新疆野生巴爾喀什蘑菇子實體多糖的提取與脫色工藝

摘 要：【目的】研究新疆野生巴爾喀什蘑菇子實體粗多糖提取及多糖脫色工藝，為新疆野生巴爾喀什蘑菇多糖的純化及深度開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

【方法】釆用熱水提醇沉法提取巴爾喀什蘑菇子實體粗多糖，研究提取溫度、時間、次數(shù)對巴爾喀什蘑菇多糖得率的影響；選擇脫色時間、脫色溫度、活性炭和H2O2含量為影響因子，以多糖脫色率為研究指標(biāo)，采用正交試驗優(yōu)化巴爾喀什蘑菇多糖脫色工藝，確定最佳脫色工藝條件。

【結(jié)果】熱水提醇沉法提取巴爾喀什菇子實體粗多糖的最佳工藝條件：提取時間6 h、提取溫度60℃、提取次數(shù)2次，在此條件下巴爾喀什菇子實體粗多糖得率為15.6%。活性炭最佳脫色工藝為活性炭用量 25%、脫色溫度 60℃、脫色時間45 min、pH值 3，在此條件下脫色率 為80.4%；雙氧水最佳脫色工藝為H2O2含量10%、脫色溫度60℃、脫色時間3 h、pH值9 ，在此條件下脫色率為86.23%。

【結(jié)論】利用熱水提醇沉法提取巴爾喀什蘑菇粗多糖工藝具有實際應(yīng)用價值。H2O2脫色法和活性炭脫色法對巴爾喀什蘑菇多糖的脫色效果受不同工藝條件的影響差異較大，H2O2脫色率比活性炭脫色率高，是巴爾喀什蘑菇多糖脫色的可行方法。

關(guān)鍵詞：巴爾喀什蘑菇；多糖提取；活性炭脫色；雙氧水（H2O2）脫色

中圖分類號：S646"" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"" 文章編號：1001-4330（2024）06-1527-08

0 引 言

【研究意義】巴爾喀什蘑菇（Agaricus balchaschensis）是新疆特有的大型野生食用菌，生長在新疆巴音郭楞蒙古自治州博湖縣博斯騰湖邊紅柳蘆葦根部的沙土層內(nèi)，具有高蛋白、低脂肪、富含碳水化合物及礦物質(zhì)營養(yǎng)等特點，其營養(yǎng)水平高于常見的雙孢菇、平菇、香菇［1］。巴爾喀什蘑菇的多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用［2］。但是，目前關(guān)于巴爾喀什蘑菇的研究側(cè)重于資源調(diào)查和子實體培養(yǎng)方面 ［3、4］，而對其子實體多糖的提取和脫色工藝研究匱乏。因此，優(yōu)化巴爾喀什蘑菇多糖提取、脫色工藝是新疆野生巴爾喀什蘑菇的高效開發(fā)利用的基礎(chǔ)。真菌多糖具有參與調(diào)節(jié)免疫功能、細(xì)胞間物質(zhì)識別等多種生物活性作用 ［5］ ，但是，多糖中的色素會直接影響多糖的純度、外觀顏色和生物活性［6］。多糖提取、脫色是研究利用巴爾喀什蘑菇的重要基礎(chǔ)，因此，建立高效、經(jīng)濟(jì)的巴爾喀什蘑菇子實體多糖提取、脫色工藝，對新疆野生巴爾喀什蘑菇資源的開發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】食用真菌多糖是眾多生物活性糖蛋白的一種［7］。多糖具有極性，在熱水中容易溶解。熱水提醇沉法能夠有效提取真菌子實體多糖，料液比、浸提溫度和浸提時間是影響真菌子實體多糖提取效率的主要影響因子［8］。楊青松等［9］利用響應(yīng)面法優(yōu)化了水浸提法提取紅雪茶水溶性多糖的工藝條件，發(fā)現(xiàn)在溫度82℃、料液比1∶20的條件下提取2 h，提取率為5.8%。熱水提醇沉法雖然耗時較長，但是步驟簡便、成本低、雜質(zhì)含量少，是目前提取游離態(tài)多糖的最常用方法 ［10］。脫色是粗多糖精制的重要步驟之一，主要脫色方法有活性炭吸附法、雙氧水脫色法、大孔樹脂脫色法等［11］。謝建華等［12］研究發(fā)現(xiàn)，利用活性炭對青錢柳葉多糖的脫色率及多糖保留率分別可達(dá) 80.3%和55.6%。但是活性炭脫色后存在難于分離的缺點，而H2O2 通過氧化劑的氧化作用進(jìn)行漂白脫色，具有自動分解、適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。該方法脫色后不易復(fù)色，主要適用于色素多且含有不飽和雙鍵、羥基和芳香環(huán)的物質(zhì)［13-14］。【本研究切入點】目前尚未見有關(guān)新疆野生巴爾喀什蘑菇子實體多糖脫色工藝的研究報道。需研究篩選提高新疆野生巴爾喀什蘑菇子實體多糖提取率和脫色率方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】優(yōu)化巴爾喀什蘑菇子實體多糖水浸提醇沉法工藝條件，利用單因素正交試驗優(yōu)化巴爾喀什蘑菇多糖的活性炭和H2O2脫色工藝，為新疆野生巴爾喀什蘑菇多糖的純化及其資源深度開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的野生巴爾喀什蘑菇子實體，采摘于新疆博湖縣博斯騰湖南岸。

