“通督調(diào)神”電針預處理介導miR-124-3p/GSK-3β/Cyp-D信號通路對腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質線粒體通透性轉換孔的影響及機制探討

【摘要】 背景 缺血性腦卒中發(fā)病率、死亡率、致殘率均較高，溶栓后的再灌注損傷對患者影響較大，針刺是治療本病的特色療法，但作用機制尚不明確。目的 探討“通督調(diào)神”電針預處理對腦缺血再灌注損傷（CIRI）大鼠miR-124-3p/糖原合成酶激酶β（GSK-3β）/親環(huán)素D（Cyp-D）信號通路及線粒體膜通透性轉換孔（MPTP）的影響，探討其防治CIRI的可能機制。方法 2022年6—8月，將100只清潔級SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、電針組、抑制劑組和電針+激動劑組，每組20只。造模前干預7 d，電針組、電針+激動劑組選取通督調(diào)神穴組：百會、風府、大椎穴進行電針干預，1次/d，連續(xù)7 d；造模前24 h電針+激動劑組和抑制劑組分別側腦室注射miR-124激動劑和抑制劑（5 nmol）。除假手術組，余組采用改良線栓法制備大鼠右側腦缺血再灌注模型；造模成功后，取大鼠右側腦皮質，采用改良神經(jīng)功能損傷評分量表（mNSS）、TTC染色觀察各組大鼠神經(jīng)功能損傷程度，TUNEL染色以及透射電鏡觀察神經(jīng)細胞損傷情況；免疫熒光染色、Western blotting、實時熒光定量PCR檢測各組大鼠腦皮質GSK-3β、p-GSK-3β、Cyp-D、細胞色素C（Cyt-C）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）表達；流式細胞檢測MPTP開放程度，MPTP 陽性細胞率越高，代表MPTP開放程度越大。結果 除假手術組，各組大鼠均造模成功。與假手術組比較，模型組大鼠mNSS評分及相對腦梗死體積均增加，線粒體結構破壞嚴重，細胞凋亡指數(shù)升高，p-GSK-3β、Cyp-D陽性表達分別減弱和增強，miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達增高，p-GSK-3β/ GSK-3β值降低，Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3蛋白相對表達量增高，MPTP開放程度增加（Plt;0.05）。與模型組比較，電針組、抑制劑組mNSS評分及相對腦梗死體積均降低，線粒體結構破壞減輕，p-GSK-3β/GSK-3β增加，Caspase-3蛋白相對表達量降低；電針+激動劑組GSK-3β mRNA表達增高（Plt;0.05）；電針組、抑制劑組、電針+激動劑組細胞凋亡指數(shù)降低，

p-GSK-3β、Cyp-D陽性表達分別減弱和增強，miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達降低，Cyp-D、Cyt-C蛋白相對表達量降低，MPTP開放程度降低（Plt;0.05）。與電針組比較，抑制劑組p-GSK-3β陽性表達增強，Cyp-D陽性表達減弱，miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達降低，GSK-3β mRNA表達增高，Cyp-D、Cyt-C蛋白相對表達量降低，MPTP開放程度降低（Plt;0.05）；電針+激動劑組細胞凋亡指數(shù)增高，p-GSK-3β陽性表達減弱，Cyp-D陽性表達增強，miR-124-3p、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達增高，Cyp-D、Cyt-C蛋白相對表達量增高，MPTP開放程度增加（Plt;0.05）。結論 “通督調(diào)神”電針預處理可減輕CIRI大鼠神經(jīng)損傷，其機制可能與介導miR-124-3p/GSK-3β/Cyp-D信號通路、抑制MPTP開放進而減輕細胞損傷相關。這一研究結果從機制上進一步驗證了“通督調(diào)神”針法治療CIRI的療效，同時為中醫(yī)“治未病”提供新的科學依據(jù)，促進臨床應用。

【關鍵詞】 再灌注損傷；腦缺血；卒中；線粒體通透性轉換孔；通督調(diào)神；電針療法；miR-124-3p；穴，百會；穴，風府；穴，大椎

【中圖分類號】 R 619.9 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0056

【引用本文】 張國慶，童婷婷，王穎，等. “通督調(diào)神”電針預處理介導miR-124-3p/GSK-3β/Cyp-D信號通路對腦缺血再灌注損傷大鼠腦皮質線粒體通透性轉換孔的影響及機制探討［J］. 中國全科醫(yī)學，2023，26（24）：3050-3060. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0056. ［www.chinagp.net］

