五味子木脂素對(duì)跑步機(jī)睡眠剝奪大鼠警覺性的影響

摘要：目的 探討五味子木脂素對(duì)跑步機(jī)睡眠剝奪大鼠警覺性水平的影響及其可能的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。方法 SD雄性大鼠，隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組，睡眠剝奪組，五味子木脂素低、中、高劑量組，鹽酸托莫西汀組，每組8只。除空白組外，其他各組大鼠均進(jìn)行跑步機(jī)睡眠剝奪，連續(xù)3 d。剝奪期間，各個(gè)給藥組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，采用5～9孔測(cè)試儀測(cè)試各組大鼠的警覺性表現(xiàn)；另取SD雄性大鼠，睡眠剝奪方法造模和給藥方法同上，隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、睡眠剝奪組、五味子木脂素組（67.2 mg/kg）和鹽酸托莫西汀組，每組10只，采用ELISA技術(shù)測(cè)定各組大鼠血清中食欲素A的含量；采用免疫熒光、Western blot法觀察各組大鼠前額葉皮層（PFC）c-Fos蛋白表達(dá)和食欲素受體 1、2水平的變化。結(jié)果 與空白組相比，睡眠剝奪組大鼠警覺性表現(xiàn)的選擇準(zhǔn)確性顯著降低（Plt;0.001），遺漏反應(yīng)、遺漏率和平均反應(yīng)潛伏期均顯著升高（P=0.002，P=0.003，P=0.020）；與睡眠剝奪組相比，五味子木脂素中、高劑量組和鹽酸托莫西汀組均可改善跑步機(jī)睡眠剝奪大鼠的警覺性指標(biāo)，表現(xiàn)為選擇準(zhǔn)確性提高（P=0.001，P=0.006，Plt;0.001），遺漏反應(yīng)（P=0.001，P=0.001，Plt;0.001）、遺漏率（P=0.001，P=0.002，Plt;0.001）和平均反應(yīng)潛伏期（P=0.018，P=0.003，P=0.014）減少。與空白組相比，睡眠剝奪組大鼠血清中的食欲素 A含量、PFC腦區(qū)c-Fos均顯著增加（P均lt;0.001），食欲素受體1蛋白表達(dá)水平顯著減少（P=0.037）；與睡眠剝奪組相比，五味子木脂素組（67.2 mg/kg）和鹽酸托莫西汀組大鼠血清中的食欲素 A水平（P=0.005，P=0.029）、PFC腦區(qū)c-Fos（P=0.028，P=0.036）均顯著降低，食欲素受體1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P=0.043，P=0.013）。結(jié)論 五味子木脂素可能通過調(diào)節(jié)食欲素分泌和PFC的食欲素受體1表達(dá)發(fā)揮拮抗睡眠剝奪所致警覺性水平下降的作用。

關(guān)鍵詞：五味子木脂素；睡眠剝奪；警覺性；食欲素

中圖分類號(hào)： R285.5" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A" 文章編號(hào)：1000-503X（2024）04-0471-11

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15910

Effects of Schisandrae Chinensis Fructus Lignans on Alertness of Rats With Sleep Deprived by Treadmill Exercise

WU Yanan，MA Qing，WANG Yanyan，HUANG Lili

College of Pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China

Corresponding author：HUANG Lili Tel：0451-82114410，E-mail：908668195@qq.com

ABSTRACT：Objective To investigate the effects of Schisandrae Chinensis Fructus lignans on the alertness of the rats with sleep deprived by treadmill exercise and the underlying neurobiological mechanism.Methods According to the random number table method，SD male rats were assigned into control，sleep deprivation，low-，medium-，and high-dose Schisandrae Chinensis Fructus lignans，and atomoxetine hydrochloride groups，with 8 rats in each group.The rats in other groups except the control group were subjected to sleep deprivation by treadmill exercise for 3 d.During the deprivation period，each administration group was administrated with the corresponding drug by gavage，and a 5-9 hole tester was used to test the alertness performance of rats in each group. Furthermore，other SD male rats were selected and randomized into control，sleep deprivation，Schisandrae Chinensis Fructus lignans （67.2 mg/kg） and atomoxetine hydrochloride groups，with 10 rats in each group.The rats were modeled with the sleep deprivation method the same as that above and administrated with corresponding agents.ELISA was employed to measure the serum level of orexin A in each group of rats.The protein levels of c-Fos，orexin receptor 1，and orexin receptor 2 in the prefrontal cortex of rats in each group were observed by immunofluorescence and Western blotting.Results Compared with the control group，sleep deprivation reduced the choice accuracy （Plt;0.001） and increased the omission responses，omission percent，and mean correct response latency （P=0.002，P=0.003，P=0.020）.Compared with the sleep deprivation group，medium- and high-dose Schisandrae Chinensis Fructus lignans and atomoxetine hydrochloride improved the alertness of rats，as demonstrated by the increased choice accuracy （P=0.001，P=0.006，Plt;0.001） and reduced omission responses （P=0.001，P=0.001，Plt;0.001），omission percent （P=0.001，P=0.002，Plt;0.001），and mean correct response latency （P=0.018，P=0.003，P=0.014）.Compared with the control group，the sleep deprivation group showed elevated level of orexin A in the serum （Plt;0.001），up-regulated expression of c-Fos （Plt;0.001），and down-regulated expression of orexin receptor 1 （P=0.037） in the prefrontal cortex.Compared with the sleep deprivation group，Schisandrae Chinensis Fructus lignans （67.2 mg/kg） and atomoxetine hydrochloride lowered the orexin A level in the serum （P=0.005，P=0.029），down-regulated the expression of c-Fos （P=0.028，P=0.036），and up-regulated the expression of orexin receptor 1 （P=0.043，P=0.013） in the prefrontal cortex.Conclusion Schisandrae Chinensis Fructus lignans may antagonize the alertness decrease caused by sleep deprivation by regulating the secretion of orexin and the expression of orexin receptor 1 in the prefrontal cortex.

