HPLC同時(shí)測(cè)定小兒肺熱咳喘顆粒中3種成分的含量

摘 要：目的：建立同時(shí)測(cè)定小兒肺熱咳喘顆粒中綠原酸、連翹酯苷A和黃芩苷3種成分含量的高效液相色譜法。方法：所用色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0. 2%甲酸溶液，采用梯度洗脫模式。流動(dòng)相流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：綠原酸濃度在2.69～134.30 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r =0.9998），平均回收率為99.37 %，RSD為1.20 %（n =6）。連翹酯苷A濃度在11.81～590.60 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r =0.9995），平均回收率為98.14 %，RSD為1.57 %（n =6）。黃芩苷濃度在21.44～1072.25 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r =0.9998），平均回收率為99.14 %，RSD為1.66 %（n =6）。結(jié)論：該方法專屬性強(qiáng)，可對(duì)組方中主要藥味金銀花、連翹、黃芩、魚腥草進(jìn)行含量檢測(cè)，可用于小兒肺熱咳喘顆粒的整體質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法，小兒肺熱咳喘顆粒，綠原酸，連翹酯苷A，黃芩苷

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2023.24.031

0 引 言

小兒肺熱咳喘顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)，收載于成方制劑第十八冊(cè)，由經(jīng)典名方麻杏石甘湯、白虎湯、銀翹散加減組成，藥味主要由麻黃、金銀花、連翹、黃芩、魚腥草等十一味藥材組成，具有清熱解毒、宣肺止咳、化痰平喘的功效，可用于依從性差的小兒所患感冒、支氣管炎等痰熱諸癥[1]。該制劑藥味較多，工藝繁瑣，各種成分相互作用。但執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀、鑒別及檢查項(xiàng)，標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)項(xiàng)目較少，無(wú)法反映所用藥材質(zhì)量情況和生產(chǎn)工藝執(zhí)行情況，不能從整體上有效滿足藥品質(zhì)量控制要求。

小兒肺熱咳喘顆粒中金銀花、連翹、黃芩和魚腥草都具有清熱解毒的功效，是該藥的重要組成部分。綠原酸為金銀花和魚腥草的主要活性成分，連翹酯苷A和黃芩苷分別為連翹和黃芩的主要活性成分，其含量常用來(lái)作為控制藥材質(zhì)量的檢測(cè)指標(biāo)[2-9]。本文建立的高效液相色譜法可以同時(shí)測(cè)定上述3種活性成分的含量，為小兒肺熱咳喘顆粒質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高完善提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aiglent 1260高效液相色譜儀（安捷倫公司）；XS105 DualRange型十萬(wàn)分之一天平（Mettler公司）；FRQ-1006HT型超聲波清洗器（杭州法蘭特公司）。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-202119，含量以96.3%計(jì)）、連翹酯苷A對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111810-202108，含量以96.2%計(jì)）、黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715-202122，含量以94.2%計(jì)）；甲醇為色譜純，甲酸為色譜純，水為超純水。小兒肺熱咳喘顆粒（市售，批號(hào)為20020623，21030113，21090113）；陰性對(duì)照制劑為自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～15 min，20 %A；15～30min，20 %A→40 %A；30～40 min，40 %A→50%A；40～50 min，50 %A；50～51 min，50 %A→20%A；51～60 min，20 %A）；流速1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm；進(jìn)樣體積10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對(duì)照品14 mg、連翹酯苷A對(duì)照品12 mg和黃芩苷對(duì)照品22 mg，分別置于50、10、10mL容量瓶中，加70 %甲醇至刻度，搖勻，即得濃度分別為0.2686 、1.1812、2.1445 mg/mL的對(duì)照品貯備溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品貯備溶液1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，制成混合對(duì)照品溶液（含綠原酸26.86 μg/mL，連翹酯苷A118.12 μg/mL，黃芩苷214.45 μg/mL）。

分別精密吸取上述對(duì)照品貯備溶液0.1 、0.2 、0.5 、1 、2 、5 mL，置10 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，即得6種濃度混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取小兒肺熱咳喘顆粒適量，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置250 mL燒瓶中，加入環(huán)己烷適量，索氏提取6小時(shí)，藥渣揮干溶劑，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，室溫超聲處理30 min，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備

處方中不含金銀花、魚腥草、連翹和黃芩4味藥材，其余制備工藝同小兒肺熱咳喘顆粒。按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下的3種溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。陰性對(duì)照樣品及供試品在對(duì)照品相同保留時(shí)間無(wú)干擾。結(jié)果見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），在考察濃度范圍內(nèi)計(jì)算回歸方程和擬合系數(shù)。結(jié)果表明線性方程擬合系數(shù)均高于0.995，線性關(guān)系良好。結(jié)果見表1。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

