槲皮素提高人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480和SW620對(duì)順鉑的敏感性

摘要：目的 本研究旨在探究槲皮素對(duì)順鉑耐藥人結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）細(xì)胞SW480和SW620的抑制作用及其可能的機(jī)制。方法 培養(yǎng)SW480和SW620細(xì)胞的順鉑耐藥亞型，并用MTT法測(cè)定槲皮素對(duì)細(xì)胞增殖和化療敏感性的影響。流式細(xì)胞術(shù)用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡，蛋白質(zhì)印跡法用于檢測(cè)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果 MTT實(shí)驗(yàn)顯示，80 μmol/L和160 μmol/L濃度的槲皮素顯著抑制了SW480和SW620細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，順鉑聯(lián)合槲皮素組的細(xì)胞凋亡率明顯高于其他3組。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，順鉑聯(lián)合槲皮素組的裂解型半胱天冬酶-3（cleaved-caspase-3）和半胱天冬酶-9（caspase-9）表達(dá)顯著增加?；熕幬锩舾行詸z測(cè)結(jié)果表明，耐藥細(xì)胞的IC₅₀升高，而在槲皮素給藥后顯著下降（P均＜0.05）。結(jié)論 本研究明確了槲皮素能夠提高人CRC細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。這種效應(yīng)可能與其影響細(xì)胞增殖、凋亡和自噬等方面的作用機(jī)制有關(guān)。

關(guān)鍵詞：槲皮素；SW480細(xì)胞；SW620細(xì)胞；結(jié)直腸癌（CRC）；順鉑

中圖分類號(hào)：R735.35 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202406004

收稿日期：2024-06-06 修回日期：2024-07-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No. 81871913）；南通市衛(wèi)生健康委員會(huì)面上課題B資助項(xiàng)目（No. MB2021085）

Supported by the General Project of the National Natural Science Foundation of China （No. 81871913） and General Project B of Nantong Health Commission （No. MB2021085）

通信作者：陳維，副主任醫(yī)師. E-mail：15851303039@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20240805.1434.002.html （2024-08-05）

Quercetin increases the sensitivity of human colon cancer cells SW480 and SW620 to cisplatin

ZHOU Feng¹， SHA Desheng¹， LU Yuanyuan²， CHEN Wei³

（1. Department of General Surgery， The People’s Hospital of Rugao， Rugao 226500; 2. Department of Gastroenterology， Xijing Hospital of Digestive Diseases， Air Force Medical University， Xi’an 710032; 3. Department of Oncology， The People’s Hospital of Rugao， Rugao 226500， China）

ABSTRACT： Objective To investigate the inhibitory effect of quercetin on cisplatin-resistant human colorectal cancer （CRC） cells SW480 and SW620 and its possible mechanism. Methods Cisplatin-resistant subtypes of SW480 and SW620 cells were first cultured and the effects of quercetin on cell proliferation and chemosensitivity were determined by MTT assay. Flow cytometry was used to detect apoptosis and protein blotting was used to detect the expressions of relevant proteins. Results MTT assay showed that quercetin at the concentrations of 80 μmol/L and 160 μmol/L significantly inhibited the proliferation of SW480 and SW620 cells. Flow cytometry results showed that the apoptosis rate was significantly higher in the cisplatin combined with quercetin group than in the other three groups. Protein blotting showed that cleaved-caspase-3 and caspase-9 expressions were significantly increased in the cisplatin combined with quercetin group. The chemotherapeutic drug sensitivity assay showed that the elevated IC₅₀ of drug-resistant cells was decreased significantly after quercetin administration （Plt;0.05）. Conclusion The present study clarifies that quercetin can increase the sensitivity of human CRC cells to cisplatin. This effect may be related to its mechanism of action in affecting cell proliferation， apoptosis and autophagy.