試劑：無水乙醇、活性炭、H2O2均為分析純。

儀器：UV-全波段分光光度計、UV- 1061 酶標(biāo)儀計

1.2 方 法

1.2.1 巴爾喀什蘑菇粗多糖提取

參照楊青松等［9］熱水浸提醇沉法，將巴爾喀什蘑菇子實體切片、烘干、粉碎，過80目篩，稱取10 g子實體粉末，加入1 000 mL蒸餾水中，對提取溫度（50、60、70、80、90℃）、提取時間（4、5、6、7、8 h）、提取1、2、3、4次分別進(jìn)行多糖提取單因素試驗，提取后在8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min，取上清液，加入3倍體積95%無水乙醇，充分?jǐn)嚢瑁o置過夜、抽濾，所得沉淀即為粗多糖，在45℃烘箱中烘干，計算多糖含量。

1.2.2 多糖測定［15］

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，依據(jù)《中華人民共和國藥典》［16］ 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將巴爾喀什蘑菇子實體粗多糖提取液，配成濃度均為 1 mg/mL溶液，取0.2 mL在 UV- 1061 酶標(biāo)儀計上，在可見波長200～600 nm范圍內(nèi)測定吸光度，以橫縱坐標(biāo)分別為波長、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蒸餾水為對照。精確吸取1 mL多糖測定液測定多糖含量。

粗多糖中總糖含量可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。

式中，C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的結(jié)果，V為提取液總體積， M為實際稱量質(zhì)量。

1.2.3 巴爾喀什蘑菇子實體粗多糖活性炭脫色法

選擇活性炭為脫色劑，設(shè)置4個單因素：活性炭用量、脫色溫度、脫色時間和pH 值。使用紫外可見分光光度計檢測490 nm處脫色前后的巴爾喀什蘑菇多糖溶液的吸光值。

式中，A1：多糖溶液脫色前于490 nm 處的吸光度；A 2：多糖溶液脫色后于490 nm 處的吸光度。

1.2.3.1 活性炭加入量對多糖脫色效果的影響

分別在5個20 mL的離心管中移取巴爾喀什蘑菇子實體多糖溶液10 mL，分別加入5%、10%、15％、25％、30%和35％活性炭，pH值調(diào)為4，置于60℃水浴鍋中，脫色45 min，離心取上清，重復(fù)操作3次，測定吸光值。