【Abstract】 Background The incidence，mortality and disability rates of ischemic stroke are high，and the reperfusion injury after thrombolytic therapy has a great impact on patients. Acupuncture is a characteristic therapy for the treatment of the disease，but the action mechanism remains unclear. Objective To observe the effect of Tongdu Tiaoshen electroacupuncture （EA） pretreatment on miR-124-3p/glycogen synthase kinase β（GSK-3β）/cyclin D （Cyp-D） signaling pathway and mitochondrial permeability transition pore（MPTP） of cerebral ischemia-reperfusion injury （CIRI） rats，and explore its possible mechanism of prevention and control of CIRI. Methods From June to August 2022，a total of 100 clean SD rats were randomly divided into the sham operation group，model group，EA group，agonist group and EA + inhibitor group，with 20 rats in each group. For 7 d of intervention before modeling，in the EA group and EA + inhibitor group，\"Baihui\"（GV 20），\"Fengfu\"（GV 16）and \"Dazhui\"（GV 14）were selected to perform electroacupuncture 1 time a day for 7 days. For 24 h before modeling，miR-124 agonist and inhibitor （5 nmol） were injected into the lateral ventricles in the EA + agonist group and inhibitor group. Except for the sham operation group，the right cerebral ischemia-reperfusion model of rats was prepared by the modified suture method in the rest groups. The right cerebral cortex of rats was taken，the degree of neurological impairment in each group was observed using mNSS scale and TTC staining，the nerve cell injury was observed by TUNEL staining and transmission electron microscopy. The expressions of GSK-3β，p-GSK-3β，Cyp-D，Cyt-C and Caspase-3 in cerebral cortex of each group were detected by immunofluorescence staining，Western blot and real-time quantitative PCR. The degree of MPTP openness was detected by flow cytometry，the higher rate of MPTP-positive cells indicated greater degress of MPTP openness. Results Except for the sham operation group，all rest groups of rats were successfully modeled. Compared with the sham operation group，mNSS score and infarct volume of brain tissue were increased，mitochondrial structure was seriously damaged，cell apoptosis index was increased，p-GSK-3β positive expression was reduced，Cyp-D positive expression was enhanced，miR-124-3p，Cyp-D，Cyt-C and Caspase-3 mRNA expressions were increased，p-GSK-3β/ GSK-3β ratio was decreased，relative Cyp-D，Cyt-C，and Caspase-3 protein expressions were increased，and MPTP openness degree was increased in the model group（Plt;0.05）. Compared with the model group，mNSS score and relative infarct volume were decreased，mitochondrial structure destruction was relieved，p-GSK-3β/GSK-3β ratio was increased，and relative expression of Caspase-3 protein was decreased in the electroacupuncture group and inhibitor group；the mRNA expression of GSK-3βwas increased in electroacupuncture + agonist group（Plt;0.05）；apoptosis index was decreased，positive expression of p-GSK-3β was reduced and positive expression of Cyp-D was enhanced respectively，miR-124-3p，Cyp-D，Cyt-C and Caspase-3 mRNA expressions were decreased，Cyp-D and Cyt-C protein expressions were decreased，the degree of MPTP openness was decreased in the electroacupuncture group，inhibitor group and electroacupuncture + agonist group（Plt;0.05）. Compared with the electroacupuncture group，p-GSK-3β positive expression was enhanced，Cyp-D positive expression was reduced，miR-124-3p and Cyp-D，Cyt-C，Caspase-3 mRNA expressions were decreased，GSK-3β mRNA expression was increased，Cyp-D and Cyt-C protein expressions were decreased，and MPTP openness degree was reduced in the agonist group（Plt;0.05）；the apoptosis index was increased，the positive expression of P-GSK-3β was reduced，the positive expression of Cyp-D was enhanced，the expressions of miR-124-3p，Cyt-C and Caspase-3 mRNA were increased，the expressions of Cyp-D and Cyt-C protein were increased，and the openness degree of MPTP was increased in the electroacupuncture + agonist group（Plt;0.05）. Conclusion Tongdu Tiaoshen electroacupuncture pretreatment can alleviate neurological impairment in cerebral ischemia-reperfusion rats，the mechanism may be related to mediating miR-124-3p/GSK-3β/Cyp-D signaling pathway，inhibiting MPTP openness and thus reducing cell injury. The results of this study further verified the therapeutic effect of Tongdu Tiaoshen electroacupuncture in the treatment of CIRI from the mechanism，providing a new scientific basis for preventive treatment of disease of TCM and promote its clinical application.