Key words：Schisandrae Chinensis Fructus lignans；sleep deprivation；alertness；orexin

Acta Acad Med Sin，2024，46（4）：471-481

警覺性作為認(rèn)知的一個(gè)最基本維度，是完成其他高級(jí)認(rèn)知過程的必要條件，影響警覺性的因素有多種：光照、聲音、溫度、年齡和性別等［1-4］。警覺性作為廣泛認(rèn)知任務(wù)的主要組成部分，在日常的工作學(xué)習(xí)和生活中都不可或缺。相關(guān)失眠流行病學(xué)的研究中，失眠是中青年人群普遍存在的問題［5］，睡眠障礙會(huì)損害警覺性和神經(jīng)認(rèn)知能力，并增加開車時(shí)睡著的風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致交通事故的發(fā)生［6］；在進(jìn)行軍事演練、應(yīng)急處置等高強(qiáng)度的訓(xùn)練中，軍人常處于睡眠剝奪狀態(tài)下，需要服用興奮劑保持較高的警覺性以維持軍人的戰(zhàn)斗狀態(tài)［7］。5～9孔測(cè)試儀和嚙齒動(dòng)物精神運(yùn)動(dòng)警覺性任務(wù)是用于研究嚙齒類動(dòng)物的測(cè)試裝置，現(xiàn)已成為評(píng)估嚙齒類動(dòng)物警覺性及持續(xù)性注意力的有效工具［8-9］。因此，研究開發(fā)拮抗睡眠不足引起的警覺性下降的藥物，對(duì)于維持國(guó)家和社會(huì)安全具有重要的意義。

食欲素是處于下丘腦外側(cè)區(qū)的食欲素神經(jīng)元合成分泌的興奮性神經(jīng)多肽類物質(zhì)，食欲素包括食欲素 A、 B兩種類型的神經(jīng)肽［10］。有研究顯示食欲素可以通過興奮皮層下促覺醒核團(tuán)，在啟動(dòng)和維持覺醒中發(fā)揮關(guān)鍵作用。前額葉皮層（prefrontal cortex，PFC）是與意識(shí)、注意力、抉擇等認(rèn)知功能高度相關(guān)的腦區(qū)，研究表明食欲素能神經(jīng)元可直接投射到PFC，從而激發(fā)PFC對(duì)機(jī)體注意力的調(diào)控［11-12］。臨床上常用的治療警覺性下降的藥物為中樞神經(jīng)興奮劑（咖啡因、右旋苯丙胺、莫達(dá)非尼、安非他明等）［13-14］和非中樞神經(jīng)興奮劑（鹽酸托莫西?。?，但可能會(huì)出現(xiàn)腹痛、惡心、嘔吐、嗜睡和食欲減退等不良反應(yīng)，且長(zhǎng)期療效也存在一定的爭(zhēng)議［15］。五味子最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心之功效，中醫(yī)臨床常用其治療久嗽虛喘、津傷口渴、心悸失眠等癥狀［16］?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，五味子中的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)——五味子木脂素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有廣泛的藥理作用［17］。本課題組前期研究表明，五味子木脂素具有改善睡眠剝奪大鼠的睡眠，以及拮抗睡眠剝奪大鼠的日間功能下降，表現(xiàn)為抗疲勞、抗焦慮樣和抑郁樣作用［18］。但有關(guān)睡眠剝奪大鼠警覺性的影響的報(bào)道較少。本研究旨在通過5～9孔測(cè)試儀評(píng)價(jià)五味子木脂素對(duì)跑步機(jī)睡眠剝奪大鼠警覺性水平的影響及其可能的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠88只，體重90～110 g，SPF級(jí)，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（黑）2020-004］。本研究通過黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及福利倫理委員會(huì)審批（倫理審查編號(hào)：2023113011）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

五味子木脂素凍干粉（總木脂素含量不小于56%）由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥藥理教研室制備；鹽酸托莫西?。―407991）購(gòu)自美國(guó)禮來公司；大鼠食欲素 A酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（JL47983）購(gòu)自江萊生物科技有限公司；一抗c-Fos Rabbit pAb（A16641）、二抗FITC Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（AS011）和β-actin Rabbit mAb（AC026）均購(gòu)自武漢愛博泰克公司；吐溫20（批號(hào)：T6220）購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；一抗HCRTR1 Ab-DF5218（52g4607）、HCRTR2 Ab-DF7162（1414369）均購(gòu)自美國(guó)艾菲公司；二抗IRDye 800CW Goat Anti-Rabbit（bs-40295G-IRDye8）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