1.2.3.2 時間對多糖脫色效果的影響

分別在5個20 mL的離心管中移取巴爾喀什蘑菇子實體多糖溶液10 mL，分別加入30%活性炭（根據(jù)1.2.3.1結(jié)果加入最佳量活性炭），pH值為4，置于60℃水浴鍋中，脫色15、25、35、45、55和65 min，離心取上清，重復(fù)操作3次，測定吸光值。

1.2.3.3 溫度對多糖脫色效果的影響

分別在5個20 mL的離心管中移取巴爾喀什蘑菇子實體多糖溶液10 mL，分別加入30%活性炭，pH值調(diào)為4，置于40、50、60、70、80和90℃水浴鍋中，脫色30 min，離心取上清，重復(fù)操作3次，測定吸光值。

1.2.3.4 pH值對多糖脫色效果的影響

分別在5個20 mL的離心管中移取巴爾喀什蘑菇子實體多糖溶液10 mL，分別加入30%活性炭，將pH值調(diào)為2、3、4、5、6和7，置于60℃水浴鍋中，脫色45min，離心取上清，重復(fù)操作3次，測定吸光值。

1.2.4 巴爾喀什蘑菇子實體粗多糖H2O2脫色法 ［17］

選擇H2O2為脫色劑，設(shè)置4個單因素：H2O2用量、脫色溫度 、脫色時間和pH值。

1.2.4.1 H2O2加量對多糖脫色效果的影響

分別在5個20 mL的離心管中移取巴爾喀什蘑菇子實體多糖溶液10 mL，將pH值調(diào)為9，分別加入4%、6%、8％、10％和12％的H2O2溶液2 mL，置于60℃水浴鍋中， 保持3 h，離心取上清，重復(fù)操作3次，測定吸光值。

1.2.4.2 溫度對多糖脫色效果的影響

分別在5個20 mL的離心管中移取巴爾喀什蘑菇子實體多糖溶液10 mL，將pH值調(diào)為9，分別加入10%" H2O2 2 mL，置于30、40、50、60和70℃水浴鍋中，保持3 h，離心取上清，重復(fù)操作3次，測定吸光值。

1.2.4.3 溫浴時間對脫色的影響

分別在5個20 mL的離心管中移取巴爾喀什蘑菇子實體多糖溶液10 mL，將pH值調(diào)為9，分別加入10% H2O2溶液2 mL，置于60℃水浴鍋中，分別保持0.5、1、2、3和4 h，離心取上清，重復(fù)3次，測定吸光值。

1.2.4.4 pH值對多糖脫色效果的影響

分別在5個20 mL的離心管中移取巴爾喀什蘑菇子實體多糖溶液10 mL，將pH值分別調(diào)為8、9、10、11和12，加入10% H2O2 2 mL，置于60℃水浴鍋中，保持3 h，離心取上清，重復(fù)操作3次，測定吸光值。

1.2.5 正交試驗

1.2.5.1 活性炭脫色正交試驗

通過單因素試驗，選取活性炭含量、脫色時間、脫色溫度以及pH值作為研究對象，按照L9（34 ）設(shè)計進(jìn)行正交試驗，以確定活性炭脫色影響因素及水平。表1

1.2.5.2 H2O2脫色正交試驗

通過單因素試驗，選取脫色溫度、脫色時間、pH值以及H2O2用量作為研究對象，按照 L9（34 ）設(shè)計進(jìn)行正交試驗［18］ ，確定H2O脫色影響因素及水平。表2

2 結(jié)果與分析

2.1 巴爾喀什蘑菇子實體粗多糖提取影響因素

研究表明，熱水浸提法提取巴爾喀什蘑菇粗多糖，所選取的三個因素對粗多糖提取的影響順序依次為提取時間＞提取溫度＞提取次數(shù)。提取時間對粗多糖提取率影響極顯著，提取溫度對粗多糖提取率影響顯著，提取次數(shù)對粗多糖提取率影響不顯著。最終得到粗多糖最佳提取工藝條件為提取時間6 h、提取溫度60℃、提取次數(shù)2次，在此條件下的粗多糖提取率達(dá)到15.6%。圖1