KEY WORDS： quercetin; SW480 cell; SW620 cell; colorectal cancer （CRC）; cisplatin

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是男性第三大最常見的癌癥，也是女性第二大最常見的癌癥。近年來，全球CRC負(fù)擔(dān)將增加60%，到2030年新增病例將超過220萬(wàn)，死亡人數(shù)將超過110萬(wàn)^［1-2］。雖然近年來對(duì)CRC的危險(xiǎn)因素、發(fā)病機(jī)制和早期診斷的研究有了一定的進(jìn)展，但CRC的發(fā)病率仍呈上升趨勢(shì)，其原因尚不明確^［3-4］。順鉑在治療多種實(shí)體瘤中發(fā)揮了重要作用，如睪丸癌、肺癌、卵巢癌、頭頸癌和膀胱癌^［5-6］。然而，順鉑對(duì)CRC的治療效果并不理想，CRC細(xì)胞對(duì)順鉑容易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療失敗^［7］。因此，尋找能夠克服或減輕CRC細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性的策略，是提高CRC化療效果的重要途徑之一。槲皮素是一種天然存在于植物中的黃酮類化合物，具有多種生理功能，如抗氧化、抗炎、抗過敏等^［8-9］。近年來，越來越多的研究表明，槲皮素具有顯著的抗腫瘤活性，可以抑制多種癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌等^［10］。槲皮素對(duì)癌細(xì)胞的作用機(jī)制可能涉及多個(gè)層面，如調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬，抑制血管生成和血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等^［11］。然而，目前關(guān)于槲皮素對(duì)人CRC細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的影響及其機(jī)制的研究還很少。因此，本研究旨在探討槲皮素對(duì)人CRC細(xì)胞SW480和SW620對(duì)順鉑敏感性的影響及其可能的機(jī)制，并為槲皮素作為一種輔助化療藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人CRC細(xì)胞系SW480和SW620均購(gòu)自上海生物研究所。主要試劑：順鉑、槲皮素、噻唑藍(lán)（thiazolyl blue，MTT）、酸-異丙醇溶液、奧沙利鉑、膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙啶試劑盒、羅丹明123（rhodamine 123，Rh123）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，放射免疫沉淀（radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA）緩沖液、二辛可寧酸試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide，SDS-PAGE）凝膠、聚偏二氟乙烯膜購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，針對(duì)p65、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）的一抗和二抗購(gòu)自美國(guó)Santa公司。主要儀器Spectra Max微孔板分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices LLC公司，F(xiàn)ACS Verse流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 按照文獻(xiàn)^［12-13］中所述方法建立了順鉑耐藥CRC細(xì)胞系，包括對(duì)照組、槲皮素組、順鉑組和槲皮素+順鉑組，每個(gè)組設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)均取3個(gè)平行試驗(yàn)的平均值進(jìn)行分析。使用1 mg/L的順鉑處理正常SW480和SW620細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%匯聚后，收集并重新進(jìn)行培養(yǎng)。逐漸增加順鉑的濃度（4、8、12、16、20、24 mg/L），并持續(xù)處理細(xì)胞6個(gè)月，以獲得順鉑耐藥的SW480和SW620細(xì)胞系。最后，將這些耐藥細(xì)胞系冷凍保存在-80 ℃以供后續(xù)使用。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)

將細(xì)胞分別接種在含有不同濃度（20、40、80、160 μmol/L）槲皮素的96孔板中，并在培養(yǎng)24 h后，加入20 μL的MTT。在37 ℃下孵育4 h，然后使用150 μL酸-異丙醇溶液溶解甲臜晶體，最終使用Spectra Max微孔板分光光度計(jì)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞增殖率。對(duì)于槲皮素對(duì)SW480和SW620細(xì)胞對(duì)化療藥物（順鉑、奧沙利鉑、阿霉素和紫杉醇）敏感性的影響，將細(xì)胞分別接種在含有不同濃度的化療藥物和槲皮素的96孔板中，并培養(yǎng)72 h。使用MTT法測(cè)量吸光度（450 nm），然后使用SPSS 22.0軟件分析半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC₅₀）。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)

使用膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙啶試劑盒通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞凋亡。用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細(xì)胞，然后用試劑盒的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞與10 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC和5 μL碘化丙啶在黑暗中孵育15 min。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡

使用冷凍的RIPA緩沖液從細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)。通過二辛可寧酸測(cè)定確定蛋白質(zhì)濃度。將等量的蛋白質(zhì)（20 μg）進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜中。在50 g/L脫脂牛奶中封閉1 h，接著與針對(duì)p65、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和β-actin的一抗在4 ℃孵育過夜。在磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌3次10 min，然后在室溫下與二抗孵育1 h。通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)可視化蛋白質(zhì)條帶，相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)為β-actin。