5～9孔測(cè)試儀（LE509MO）購(gòu)自美國(guó)哈佛生物公司；跑步機(jī)睡眠剝奪儀（BW-NSD404）購(gòu)自上海軟隆科技發(fā)展有限公司；酶標(biāo)儀（Synergy MX）購(gòu)自美國(guó)BIOTEK 公司；高速低溫冷凍離心機(jī)（3-18R3006004）購(gòu)自美國(guó)TOMOS 有限公司；電泳儀（JY-300E）和垂直電泳槽（JY-SCZ2+）購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；正置顯微鏡（DM4000B）購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；LED數(shù)顯圓周搖床（SLK-O3000-S）購(gòu)自美國(guó)賽洛捷克公司；磁力攪拌器（MS-PB）購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司；雙色熒光成像系統(tǒng)（Odyssey CLx System）購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

每籠飼養(yǎng)4只大鼠，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周，自由飲食飲水。在首次進(jìn)行9孔選擇任務(wù)訓(xùn)練前，大鼠禁食24 h。實(shí)驗(yàn)期間，每只大鼠每天于訓(xùn)練后限制給予飼料10 g，自由獲取水。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)前測(cè)試訓(xùn)練

實(shí)驗(yàn)前測(cè)試訓(xùn)練主要選擇5～9孔測(cè)試儀中的9孔選擇任務(wù)（圖1）。參照文獻(xiàn)［8］中的學(xué)習(xí)訓(xùn)練步驟，9孔選擇任務(wù)包括3個(gè)階段：適應(yīng)訓(xùn)練、強(qiáng)化訓(xùn)練和正式訓(xùn)練。

1.2.3 適應(yīng)訓(xùn)練

每只大鼠每天訓(xùn)練18 min。在前8 min訓(xùn)練中，將大鼠放入5～9孔測(cè)試儀的實(shí)驗(yàn)箱中，實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)箱頂照明燈熄滅，讓大鼠熟悉箱內(nèi)的環(huán)境，并通過在食槽放置15粒獎(jiǎng)勵(lì)飼料顆粒使其了解食槽位置。后10 min訓(xùn)練中，設(shè)置投放裝置每隔30 s自動(dòng)投放獎(jiǎng)勵(lì)飼料1粒。在訓(xùn)練期間，當(dāng)大鼠將全部獎(jiǎng)勵(lì)飼料食盡，此階段訓(xùn)練結(jié)束。此階段訓(xùn)練的目的是讓大鼠熟悉飼料盒的位置及通過投放裝置供給飼料顆粒的方法。適應(yīng)訓(xùn)練持續(xù)時(shí)間設(shè)定為2 d。

1.2.4 強(qiáng)化訓(xùn)練

每只大鼠每天訓(xùn)練30 min。在前15 min訓(xùn)練中，將大鼠放入實(shí)驗(yàn)箱中，9個(gè)信號(hào)燈全亮，若大鼠移至該信號(hào)燈前，鼻觸發(fā)紅外感應(yīng)，則飼料投放裝置自動(dòng)投放飼料1粒。在后15 min訓(xùn)練中，9個(gè)信號(hào)燈全亮，大鼠需要在信號(hào)燈前鼻觸發(fā)紅外感應(yīng)，飼料投放裝置自動(dòng)投放飼料1粒，這時(shí)大鼠需返回食槽并獲取獎(jiǎng)勵(lì)。如大鼠未能返回食槽觸發(fā)食槽紅外感應(yīng)，再次鼻觸信號(hào)燈的紅外感應(yīng)，飼料投放裝置也不會(huì)投放飼料。強(qiáng)化訓(xùn)練期間，若大鼠連續(xù)2 d在后15 min訓(xùn)練程序中獲得超過20粒的獎(jiǎng)勵(lì)飼料，則強(qiáng)化訓(xùn)練結(jié)束后進(jìn)入正式訓(xùn)練階段。此階段訓(xùn)練的目的是讓大鼠在光源信號(hào)與獎(jiǎng)勵(lì)飼料投放之間建立穩(wěn)定的條件反射。完成此項(xiàng)訓(xùn)練平均約5 d。