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

研究表明，以吸光度（A）為橫坐標(biāo)，葡萄糖糖濃度（y）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：Y=210.41X-12.379，R2=0.999 3。圖2

2.3 巴爾喀什蘑菇子實體粗多糖活性炭脫色效果

2.3.1 活性炭添加量對多糖脫色效果的影響

研究表明，在設(shè)定范圍內(nèi)，隨著活性炭加入量的增加，巴爾喀什蘑菇多糖脫色率逐漸增加，當(dāng)活性炭加入量從5%增加到30%時，多糖脫色率從14.29%增加到24.57%；當(dāng)活性炭濃度超過30%時，多糖脫色率下降至19.25% 。選擇25%、30%、35% 三個水平的活性炭加入量進(jìn)行正交試驗。圖3

2.3.2 脫色溫度對多糖脫色效果的影響

研究表明，在設(shè)定范圍內(nèi)，隨著脫色溫度的升高，多糖脫色率呈逐漸增加又緩慢降低的趨勢，當(dāng)溫度為60℃時，多糖脫色率最高，為90.42％，當(dāng)溫度為70℃時多糖脫色率降低至89.35%，選用40、50和60℃三個水平進(jìn)行正交試驗。圖4

2.3.3 脫色時間對多糖脫色效果的影響

研究表明，隨著脫色時間的延長，多糖脫色率呈逐漸升高后降低的變化趨勢，當(dāng)脫色時間為45 min時脫色率最高，達(dá)88.14%。在55、65 min時脫色率均低于45 min時。根據(jù)試驗結(jié)果選擇35、45和55 min 三個水平進(jìn)行正交試驗。圖5

2.3.4 pH值對多糖脫色效果的影響

研究表明，當(dāng)pH值由2增加到3時，脫色率高，分別為 61.27%和 74.07%；當(dāng)pH值由4～7時，多糖脫色率大幅降低，當(dāng)pH值6時脫色率最低，為12.63% 。pH值2、3、4 三個水平進(jìn)行正交試驗。圖6

2.4 巴爾喀什蘑菇子實體粗多糖 H2O2脫色單因素

2.4.1 "H2O2加量對多糖脫色效果的影響

研究表明，隨著H2O2的增加，巴爾喀什蘑菇粗多糖脫色率逐漸升高，當(dāng)H2O2加量從4%增加到12%時，粗多糖脫色率由63.36%增加到70.57%。當(dāng)H2O2加量超過12%時，多糖脫色率變化不大。選擇8%、10%、12%三個水平的H2O2加入量進(jìn)行正交試驗。

2.4.2 脫色溫度對多糖脫色效果的影響

研究表明，當(dāng)脫色溫度從40℃升至60℃時，多糖脫色率由68.52%升至77.04%。當(dāng)脫色溫度超過60℃時，多糖脫色率下降。根據(jù)試驗結(jié)果選擇40、50、60 ℃ 三個水平的脫色溫度進(jìn)行正交試驗。

2.4.3 脫色時間對多糖脫色效果的影響

研究表明，脫色時間在0.5～3 h，巴爾喀什蘑菇多糖脫色率隨時間的增加而上升，脫色率從50.37%增加到73.74%。當(dāng)脫色時間超過3 h后脫色率下降。根據(jù)試驗結(jié)果選擇 1、2、3 h三個水平的脫色時間進(jìn)行正交試驗。

2.4.4 pH值對多糖脫色效果的影響

研究表明，當(dāng)pH值由8增加到10時，脫色率略有提升，從52.5％增加到68.2％。當(dāng)pH值超過11時，脫色率下降至46.18。選擇pH值8、9、10三個水平進(jìn)行正交試驗。

