致水楊酸含量升高。木質(zhì)部發(fā)育受到抑制，造成木質(zhì)素沉積［11， 12］。Hanika等［13］利用VIGS技術(shù)瞬時(shí)沉默番茄植株中的SlWAT1基因，對(duì)經(jīng)過(guò)SlWAT1基因沉默的植株進(jìn)行篩選，并測(cè)試其對(duì)番茄黃萎病病原體的抗病性。結(jié)果表明，沉默后的番茄植株的萎縮程度顯著降低，SlWAT1在番茄中作為黃萎病感病因子發(fā)揮著重要作用。在鹽、干旱、低溫環(huán)境脅迫下，香蕉中MaWAT1s表達(dá)量顯著上調(diào)［14］。WAT1蛋白可通過(guò)參與生長(zhǎng)素、水楊酸等激素的代謝過(guò)程調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育與抗逆反應(yīng)［15］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于WAT1蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，而在陸地棉纖維發(fā)育過(guò)程中，WAT1蛋白的作用機(jī)制鮮有報(bào)道，需要進(jìn)一步克隆和分析WAT1蛋白相關(guān)基因。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以陸地棉系9的纖維組織為材料，克隆得到GHWAT1-35基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)和亞細(xì)胞定位分析，分析GHWAT1-35的功能，為深入探究該基因在棉花纖維發(fā)育過(guò)程中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

選擇陸地棉系9（簡(jiǎn)稱系9）開(kāi)花后（DPA）不同發(fā)育階段（0、5、10、15、20、25和30 DPA）的棉纖維組織及本氏煙草葉片。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA 的提取與克隆

采集陸地棉系9不同發(fā)育時(shí)期的纖維組織，并立即用液氮進(jìn)行速凍后，置于-80℃冰箱保存，備用。使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN）提取纖維樣品中的總RNA，并檢測(cè)RNA的濃度以確保質(zhì)量合格。以提取的總RNA作為模板，根據(jù)FastKing cDNA第一條鏈合成試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，并將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存待用。在CottonFGD數(shù)據(jù)庫(kù)中，下載GHWAT1-35基因CDS序列。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為PCR模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶的特異性。

1.2.2 生物信息學(xué)

利用ExPAXSy-ProtParam在線工具（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)目的蛋白GHWAT1-35的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，并使用TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）和SignaIP（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）在線工具對(duì)蛋白是否存在跨膜區(qū)和信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用InterPRO（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）對(duì)GHWAT1-35蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用NCBI網(wǎng)站BlastP工具對(duì)GHWAT1-35進(jìn)行分析，得到多個(gè)物種的WAT1同源蛋白序列，利用GeneDoc軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，利用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。運(yùn)用PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）同源建模方法預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用WoLF PSORT網(wǎng)站（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。使用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)GHWAT1-35的啟動(dòng)子順式作用元件。

1.2.3 GHWAT1-35實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)

以系9開(kāi)花后0、5、10、15、20、25和30 DPA的纖維組織為材料，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以棉花GhUBQ7作為熒光定量的內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，根據(jù)ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）說(shuō)明書進(jìn)行qRT-PCR。采用2-ΔΔct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量［16］，并用GraphPad Prism 9繪圖。

1.2.4 融合表達(dá)載體的構(gòu)建

使用EcoRI和SpeI限制性內(nèi)切酶對(duì)pC1300-35S-YFP載體進(jìn)行雙酶切，并使用ClonExpress II One Step Cloning Kit同源重組試劑盒，將目的片段GHWAT1-35構(gòu)建至線性化的pC1300-35S-YFP載體中，獲得的重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（DH5α）感受態(tài)細(xì)胞［17］。挑取重組反應(yīng)轉(zhuǎn)化平板上的單克隆進(jìn)行菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將條帶大小符合的產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得重組質(zhì)粒pC1300∷35S-GHWAT1-35-YFP，在驗(yàn)證正確的菌液中加入50%的甘油，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

活化凍存的農(nóng)桿菌（GV3101）感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)質(zhì)粒液氮凍融法將重組質(zhì)粒pC1300∷35S-GHWAT1-35-YFP轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中［18］，將菌液涂布于含卡那和利福平霉素抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單克隆后鑒定陽(yáng)性克隆，在陽(yáng)性菌液加入等體積50%的甘油，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將含有重組融合表達(dá)載體pC1300∷35S-GHWAT1-35-YFP的農(nóng)桿菌進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)后，加入提前制備的懸浮液（10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES，100 μmol/L AS），室溫下避光靜置3 h，用于后續(xù)試驗(yàn)侵染［19］。