1.2.5 正式訓(xùn)練

每只大鼠每天訓(xùn)練15 min，將大鼠放入實(shí)驗(yàn)箱中，經(jīng)過3～7 s的間隔期（interatrial interval，ITI），即大鼠完成1輪訓(xùn)練后與下1輪訓(xùn)練周期啟動(dòng)之間的時(shí)間間隔，此時(shí)某一信號(hào)燈亮，當(dāng)大鼠在信號(hào)期（9孔信號(hào)燈隨機(jī)1孔中信號(hào)燈亮起的持續(xù)時(shí)間）和后續(xù)期（信號(hào)燈剛熄滅的3 s內(nèi)）至該信號(hào)燈前觸發(fā)紅外感應(yīng)，飼料投放裝置自動(dòng)投放獎(jiǎng)勵(lì)飼料1粒。當(dāng)完成1輪訓(xùn)練后，即獲得獎(jiǎng)勵(lì)飼料1粒，記為正確反應(yīng)1次。經(jīng)ITI后，啟動(dòng)下1輪訓(xùn)練。當(dāng)大鼠在信號(hào)期和后續(xù)期觸發(fā)未亮信號(hào)燈的紅外感應(yīng)、在ITI期間鼻觸9孔中的任意一孔，則獎(jiǎng)勵(lì)飼料不能自動(dòng)投放，同時(shí)箱頂照明燈亮起并持續(xù)2 s進(jìn)行懲罰，懲罰結(jié)束后箱頂照明燈滅，經(jīng)ITI后，進(jìn)行下1輪訓(xùn)練。最初，訓(xùn)練程序包括3～7 s的ITI后，信號(hào)燈亮起持續(xù)10 s，后續(xù)期3 s，允許實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有強(qiáng)化反應(yīng)的充分時(shí)間。當(dāng)大鼠在15 min的訓(xùn)練中，完成超過20輪訓(xùn)練，并且持續(xù)2 d選擇準(zhǔn)確性超過50%，遺漏率小于20%，進(jìn)行進(jìn)階程序的訓(xùn)練，即信號(hào)期由10 s逐步遞減至1 s（依次為10、5、3、1 s）。在信號(hào)期為1 s，后續(xù)期為3 s的訓(xùn)練中，大鼠連續(xù)3 d的選擇準(zhǔn)確性超過50%，遺漏率小于20%，且3 d的選擇準(zhǔn)確性和遺漏率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為大鼠達(dá)到正式訓(xùn)練完成標(biāo)準(zhǔn)。完成此項(xiàng)訓(xùn)練平均約30 d，該程序旨在慢慢地將每只大鼠的表現(xiàn)推向9孔選擇任務(wù)程序的最終表現(xiàn)（圖2）。

1.2.6 9孔選擇任務(wù)表現(xiàn)的指標(biāo)

大鼠達(dá)到正式訓(xùn)練完成標(biāo)準(zhǔn)后，按照正式訓(xùn)練程序測(cè)定9孔選擇任務(wù)的表現(xiàn)，具體指標(biāo)為：正確反應(yīng)（大鼠在信號(hào)期及后續(xù)期成功獲得獎(jiǎng)勵(lì)飼料的次數(shù)）、不正

確反應(yīng)（大鼠在信號(hào)期及后續(xù)期用鼻觸發(fā)未亮信號(hào)燈的紅外感應(yīng)次數(shù)）、遺漏反應(yīng)（大鼠在信號(hào)期及后續(xù)期未用鼻觸發(fā)信號(hào)燈紅外感應(yīng)的次數(shù)）、提前反應(yīng)（大鼠在ITI用鼻觸發(fā)信號(hào)燈紅外感應(yīng)的次數(shù)，反映較高的沖動(dòng)性水平）、實(shí)驗(yàn)次數(shù)（正確反應(yīng)、不正確反應(yīng)、遺漏反應(yīng)、提前反應(yīng)的總和，反映大鼠的主動(dòng)探索能力）、選擇準(zhǔn)確性［正確次數(shù)/（正確反應(yīng)+不正確反應(yīng)）×100%，反映大鼠的注意力高低，同時(shí)也是作為能否進(jìn)入下一階段的標(biāo)準(zhǔn)之一］、遺漏率［遺漏反應(yīng)/（正確反應(yīng)＋不正確反應(yīng)＋遺漏反應(yīng)）×100%，也是作為能否進(jìn)入下一階段的標(biāo)準(zhǔn)之一］、平均反應(yīng)潛伏期（大鼠在信號(hào)燈亮開始，至用鼻觸發(fā)亮起的信號(hào)燈紅外感應(yīng)的平均反應(yīng)時(shí)間，是檢測(cè)警覺性水平的最敏感指標(biāo)）。

1.3 跑步機(jī)睡眠剝奪復(fù)制大鼠睡眠障礙模型

在大鼠正式進(jìn)行睡眠剝奪前，需先進(jìn)行2 d的跑步機(jī)適應(yīng)訓(xùn)練。在第1、2天均于每天8：00點(diǎn)進(jìn)行1 h的跑步機(jī)適應(yīng)，設(shè)定1 h的適應(yīng)程序（5 min運(yùn)轉(zhuǎn)，5 min停止，速度為3 m/min）。在第3天，進(jìn)行連續(xù)3 d的跑步機(jī)睡眠剝奪（4 s運(yùn)轉(zhuǎn)，12 s停止，速度為3 m/min）。