2.5 巴爾喀什蘑菇子實體粗多糖活性炭脫色

研究表明，活性炭脫色法各因素對巴爾喀什蘑菇多糖脫色影響的主次順序為 C＞D＞B＞A，即溫度＞pH值＞時間＞活性炭加量；最優(yōu)水平為 A1B2C2D2 ，即脫色溫度 60℃、脫色時間45 min、活性炭加量25%、pH=3，此條件下巴爾喀什蘑菇粗多糖脫色率最高，達(dá)80.4%。表3

2.6 巴爾喀什蘑菇子實體粗多糖H2O2脫色

研究表明，H2O2脫色法各因素對巴爾喀什蘑菇多糖脫色影響的主次順序為B＞A＞D＞C，即時間＞溫度＞H2O2加量＞pH值；最優(yōu)水平為 A2B3C1D2 ，即脫色溫度 60℃、脫色時間3h、H2O2 加量10%、pH=9。此條件下巴爾喀什蘑菇粗多糖脫色率最高，達(dá)86.23%。表4

3 討 論

3.1 食用菌多糖的提取方法較多，主要有熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法、超聲波法、復(fù)合酶解法等 ［ 19］ 。稀酸稀堿會破壞多糖的糖苷鍵，使多糖分子內(nèi)部發(fā)生斷裂，影響多糖獲得率，而且雜質(zhì)含量多，影響后期的純化過程。熱水浸提法雖然耗時較長，但步驟簡便、成本低、雜質(zhì)含量少，適用于游離態(tài)多糖的提取，是目前最常用的多糖提取方法 ［10］。

試驗研究采用熱水提醇沉法提取巴爾喀什蘑菇粗多糖，對提取溫度、提取時間、提取次數(shù)等關(guān)鍵因子影響巴爾喀什蘑菇粗多糖獲得率進(jìn)行了研究，優(yōu)化出多糖提取的最佳條件是在60℃下提取6 h，提取2次，在此條件下巴爾喀什菇子實體多糖獲得率為15.6%，高于常昕等［20］提取蘆葦黑蘑菇多糖的獲得率。研究表明，利用熱水提醇沉法提取巴爾喀什蘑菇多糖可行， 利用熱水浸提法從巴爾喀什蘑菇提取的粗多糖含有雜質(zhì)色素，純度較低，影響多糖的結(jié)構(gòu)解析及生物活性研究，使多糖的應(yīng)用受到限制。Gao等［21］發(fā)現(xiàn)粗多糖經(jīng)精制后，抗氧化活性明顯提高，而對多糖進(jìn)行脫色、純化是其中最為關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)，可提高粗多糖有效成分的純度，同時經(jīng)純化獲得的多糖可為后續(xù)的結(jié)構(gòu)分析、藥理和構(gòu)效關(guān)系提供試驗材料。目前，多糖脫色主要有活性炭脫色法、樹脂脫色法、雙氧水脫色法等［20］。活性炭脫色具有操作簡單、價格低廉等優(yōu)點，但是，在操作時必須使用粉末活性炭，導(dǎo)致脫色后溶液中的活性炭殘渣難以完全去除。且活性炭吸附色素的同時，也會吸附多糖，造成多糖的損失。同時脫色時溶液的pH值需調(diào)至3左右，將由于加酸而導(dǎo)致多糖變質(zhì)［22］。H2O2 脫色法雖然成本低、脫色工藝穩(wěn)定且效率較高，但H2O2對多糖具有較強(qiáng)的氧化作用。蔣俊等［11］研究活性炭吸附法、H2O2 脫色法和大孔樹脂法對猴頭菌多糖的脫色效果發(fā)現(xiàn)，高濃度的H2O2脫色效果能達(dá)到與大孔樹脂相當(dāng)?shù)乃?。陳健等?3］采用樹脂脫色法和H2O2脫色法對香菇多糖進(jìn)行脫色發(fā)現(xiàn)，H2O2法脫色時間短、多糖保留率高，且香菇多糖分子量不受H2O2脫色工藝的影響，脫色效果優(yōu)于樹脂法。試驗對活性炭脫色和雙氧水脫色兩種方法的脫色時間、脫色溫度及活性炭或H2O2添加量進(jìn)行了研究，采用正交試驗優(yōu)化得出巴爾喀什蘑菇子實體多糖脫色的最佳工藝?；钚蕴棵撋ǜ饕蛩貙Π蜖柨κ材⒐蕉嗵敲撋绊懙闹鞔雾樞驗闇囟龋緋H值＞時間＞活性炭加量，最優(yōu)水平為脫色溫度 60℃、脫色時間 3h、活性炭加量25%、pH值 3，此條件下多糖脫色率最高，達(dá)80.4%。雙氧水脫色法各因素對多糖脫色影響的主次順序為時間＞溫度＞H2O2加量＞pH值；最優(yōu)水平為脫色溫度 60℃、脫色時間 3h、H2O2添加量 10%、pH值9，此條件下多糖脫色率最高，達(dá)86.23%，與蔣俊等利用不同脫色方法對猴頭菌多糖進(jìn)行脫色的研究結(jié)果［11］一致。下一步擬對巴爾喀什蘑菇子實體多糖的純化及理化特征進(jìn)行深入研究。