【Key words】 Reperfusion injury；Brain ischemia；Stroke；Mitochondrial permeability transition pore；Tongdu Tiaoshen；Electroacupuncture therapy；miR-124-3p；Point GV20 （Baihui）；Point GV16 （Fengfu）；Point GV14 （Dazhui）

腦卒中是人類致死和致殘的主要疾病之一［1］，其中，缺血性腦卒中的發(fā)生率約為87%［2］。目前國際公認的急性期腦卒中的有效治療手段是盡早溶栓、恢復血流［3］，然而恢復缺血區(qū)血流會不可避免地加重缺血性腦損傷，引起腦缺血再灌注損傷（CIRI）［4］。研究發(fā)現(xiàn)，電針預處理對CIRI具有抑制炎性反應、調(diào)節(jié)自噬、抗氧化應激等作用［5-6］。然而，有關電針防治CIRI的作用機制尚未能完全明晰，有待進一步研究。

CIRI的病理過程較為復雜，線粒體作為細胞的動力源在細胞能量穩(wěn)態(tài)中起著關鍵作用［7］，線粒體功能障礙是器官再灌注損傷發(fā)生后誘發(fā)機體損傷的重要因素［8-9］。因此，靶向線粒體可能是缺血性卒中的重要防治策略之一［10］。線粒體通透性轉換孔（MPTP）開放是線粒體功能障礙以及誘發(fā)神經(jīng)元凋亡級聯(lián)反應的關鍵環(huán)節(jié)［11］。親環(huán)素D（Cyp-D）是調(diào)控MPTP的關鍵蛋白，當MPTP異常開放后，線粒體內(nèi)膜上細胞色素C（Cyt-C）等被釋放入細胞質中，進而激活凋亡相關蛋白，誘發(fā)細胞凋亡［12］。

微小RNA在調(diào)節(jié)多種細胞功能中發(fā)揮重要作用，其中miR-124特異性表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)［13］。研究顯示，miR-124的異常表達與腦損傷密切相關［14］，且miR-124與糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β） mRNA之間可能存在靶向關系［15］。GSK-3β可以通過直接調(diào)節(jié)MPTP而維持線粒體功能［16］。電針預處理對CIRI的神經(jīng)保護作用是否與miR-124-3p/GSK-3β/Cyp-D信號通路介導的MPTP開放度降低相關，值得關注。

本研究通過觀察“通督調(diào)神”電針預處理對CIRI大鼠缺血側腦皮質神經(jīng)元線粒體MPTP的影響，探討電針預處理對CIRI大鼠的潛在神經(jīng)保護機制，為促進“通督調(diào)神”針刺法在缺血性腦卒中的臨床應用提供新的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SPF級雄性SD大鼠100只，鼠齡7周，體質量200～250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司〔許可證號：SCXK（湘）2019-0004〕，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學實驗動物中心。飼養(yǎng)條件：Ⅱ級，溫度（23±2） ℃，相對濕度（60±10）%，自由攝食飲水，12 h/12 h明暗周期。適應性飼養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術組、模型組、電針組、抑制劑組與電針+激動劑組，每組20只。本次實驗過程中對大鼠的處置符合國家科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》中的相關規(guī)定，并取得安徽中醫(yī)藥大學倫理委員會批準（倫理編號：AHUCM-rats-2021012）。

1.2 主要試劑與儀器 小鼠抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（TA-08）、山羊抗小鼠IgG（HRP，ZB-2305）、山羊抗兔IgG（HRP，ZB-2301）均購于北京Zsbio公司。GSK3β抗體（BS1402）、p-GSK3β抗體（BS4084）購于美國Bioworld公司，Cyp-D抗體（ABP52875）購于瑞士Abbkin公司，Cyt C抗體（BA0781）購于美國Boster公司，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（ab184787）購于英國abcam公司；PCR引物（上海Sangon Biotech公司）；原位末端轉移酶標記技術（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（B014）、山羊抗兔IgG（FITC，B029）購于安徽欣樂生物技術有限公司；兔抗大鼠Cyp-D抗體（bs-9878R）購于北京博奧森生物技術有限公司，兔抗大鼠GSK3β抗體（BS1402）、兔抗大鼠p-GSK3β抗體（BS4084）購于美國Bioworld公司；MPTP檢測試劑盒（C2009S）購于上海碧云天生物技術有限公司。miR-124-3p激動劑（ISO9001）、miR-124-3p抑制劑（ISO13485），購于廣州市銳博生物科技有限公司。