1.4 跑步機(jī)睡眠剝奪9孔選擇任務(wù)表現(xiàn)的指標(biāo)測(cè)定

達(dá)到訓(xùn)練完成標(biāo)準(zhǔn)的大鼠隨機(jī)選取8只進(jìn)行跑步機(jī)睡眠剝奪。大鼠分別于剝奪前24 h，剝奪2、26、50、74 h，恢復(fù)1、2、3、4 d，進(jìn)行9孔選擇任務(wù)正式訓(xùn)練程序，并測(cè)定9孔選擇任務(wù)表現(xiàn)的指標(biāo)。

1.5 大鼠造模及給藥

達(dá)到訓(xùn)練完成標(biāo)準(zhǔn)的大鼠48只，隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組，睡眠剝奪組，五味子木脂素低、中、高劑量組，鹽酸托莫西汀組，每組8只。除空白組外，各組大鼠均置于跑步機(jī)進(jìn)行連續(xù)3 d的跑步機(jī)睡眠剝奪。剝奪期間，睡眠剝奪組和空白組大鼠于每日早8∶00點(diǎn)、晚20∶00點(diǎn)分別灌胃給予1%羧甲基纖維素鈉溶液（0.005 mL/ g），連續(xù)3 d，五味子木脂素低、中、高劑量組大鼠于每日早8∶00點(diǎn)、晚20∶00點(diǎn)分別灌胃給予不同劑量的五味子木脂素混懸液（33.6、67.2、134.4 mg/kg），連續(xù)3 d。鹽酸托莫西汀組大鼠于每日早8∶00點(diǎn)灌胃給予鹽酸托莫西汀溶液（5.36 mg/kg），晚20∶00點(diǎn)灌胃給予相同體積的1%羧甲基纖維素鈉溶液（0.005 mL/ g），連續(xù)3 d。

1.6 五葉子木脂素對(duì)睡眠剝奪大鼠9孔選擇任務(wù)表現(xiàn)的指標(biāo)測(cè)定

各組大鼠分別于剝奪前，剝奪1、2、3 d，進(jìn)行9孔選擇任務(wù)正式訓(xùn)練程序，測(cè)定各組大鼠剝奪前和剝奪3 d的9孔選擇任務(wù)表現(xiàn)的指標(biāo)。

1.7 取材

另取實(shí)驗(yàn)大鼠，睡眠剝奪方法造模和給藥方法同前。由圖3中的9孔選擇任務(wù)結(jié)果可知，五味子木脂素給藥劑量為67.2 mg/kg時(shí)，具有拮抗跑步機(jī)睡眠剝奪所致大鼠警覺性下降的作用，對(duì)睡眠剝奪大鼠9孔選擇任務(wù)表現(xiàn)的各項(xiàng)指標(biāo)，均具有明顯的改善作用。故將實(shí)驗(yàn)大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、睡眠剝奪組、五味子木脂素組（67.2 mg/kg）和鹽酸托莫西汀組（5.36 mg/kg），每組10只。跑步機(jī)剝奪結(jié)束后，每組隨機(jī)數(shù)字表法取6只大鼠，并將大鼠放入含有乙醚棉球的鐘罩中，待大鼠麻醉后，進(jìn)行眼內(nèi)眥取血。取血后，各組大鼠進(jìn)行4%多聚甲醛心臟灌注，取全腦，固定液（0.1 mol/L磷酸緩沖液，4%多聚甲醛）浸泡后置于4 ℃冰箱中備用。剩余大鼠同法麻醉，斷頭處死，取PFC。血清及PFC置于-80 ℃冰箱中備用。

1.8 ELISA法檢測(cè)血清中食欲素A含量

采用ELISA檢測(cè)血清中食欲素 A水平，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9 免疫熒光染色檢測(cè)PFC腦區(qū)c-Fos蛋白表達(dá)

取大鼠腦組織冰凍切片依次放入0.1 mol/L PBST 6孔板中，將腦片置于0.1 mol/L PBST中漂洗10 min，重復(fù)3次；以0.2%的Triton X-100溶液于室溫孵育15 min；PBST沖洗10 min，重復(fù)3次；10%的山羊血清封閉處理1 h；1∶100稀釋c-Fos一抗孵育過夜（4 ℃冰箱）；隔日取出復(fù)溫1 h后PBST沖洗10 min，重復(fù)3次；將腦片避光放入1∶100稀釋的熒光二抗溶液，在37 ℃水浴孵育90 min；PBST沖洗10 min，重復(fù)3次；DAPI處理10 min；PBST沖洗10 min，重復(fù)3次；封片后使用熒光顯微鏡采集圖片，lmage J軟件對(duì)免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量分析。

1.10 Western blot 檢測(cè)大鼠PFC腦區(qū)食欲素-R1和食欲素-R2表達(dá)

取大腦的PFC經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌后，采用RIPA裂解液裂解，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，根據(jù)目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量，配制 8%分離膠，5%濃縮膠。待檢測(cè)蛋白樣品上樣量20 μg/孔進(jìn)行電泳分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。含5% 脫脂牛奶的 PBST 封閉液中搖床封閉1 h，PBST 洗膜后，分別加入已稀釋好的CLOCK一抗（1∶1000）、BMAL1 一抗（1∶1000）、PER1一抗（1∶500）、PER2一抗（1∶1000）及 β-actin一抗（1∶50 000）、食欲素-R1一抗（1∶1000）、食欲素-R2一抗（1∶1000）、內(nèi)參β-actin（1∶10 000）中，置于4 ℃下孵育過夜。PBST漂洗后，加入熒光二抗（1∶10 000）封膜，室溫避光孵育1 h，PBST洗膜，利用熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影成像，采用Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有指標(biāo)采用Shapiro Wilk檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，均符合正態(tài)分布，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用Tukey檢驗(yàn)，雙側(cè)Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 跑步機(jī)睡眠剝奪對(duì)大鼠9孔選擇任務(wù)表現(xiàn)的影響