按“2 .1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取同一混合對(duì)照品溶液（含綠原酸26.86 μg /mL，連翹酯苷A118.12 μg/mL，黃芩苷214.45 μg/mL），連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷峰3種成分峰面積并計(jì)算各自R SD，結(jié)果各成分峰面積的RSD分別為1.27 %、0.62 %、0.89 %，均不大于2.0%，表明該方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取供試品小兒肺熱咳喘顆粒（批號(hào)：21090113）6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算含量，測(cè)得綠原酸、連翹酯苷A和黃芩苷含量的RSD分別為0.86%、0.27%、1.12%，均不大于2.0%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h時(shí)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.26%、0.83%、0.59%，均不大于2.0%，表明在24 h內(nèi)被測(cè)成分未發(fā)生明顯降解、氧化等，穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的供試品（批號(hào)：21090113）約1 g，精密稱定，分別加入一定量的對(duì)照品溶液，同法進(jìn)行供試品處理和測(cè)定，分別計(jì)算3種待測(cè)成分的回收率，結(jié)果見表2。

2.9 樣品含量測(cè)定

取3批供試品按“2 .1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定供試品中綠原酸、連翹酯苷A和黃芩苷的含量，結(jié)果見表3。

3 討 論

3.1 色譜條件的選擇

作為反向色譜重點(diǎn)考察了有機(jī)相與水相選擇及配比，包括乙腈、甲醇、不同濃度的冰醋酸水溶液、磷酸水溶液和甲酸水溶液，進(jìn)行等度洗脫和梯度洗脫的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)等度洗脫出峰時(shí)間較長(zhǎng)且分離效果較差，采用甲醇-0.2%甲酸梯度洗脫目標(biāo)峰分離效果良好。檢測(cè)波長(zhǎng)則考察了280 nm和327 nm兩個(gè)波長(zhǎng)，在327 nm檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，可兼顧3種成分均具有較好的紫外吸收。故色譜條件最終選擇流動(dòng)相為甲醇-0.2%甲酸梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm。

3.2 提取條件的選擇

提取溶劑考察了甲醇、乙醇、70%甲醇和70%乙醇四種溶劑，并對(duì)加熱回流提取、超聲提取和索氏提取方法及提取時(shí)間進(jìn)行了綜合考察。結(jié)果表明索氏提取除雜后進(jìn)樣效果最好；加熱回流提取和超聲提取兩種方式結(jié)果無(wú)顯著差異，故選用了環(huán)己烷索氏提取后70%甲醇超聲處理法；考察了索氏提取時(shí)間，發(fā)現(xiàn)6小時(shí)后索氏提取管中提取液澄清無(wú)色，故選取索氏提取時(shí)間為6小時(shí)；對(duì)超聲提取時(shí)間分別考察了10、20、30、40 min，超聲30 min時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲30 min時(shí)能夠提取完全，故選取超聲時(shí)間為30min。

4 結(jié) 論

中成藥是一個(gè)復(fù)雜的混合物體系，選擇其中藥理活性較強(qiáng)的幾種有效成分作為檢測(cè)指標(biāo)，可以簡(jiǎn)便快捷的評(píng)價(jià)中成藥的質(zhì)量。小兒肺熱咳喘顆粒處方中金銀花、連翹、黃芩和魚腥草是小兒肺熱咳喘顆粒發(fā)揮清熱解毒作用的主要藥味，而現(xiàn)行部頒標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單，無(wú)專屬性鑒別項(xiàng)和含量測(cè)定項(xiàng)，無(wú)法有效評(píng)價(jià)小兒肺熱咳喘顆粒整體質(zhì)量情況，本文建立的高效液相色譜法可同時(shí)測(cè)定這4味藥的主要活性成分。通過摸索色譜條件、樣品提取方法和進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，表明該方法專屬性、穩(wěn)定性較好，準(zhǔn)確度高且方便快捷，能更加全面準(zhǔn)確的控制小兒肺熱咳喘顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，可為藥品生產(chǎn)企業(yè)內(nèi)部質(zhì)量控制和監(jiān)管部門質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供技術(shù)依據(jù)。

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作者簡(jiǎn)介

張朋，碩士，主管藥師，從事藥品檢驗(yàn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。

（責(zé)任編輯：袁文靜）