1.2.5 Rh123檢測(cè)

用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后在含有0.5 mg/mL Rh123的新鮮培養(yǎng)基中孵育2 h。收集細(xì)胞并用PBS洗滌2次，去除細(xì)胞外的Rh123，最終重懸細(xì)胞于PBS中。在黑暗中使用FACS Verse流式細(xì)胞儀檢測(cè)Rh123的熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。使用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間的兩兩比較，使用單因素方差分析及Dunnett多重比較法進(jìn)行多組間的比較。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法分析細(xì)胞增殖情況

經(jīng)過6個(gè)月的培養(yǎng)，細(xì)胞系SW480和SW620在20 mg/L和24 mg/L的順鉑中表現(xiàn)出穩(wěn)定的生長(zhǎng)狀態(tài)，并且成功地建立了順鉑耐藥的細(xì)胞系R-SW480和R-SW620（圖1A、1B）。采用MTT法對(duì)不同濃度的槲皮素進(jìn)行了細(xì)胞增殖速率的檢測(cè)。在此過程中，與對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)80 μmol/L和160 μmol/L的槲皮素對(duì)SW480和SW620細(xì)胞的增殖速率產(chǎn)生了顯著影響（P＜0.05，圖1C、1D）。此外，順鉑與槲皮素聯(lián)合應(yīng)用也對(duì)細(xì)胞的增殖速率產(chǎn)生了顯著影響（P＜0.05，圖1E、1F）。

2.2 細(xì)胞的凋亡情況

通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量R-SW480和R-SW620細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，順鉑聯(lián)合槲皮素處理組的細(xì)胞凋亡范圍更大，細(xì)胞凋亡率明顯高于其他3組（圖2）。順鉑聯(lián)合槲皮素處理組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，圖3A、3B）。此外，使用蛋白質(zhì)印跡法（圖4）檢測(cè)了R-SW480和R-SW620細(xì)胞中裂解型半胱天冬酶-3（cleaved-caspase-3）和半胱天冬酶-9（caspase-9）的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，順鉑聯(lián)合槲皮素處理組的cleaved-caspase-3和caspase-9表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，圖5A、5B）。

2.3 細(xì)胞的自噬情況

通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)R-SW480和R-SW620細(xì)胞中的細(xì)胞自噬標(biāo)志物蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，順鉑聯(lián)合槲皮素組的LC3-Ⅰ表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，LC3-Ⅱ和p65表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖6、圖7）。

2.4 細(xì)胞的多藥耐藥性情況

評(píng)估SW480和SW620細(xì)胞對(duì)順鉑和其他常見化療藥物的敏感性。結(jié)果顯示，與正常的SW480和SW620細(xì)胞相比，R-SW480和R-SW620在藥物中的IC₅₀顯著升高，但在槲皮素給藥后，IC₅₀顯著下降（P＜0.05，表1、表3）。此外，在各組SW480和SW620細(xì)胞中檢測(cè)多藥耐藥基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1）的信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）、Pgp和羅丹明123的平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity of rhodamine 123，MFI of Rh123）的表達(dá)。結(jié)果顯示，與SW480和SW620組相比，耐藥細(xì)胞中MDR1 mRNA和Pgp表達(dá)量顯著增加，但在槲皮素給藥后，這些表達(dá)水平顯著下降，MFI of Rh123則呈相反趨勢(shì)（P＜0.05，表2、表4）。

3 討 論

CRC作為常見的消化道惡性腫瘤，其病情進(jìn)展緩慢，初期患者通常缺乏特異性癥狀。然而，隨著腫瘤的生長(zhǎng)，患者可能會(huì)出現(xiàn)腹部不適、腹瀉、腹膜刺激等癥狀，且其具備高風(fēng)險(xiǎn)的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移特性^{［4，14-15］}。全球范圍內(nèi)，CRC的疾病負(fù)擔(dān)不斷上升。最新數(shù)據(jù)表明，我國(guó)CRC的新發(fā)病例已經(jīng)居于第二位，僅次于肺癌^［16-17］。因此，深入研究CRC的發(fā)病機(jī)制以及治療藥物對(duì)于提高患者的生存率具有至關(guān)重要的意義。槲皮素及其提取物因其多樣的藥理作用而備受關(guān)注^［18］。進(jìn)一步的研究揭示，槲皮素通過多種機(jī)制發(fā)揮其抗癌作用，包括抑制酪氨酸激酶活性、調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的途徑以及與特定蛋白質(zhì)或受體相互作用^{［9，19］}。