與剝奪前24 h相比，跑步機(jī)連續(xù)睡眠剝奪2 h后，大鼠9孔選擇任務(wù)表現(xiàn)的各項(xiàng)指標(biāo)無變化（P均gt;0.05）；跑步機(jī)連續(xù)睡眠剝奪26 h后，大鼠的正確反應(yīng)（P=0.018）和實(shí)驗(yàn)次數(shù)（P=0.034）均顯著降低，遺漏反應(yīng)（Plt;0.001）和遺漏率（P=0.002）均顯著增高；跑步機(jī)連續(xù)睡眠剝奪50 h后，僅見大鼠遺漏率顯著升高（P=0.004）；跑步機(jī)連續(xù)睡眠剝奪74 h后，大鼠正確反應(yīng)（P=0.003）、試驗(yàn)次數(shù)（P=0.001）和選擇準(zhǔn)確性（P=0.001）均顯著降低，遺漏反應(yīng)（P=0.005）、遺漏率（Plt;0.001）和平均反應(yīng)潛伏期（P=0.014）均顯著升高。跑步機(jī)連續(xù)睡眠剝奪結(jié)束后，恢復(fù)1～4 d，大鼠的9孔選擇任務(wù)表現(xiàn)的各項(xiàng)指標(biāo)與剝奪前24 h比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均gt;0.05）（表 1）。

2.2 五味子木脂素對(duì)跑步機(jī)睡眠剝奪前后大鼠9孔選擇任務(wù)表現(xiàn)的影響

剝奪前9孔選擇任務(wù)表現(xiàn)的指標(biāo)各組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均gt;0.05），數(shù)據(jù)具有可比性。與空白組相比，跑步機(jī)剝奪3 d后睡眠剝奪組大鼠的正確反應(yīng)（P=0.004）、不正確反應(yīng)（P=0.041）、遺漏反應(yīng)（P=0.002）、提前反應(yīng)（P=0.014）、試驗(yàn)次數(shù)（P=0.040）、選擇準(zhǔn)確性（Plt;0.001）、遺漏率（P=0.003）、平均反應(yīng)潛伏期（P=0.022）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與睡眠剝奪組相比，五味子木脂素低、中、高劑量組和鹽酸托莫西汀組大鼠的遺漏反應(yīng)（Plt;0.001，P=0.001，P=0.001，Plt;0.001）和遺漏率（P=0.003，P=0.001，P=0.002，Plt;0.001）均顯著降低，此外，五味子木脂素中、高劑量組的選擇準(zhǔn)確性（P=0.001，P=0.006）均顯著升高，平均反應(yīng)潛伏期（P=0.018，P=0.003）均顯著降低；鹽酸托莫西汀組大鼠的正確反應(yīng)和選擇準(zhǔn)確性（P均lt;0.001）均顯著升高，平均反應(yīng)潛伏期（P=0.014）顯著降低；與五味子木脂素低劑量組相比，鹽酸托莫西汀組大鼠的選擇準(zhǔn)確性（P=0.022）顯著升高（圖3）。

2.3 五味子木脂素對(duì)跑步機(jī)睡眠剝奪大鼠血清中食欲素A含量的影響

與剝奪前相比，剝奪后睡眠剝奪組（P=0.001）、五味子木脂素組（67.2 mg/kg）（P=0.005）和鹽酸托莫西汀組（5.36 mg/kg）（P=0.029）大鼠的血清食欲素A水平均顯著增加，增加的幅度依次為65%、32%和10%。剝奪前各組大鼠血清食欲素A水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均gt;0.05），各組數(shù)據(jù)具有可比性。與剝奪后空白組相比，剝奪后睡眠剝奪組大鼠血清中食欲素A水平顯著升高（Plt;0.001）；與剝奪后睡眠剝奪組相比，剝奪后五味子木脂素組（67.2 mg/kg）（P=0.010）和鹽酸托莫西汀組（5.36 mg/kg）（P=0.010）大鼠血清食欲素A水平均顯著降低（表2）。

2.4 五味子木脂素對(duì)跑步機(jī)睡眠剝奪大鼠PFC腦區(qū)c-Fos蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，睡眠剝奪組大鼠PFC腦區(qū)神經(jīng)元c-Fos蛋白表達(dá)顯著升高（Plt;0.001）。與睡眠剝奪組相比，五味子木脂素組（67.2 mg/kg）和鹽酸托莫西汀組（5.36 mg/kg）大鼠PFC腦區(qū)神經(jīng)元c-Fos蛋白表達(dá)均顯著降低（P=0.028，P=0.036）（圖4）。