4 結(jié) 論

利用熱水提醇沉法提取野生巴爾喀什菇子實體多糖的最佳工藝條件：在60℃條件下提取6 h，提取2次，在此條件下巴爾喀什菇子實體多糖獲得率達(dá)15.6%?；钚蕴棵撋虷2O2脫色的最佳工藝條件：活性炭添加量25%、脫色溫度60℃、脫色時間45 min、pH=3，在此條件下多糖脫色率達(dá) 80.4%； H2O2添加量10%、脫色溫度60℃、脫色時間3 h、pH= 9，在此條件下多糖脫色率達(dá)86.23%。2種脫色方法的脫色效果存在顯著差異，H2O2脫色法對巴爾喀什蘑菇多糖的脫色效率較高，工藝穩(wěn)定，是新疆野生巴爾喀什蘑菇多糖脫色的可行方法。

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Extraction and decolorization of polysaccharides from fruit body of wild Agaricus balchaschensis in Xinjiang

Abstract：【Objective】 To study the extraction and decolorization process of crude polysaccharides from fruit body of wild Agaricus balchaschensis in Xinjiang， and provide theoretical basis and technical support for its in-depth development.

【Methods】 This study adopted ethanol subsiding to extract the fruit body polysaccharides of wild A. balchaschensisin， and explored the influence of extraction temperature， time and frequency on the yield of polysaccharides from A. balchaschensisin." With the decolorization time， decolorization temperature， content of activated carbon and H2O2 as influencing factors and the decolorization rate of polysaccharides as research index， the study optimized the decolorization process of polysaccharides from A. balchaschensisin through orthogonal test， so as to determine the optimal decolorization conditions.

【Results】" According to the results， the optimal conditions for extracting fruit body polysaccharides of wild A. balchaschensis by ethanol subsiding were 6 h extraction time， 60℃ extraction temperature， and 2 times extraction， under which the yield of fruit body polysaccharides of wild A.balchaschensisin was 15.6%. The optimal decolorization process for activated carbon was 25% activated carbon， 60℃ decolorization temperature， and 45 min decolorization time at pH3， under which the decolorization rate was 80.4%. The optimal decolorization process for hydrogen peroxide was 10% H2O2 content， 60℃ decolorization temperature， and 3 h decolorization time at pH 9， under which the decolorization rate was 86.23%.

【Conclusion】" This technology has verified the feasibility and practical value of applying ethanol subsiding to extract fruit body polysaccharides of wild A.balchaschensis in and the effects of H2O2 and activated carbon decolorization methods on the decolorization of polysaccharides from A. balchaschensis varied greatly under different process conditions. The former has a higher decolorization rate than the latter and is feasible for the decolorization of polysaccharides from A.balchaschensisin.

Key words：Agaricus balchaschensis;carbon; hydrogen peroxide （H2O2 ）" decolorization