本研究旨在探究槲皮素對(duì)順鉑耐藥CRC細(xì)胞的抑制作用及其可能的機(jī)制。通過一系列實(shí)驗(yàn)，本研究剖析了槲皮素對(duì)順鉑耐藥細(xì)胞增殖、凋亡、自噬等過程，旨在研究槲皮素是否具有逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性和提高藥物敏感性的潛能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，槲皮素顯著地抑制了SW480和SW620細(xì)胞的增殖，尤其是在80 μmol/L和160 μmol/L濃度下，其明顯降低了細(xì)胞的增殖速率。這一發(fā)現(xiàn)與以前的研究結(jié)果一致，再次證實(shí)了槲皮素作為潛在抗腫瘤藥物的潛力^［20］。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)揭示，通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定，順鉑聯(lián)合槲皮素組的細(xì)胞凋亡率明顯高于其他3組，伴隨著cleaved-caspase-3和caspase-9表達(dá)的顯著增加。這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞凋亡途徑中充當(dāng)?shù)湫偷臉?biāo)志物，其升高暗示槲皮素可能通過激活細(xì)胞凋亡途徑來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡，這與以往關(guān)于槲皮素的研究結(jié)果相吻合^［21］。

本研究還深入探究了槲皮素對(duì)細(xì)胞自噬的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在順鉑聯(lián)合槲皮素組中，LC3-Ⅱ和p65的表達(dá)水平顯著高于其他3組，而LC3-Ⅰ的表達(dá)水平降低。這提示槲皮素可能通過調(diào)節(jié)SW480和SW620細(xì)胞的自噬狀態(tài)來影響細(xì)胞的生存和死亡。也有研究顯示，槲皮素能夠促進(jìn)LC3Ⅰ/Ⅱ的轉(zhuǎn)換，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡和凋亡，從而具備抗腫瘤的作用^［22］，這暗示著槲皮素在增強(qiáng)SW480細(xì)胞的自噬活性方面可能也具有潛在的抗腫瘤效果，有望成為臨床抗腫瘤輔助治療的一種選擇。

在腫瘤治療中，MDR是一個(gè)重要的挑戰(zhàn)，因?yàn)樗赡軐?dǎo)致耐藥細(xì)胞對(duì)各種化療藥物產(chǎn)生不敏感性^［23］。本研究的另一個(gè)關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是，槲皮素還可以增加SW480和SW620細(xì)胞對(duì)除了順鉑外的其他常用化療藥物的敏感性。此外，經(jīng)過槲皮素處理后，順鉑耐藥細(xì)胞的MDR1 mRNA和Pgp表達(dá)水平顯著下降，這表明槲皮素可能影響了R-SW480和R-SW620細(xì)胞中的MDR水平。這可能與槲皮素對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的雙重影響相關(guān)，從而提高了細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性。張海英等^［24］的研究顯示，槲皮素不僅可以明顯降低耐藥細(xì)胞的IC₅₀，還能增加細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性，此外，槲皮素還通過降低Pgp蛋白的表達(dá)，改善藥物在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和分布，從而逆轉(zhuǎn)MDR，這與本研究的結(jié)果一致。

綜上所述，本研究深入探索了槲皮素在提高順鉑耐藥細(xì)胞SW480和SW620的敏感性方面的作用機(jī)制。這一效應(yīng)可能通過多種途徑實(shí)現(xiàn)，包括細(xì)胞增殖的抑制、細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)以及細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)等。這一發(fā)現(xiàn)有望為臨床上應(yīng)用槲皮素來提高抗腫瘤藥物在CRC治療中的療效提供新的思路和方法。

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（編輯 陳 波）