2.5 五味子木脂素對(duì)跑步機(jī)睡眠剝奪大鼠PFC腦區(qū)食欲素受體1和食欲素受體2表達(dá)的影響

與空白組相比，睡眠剝奪組大鼠PFC腦區(qū)中食欲素受體1蛋白表達(dá)水平顯著減少（P=0.037），食欲素受體2蛋白表達(dá)水平有減少趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.462）。與睡眠剝奪組相比，五味子木脂素組（67.2 mg/kg）（P=0.043）和鹽酸托莫西汀組（5.36 mg/kg）（P=0.013）大鼠PFC腦區(qū)中食欲素受體1蛋白表達(dá)水平均顯著增加，食欲素受體2蛋白表達(dá)水平有增加的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.051，P=0.180）（圖5）。

3 討論

本研究結(jié)果表明，跑步機(jī)持續(xù)睡眠剝奪可使大鼠的警覺水平下降，這種警覺水平的下降可隨著睡眠的恢復(fù)而提高。五味子木脂素（67.2 mg/kg，每天2次）可拮抗跑步機(jī)睡眠剝奪所致的大鼠警覺性下降，其作用機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)食欲素分泌和PFC的食欲素受體1表達(dá)有關(guān)。

睡眠剝奪24 h后，跑步機(jī)睡眠剝奪方法對(duì)警覺性表現(xiàn)中的各項(xiàng)指標(biāo)影響不同。Christie 等［19］通過活動(dòng)輪旋轉(zhuǎn)的方式對(duì)大鼠進(jìn)行24 h睡眠剝奪，僅觀察到大鼠警覺性表現(xiàn)的反應(yīng)延遲、失誤反應(yīng)顯著增加。Oonk

等［20］通過輕柔處理的方式對(duì)大鼠進(jìn)行24 h完全睡眠剝奪，與剝奪前相比，睡眠剝奪大鼠表現(xiàn)出更多的錯(cuò)誤反應(yīng)和過早反應(yīng)。由此可見，大鼠警覺性表現(xiàn)中各項(xiàng)指標(biāo)的變化與睡眠剝奪方法相關(guān)，且睡眠剝奪時(shí)間24 h對(duì)警覺性水平的主要指標(biāo)——平均反應(yīng)潛伏期無影響。本研究顯示跑步機(jī)持續(xù)睡眠剝奪74 h時(shí)，大鼠警覺性表現(xiàn)中的平均反應(yīng)潛伏期明顯升高，警覺水平下降，且在恢復(fù)的第1天，警覺性水平得以恢復(fù)。盡管與本研究使用的睡眠剝奪方法不同，Deurveilher等［21］研究顯示，大鼠通過旋轉(zhuǎn)籠進(jìn)行為期2 d慢性睡眠限制，其警覺性表現(xiàn)中延長(zhǎng)的平均反應(yīng)潛伏期于睡眠限制后的第1或2天均恢復(fù)至剝奪前水平。以上結(jié)果表明，睡眠恢復(fù)可以使受損的警覺水平得以恢復(fù)。

本研究顯示五味子木脂素可拮抗跑步機(jī)睡眠剝奪所致的大鼠血清中食欲素 A含量的增加。在清醒和睡眠的調(diào)節(jié)中，食欲素系統(tǒng)被認(rèn)為是機(jī)體的覺醒啟動(dòng)開關(guān)，用于維持覺醒的狀態(tài)和睡眠穩(wěn)定［22］，參與注意力、警覺、學(xué)習(xí)記憶等多種神經(jīng)活動(dòng)的相關(guān)調(diào)節(jié)［11，23］。食欲素能系統(tǒng)可通過增加皮質(zhì)乙酰膽堿的釋放和皮質(zhì)神經(jīng)元活動(dòng)促進(jìn)注意力處理，在相同的精神運(yùn)動(dòng)性警覺任務(wù)表現(xiàn)下，食欲素 A分泌水平越高，相應(yīng)神經(jīng)元的持續(xù)覺醒調(diào)節(jié)能力越強(qiáng)，警覺性表現(xiàn)越穩(wěn)定［24］。睡眠剝奪會(huì)導(dǎo)致大鼠食欲素神經(jīng)元活性增強(qiáng)，血清中的食欲素 A水平增加［25］。與本研究結(jié)果一致，王忠等［25］研究顯示24 h的睡眠剝奪會(huì)導(dǎo)致受試對(duì)象血清中食欲素 A含量上升，其含量變化與精神運(yùn)動(dòng)性警覺任務(wù)中的中位反應(yīng)時(shí)間變化呈負(fù)相關(guān)。倪麗艷等［12］研究顯示睡眠剝奪會(huì)導(dǎo)致大鼠下丘腦食欲素 A的過度表達(dá)，損害其空間學(xué)習(xí)記憶能力。然而，多數(shù)研究支持警覺性水平與覺醒水平呈正相關(guān)［26-27］。推測(cè)食欲素 A對(duì)機(jī)體警覺性具有雙向調(diào)控作用，當(dāng)機(jī)體食欲素 A含量過高時(shí)，導(dǎo)致機(jī)體處于過度覺醒狀態(tài)，從而造成9孔選擇任務(wù)表現(xiàn)受損，警覺性水平降低。