選取4～5葉期長(zhǎng)勢(shì)好的本氏煙草葉片，用注射器吸取懸浮液，注射到煙草葉片下表皮細(xì)胞中［20］。以轉(zhuǎn)入空載體的煙草葉片作為陰性對(duì)照，注射后培養(yǎng)72 h，取樣并使用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察葉片中YFP熒光蛋白信號(hào)分布［21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 系9 GHWAT1-35基因的克隆

研究表明，以系9總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到GHWAT1-35基因。獲得條帶清晰、條帶大小為1125 bp的cDNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物序列與陸地棉GHWAT1-35基因序列一致，GHWAT1-35基因克隆成功。圖1

2.2 GHWAT1-35基因的生物信息學(xué)

研究表明，該蛋白質(zhì)的分子式為C1842H2900N458O498S25，編碼374個(gè)氨基酸，分子量為40.23 kDa，理論等電點(diǎn)為8.74。其中，Gly占氨基酸總數(shù)的含量最多（10.3%），14個(gè)殘基帶負(fù)電荷（Asp+Glu）和24個(gè)殘基帶正電荷（Arg+Lys）。不穩(wěn)定系數(shù)為20.03，為穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為68.47。在14位的疏水性值最強(qiáng)為2.367（max），在337位親水性值最強(qiáng)為-2.233（min），親疏水性總平均值為-0.978，屬于親水性蛋白。預(yù)測(cè)該蛋白共有22個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸（Ser）15個(gè)，蘇氨酸（Thr）5個(gè)，酪氨酸（Tyr）2個(gè)。在該蛋白質(zhì)中存在9個(gè)跨膜區(qū)，但不存在信號(hào)肽。圖2～5

與亞洲棉、雷蒙德氏棉、海島棉、橡膠樹(shù)、榴蓮、可可、黃麻的相似性分別為99.73%、98.67%、88.50%、84.2%、82.38%和74.18%。系9 GHWAT1-35蛋白與亞洲棉和雷蒙德氏棉的親緣關(guān)系較近，與黃麻、可可親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。該蛋白質(zhì)序列中存在2個(gè)EamA保守結(jié)構(gòu)域，分別位于第16～第148和第184～第322氨基酸處，屬于EamA like轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。在二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋占52.14%，β轉(zhuǎn)角占3.74%，無(wú)規(guī)則卷曲占25.13%，延伸鏈占18.98%。圖6～10

GHWAT1-35擁有CGTCA-motif（參與MeJA反應(yīng)的順式調(diào)節(jié)元件）、MBS（MYB結(jié)合位點(diǎn)，干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件）、GT1-motif（光響應(yīng)元件）、P-box（赤霉素響應(yīng)元件）、ARE（厭氧誘導(dǎo)所必需的順式調(diào)節(jié)元件、O2-site（玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)的順式作用元件）等順式作用元件。表1

2.3 "GHWAT1-35基因表達(dá)

研究表明，檢測(cè)基因在開(kāi)花后0、5、10、15、20、25和30 DPA的纖維組織的表達(dá)水平。在開(kāi)花后不同時(shí)期的纖維組織中，該基因均有表達(dá)，并且在第15、20 DPA的表達(dá)量相對(duì)較高，具有顯著差異。GHWAT1-35基因可能在棉花胚珠及纖維發(fā)育中發(fā)揮重要作用。圖11

2.4 亞細(xì)胞定位

研究表明，推測(cè)GHWAT1-35蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜。將構(gòu)建的GHWAT1-35基因與pC1300-35S-YFP載體重組，并將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到煙草細(xì)胞中，該基因在細(xì)胞核中無(wú)表達(dá)，呈現(xiàn)光滑的連續(xù)信號(hào)，可能定位于細(xì)胞膜。加膜marker共同注射后觀察，加入膜marker并進(jìn)行質(zhì)壁分離后，35S∷GhWAT1-35-YFP信號(hào)和mCherry的紅色信號(hào)一樣質(zhì)壁分離后內(nèi)縮進(jìn)胞內(nèi)；而未質(zhì)壁分離時(shí)35S∷GhWAT1-35-YFP信號(hào)和mCherry信號(hào)基本吻合。GhWAT1-35定位于細(xì)胞質(zhì)膜。圖12

3 討 論

3.1

WAT1蛋白是植物生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵蛋白，生長(zhǎng)素在促進(jìn)木質(zhì)素纖維分化過(guò)程中起到重要作用［7， 22，23］。研究從系9中克隆到GHWAT1-35基因，全長(zhǎng)1 125 bp，編碼374個(gè)氨基酸。陸地棉WAT1蛋白與亞洲棉、雷蒙德氏棉中的WAT1蛋白高度同源，其與亞洲棉相似度最高。WAT1蛋白含有EamA保守結(jié)構(gòu)域，含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白可能具有內(nèi)在膜蛋白的生物特性［24］。擬南芥WAT1蛋白參與生長(zhǎng)素的運(yùn)輸，維持植物體內(nèi)生長(zhǎng)素的動(dòng)態(tài)平衡。擬南芥WAT1突變體莖中生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，生長(zhǎng)素含量降低，莖部纖維次生細(xì)胞壁厚度降低。而噴施外源生長(zhǎng)素后，WAT1突變體可生長(zhǎng)素運(yùn)輸和次生壁厚度恢復(fù)到正常水平。香蕉MaWAT1s基因在不同組織器官和亞細(xì)胞的表達(dá)均存在差異，在不同時(shí)期噴施生長(zhǎng)素后的MaWATs表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。在棉花和番茄中同時(shí)瞬時(shí)WAT1同源基因可增強(qiáng)植株對(duì)黃萎病的抗性［25］。說(shuō)明WAT1蛋白在不同物種和組織中可能具有不同的功能［26， 27］，基因結(jié)構(gòu)對(duì)基因編碼蛋白的進(jìn)化和功能具有重要影響［28］。

3.2

棉花纖維發(fā)育大致可分為4個(gè)相互重疊的時(shí)期：起始、伸長(zhǎng)、次生壁加厚、脫水成熟［29］。棉纖維的伸長(zhǎng)始于開(kāi)花期，而絨毛纖維的伸長(zhǎng)始于開(kāi)花后5～10 d，生長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)約20 d。棉纖維次生壁加厚階段是發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，始于棉花開(kāi)花后15 d，在這一階段，細(xì)胞主要合成并沉積纖維素［30］。分析發(fā)現(xiàn)GHWAT1-35在纖維發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，但其在不同時(shí)期表達(dá)量具有差異性，在15、20 DAP表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期。

GHWAT1-35基因定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，與前人研究擬南芥At1g01070基因的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致［8］。

4 結(jié) 論

克隆陸地棉系9 GHWAT1-35基因，GHWAT1-35的CDS區(qū)序列全長(zhǎng)為1125bp，編碼374個(gè)氨基酸，為穩(wěn)定親水性蛋白。GHWAT1-35的序列上有兩個(gè)EamA保守結(jié)構(gòu)域，無(wú)信號(hào)肽。系9GHWAT1-35基因在開(kāi)花后15和20 DAP的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期，其在纖維發(fā)育中發(fā)揮重要作用。pC1300∷35S-WAT-YFP融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。

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Cloning and subcellular localization of the GHWAT1-35 gene in Gossypium hirsutum

Abstract：【Objective】 To explore the role of GHWAT1-35 gene in the development of cotton fibers.

【Methods】 "In this study， the fiber at different developmental stages post-anthesis of Gossypium hirsutum variety Xi9 were used as materials.The full-length cDNA sequence of the GHWAT1-35 gene was successfully cloned and subjected to bioinformatics analysis， real-time fluorescence quantitative （qRT-PCR） analysis， and subcellular localization.

【Results】 "The length of the GHWAT1-35 gene was 1125 bp， encoding 374 amino acids， with a relative molecular weight is 40.23 kDa and a theoretical isoelectric point of 8.74.Protein multiple sequence alignment and construction of a systematic evolutionary tree analysis showed that the GHWAT1-35 protein was most closely related to the Gossypium arboreum.The expression of the GHWAT1-35 gene significantly increased at 15 days after flowering， and subcellular localization predicted that the protein was located on the cytoplasmic membrane.The GHWAT1-35 gene was recombined with the pCAMIA1300-35S-YFP vector to construct a fusion expression vector， which was then transformed into Agrobacterium using the freeze-thaw method and after being injected into tobacco.The GHWAT1-35 protein was observed to be located on the cytoplasmic membrane.

【Conclusion】 The GHWAT1-35 gene plays an important role in fiber development， providing a foundation for further exploration of its biological function in Gossypium hirsutum.

Key words：Gossypium hirsutum; WAT1; gene cloning; bioinformatics; subcellular localization