c-Fos蛋白是神經(jīng)元受到刺激后被激活的一種標(biāo)志物，可作為神經(jīng)元激活的標(biāo)志，與注意力等認(rèn)知功能有關(guān)［28］。研究顯示大鼠鼻內(nèi)食欲素 A給藥可上調(diào)介導(dǎo)重要認(rèn)知功能腦區(qū)的c-Fos蛋白的表達(dá)，增加前額葉皮層的乙酰膽堿外排，改善注意相關(guān)認(rèn)知功能［29］。動(dòng)物清醒程度與c-Fos蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)［30］。本研究顯示睡眠剝奪會(huì)增加PFC的c-Fos蛋白表達(dá)，五味子木脂素給藥后可激活PFC來逆轉(zhuǎn)這種變化。崔建梅等［31］研究顯示睡眠剝奪后前額葉腦區(qū)c-Fos的表達(dá)增多。相反，Basheer 等［32］研究顯示大腦皮層c-Fos表達(dá)水平在強(qiáng)制覺醒的6或12 h內(nèi)保持高水平，但隨著剝奪時(shí)間的增加而迅速下降。由此可見，睡眠剝奪導(dǎo)致c-Fos表達(dá)變化與剝奪時(shí)長(zhǎng)及外界多種因素有關(guān)，在短時(shí)間的睡眠剝奪中，大鼠受應(yīng)激刺激占比較大，隨剝奪時(shí)間延長(zhǎng)，其逐漸適應(yīng)刺激，導(dǎo)致其表達(dá)下降。

食欲素能神經(jīng)元分泌的食欲素A和食欲素B是促進(jìn)覺醒的重要中樞興奮性遞質(zhì)。PFC是與注意力、警覺性和認(rèn)知功能相關(guān)的重要腦區(qū)，存在食欲素受體1和食欲素受體2兩種受體［33］，可接受食欲素神經(jīng)纖維的投射。本研究顯示睡眠剝奪后食欲素受體1表達(dá)減少，在給予五味子木脂素后上調(diào)。然而，么嵌巍等［34］研究顯示小平臺(tái)水環(huán)境睡眠剝奪后，腦組織中食欲素受體1、食欲素受體2表達(dá)均上調(diào)。造成這種差異性的原因，可能與測(cè)定的腦區(qū)和睡眠剝奪方法的不同有關(guān)。

安非他明、哌甲酯和咖啡因等中樞興奮藥在人類注意力和沖動(dòng)行為等認(rèn)知領(lǐng)域被廣泛研究，但在提高注意力方面的報(bào)道存在諸多矛盾。有研究表明，安非他明可降低平均反應(yīng)潛伏期，并顯著增加提前反應(yīng)，但對(duì)正確反應(yīng)沒有影響［35］。然而，Grottick等［36］研究顯示，安非他明可提高正確反應(yīng)，但對(duì)平均反應(yīng)潛伏期無影響。Bizarro等［37］研究表明，不同劑量的咖啡因?qū)ψ⒁饬τ绊懖煌?，小劑量咖啡因可增加正確反應(yīng)和提前反應(yīng)，減少平均反應(yīng)潛伏期和遺漏反應(yīng)，而大劑量咖啡因反而增加遺漏反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，五味子木脂素（67.2 mg/kg）與鹽酸托莫西汀作用相似，可減少睡眠剝奪大鼠的遺漏反應(yīng)和平均反應(yīng)潛伏期，增加正確反應(yīng)。鹽酸托莫西汀是一種非中樞興奮藥，可用于治療兒童及青少年的注意缺陷。有研究顯示，兒童患者口服鹽酸托莫西汀治療時(shí)，可產(chǎn)生體重下降，并伴有腹痛、嗜睡和嘔吐等不良反應(yīng)；成年人常見的不良反應(yīng)是惡心、失眠、尿潴留和疲勞［38］。

綜上，與鹽酸托莫西汀相比，五味子木脂素安全性較高，且表現(xiàn)出改善睡眠、抗疲勞等藥理作用，五味子木脂素具有開發(fā)成為拮抗睡眠剝奪所致的警覺性水平下降藥物的潛力。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 武亞楠：參與本研究的選題、設(shè)計(jì)，對(duì)數(shù)據(jù)搜集、分析、解釋工作，按編輯部的修改意見進(jìn)行核修，對(duì)擬發(fā)表的文稿做最后的審閱和定稿；馬青：對(duì)數(shù)據(jù)搜集、分析，對(duì)學(xué)術(shù)問題進(jìn)行解答；王艷艷：對(duì)重要學(xué)術(shù)性內(nèi)容做出關(guān)鍵性修訂；黃莉莉：參與研究的選題、設(shè)計(jì)，對(duì)學(xué)術(shù)問題進(jìn)行解答，同意對(duì)研究工作各方面的誠(chéng)信問題負(fù)責(zé)

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-11-01）