天協(xié)牌一次性無菌針灸針（0.2 mm×25.0 mm，蘇州天協(xié)針灸器械有限公司），華佗牌電子針療儀（SDZ-Ⅱ，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），電子天平（FA2004N，上海菁海儀器有限公司），熒光顯微鏡（BX51，日本Olympus公司），徠卡切片機（RM2016，德國Leica公司），熒光定量PCR儀（PIKOREAL 96，美國Thermo Scientific），流式細胞儀（CytoFLEX，上海貝克曼庫爾特國際貿(mào)易有限公司 ），動物麻醉機（R500/R600系列，深圳瑞沃德生命科技有限公司），Image J圖像分析軟件（美國NIH公司），全自動數(shù)字切片掃描系統(tǒng)（Pannoramic MIDI，匈牙利3DHISTECH公司），形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)（JD801，江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司）。

1.3 干預方法 造模前干預7 d：（1）假手術組與模型組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，同電針組做相同的抓取、捆綁，但不做任何干預。（2）電針組大鼠在干預期內(nèi)吸入異氟烷，麻醉狀態(tài)下抓取、捆綁，俯臥位固定于鼠板上。選取通督調(diào)神穴組：百會、風府、大椎穴進行干預，取

0.2 mm×25.0 mm毫針，在針柄處連接電針治療儀，以針體輕輕抖動為度，選用疏密波，頻率為2 Hz/5 Hz，電流強度 1～2 mA，1次/d，20 min/次，連續(xù)干預7 d。穴區(qū)定位及針刺方法：百會，頂骨的正中央，向后斜刺3 mm；風府，枕骨頂脊后枕寰關節(jié)背凹陷處，平刺進針3 mm；大椎，第7頸椎與第1胸椎間，背部正中，向后斜刺3 mm。穴位定位參照《實驗針灸學》［17］關于“常用實驗動物針灸穴位”的取穴標準。（3）抑制劑組大鼠在干預期內(nèi)前期常規(guī)飼養(yǎng)，同電針組做相同的抓取、捆綁。大鼠于造模前24 h經(jīng)側腦室注射miR-124-3p抑制劑10 μL（0.5 nmol/μL）。側腦室注射：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液（30 mg/kg）麻醉后俯臥位固定于腦立體定位儀上，備皮后用2%復方聚維酮碘溶液消毒，沿頭部正中作一長0.5～1.0 mm的縱向切口，暴露顱骨后用棉簽蘸取3%過氧化氫溶液涂擦顱骨表面，記號筆標記前囟點。以前囪為基點，調(diào)整進針點坐標位置（ 前囟后：0.8 mm，距矢狀縫橫向距離：1.5 mm，進針深度：4.5 mm）。用牙科鉆 （孔徑約2 mm） 鉆開顱骨至硬腦膜，使用微量注射器進入硬膜下4.5 mm的側腦室位置后連接腦立體定位儀，以0.5 μL/min的速度向腦室內(nèi)注射miR-124-3p抑制劑，注射完畢后留針5～10 min，以防藥液外滲，結束后緩慢退出注射器，干棉球輕微按壓針孔，消毒后逐層縫合頭皮。（4）電針+激動劑組大鼠在干預期內(nèi)與電針組同期進行相同的電針干預，并且于造模前24 h經(jīng)側腦室注射miR-124-3p激動劑10 μL（0.5 nmol/μL）。

1.4 模型制備 末次電針及側腦室注射24 h后，參照文獻［18］采用改良線栓法制備CIRI大鼠模型。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液（30 mg/kg）麻醉后仰臥位固定于鼠板上、備皮，2%復方聚維酮碘溶液消毒，于頸前正中偏右0.2～0.3 cm皮膚行一長1.5～2.0 cm縱向切口，鑷子鈍性分離淺筋膜，暴露胸鎖乳突肌，在頸前肌群與胸鎖乳突肌之間向深部鈍性分離，暴露頸動脈鞘，玻璃分針游離頸總動脈（CCA）和迷走神經(jīng)，向上分離直至CCA分叉處。鈍性分離頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），使之清晰可見。結扎距離ICA、ECA分叉處下7～10 mm的CCA近心端，同時在CCA距離ICA、ECA分叉處下3 mm的CCA遠心端打一活結備用。結扎ECA近心端，動脈微血管夾夾閉ICA。在活結下2 mm處用顯微剪在CCA上剪一“Ｖ”型切口，插入直徑0.3 mm的硅膠線栓，沿ICA方向插入后去除血管夾，從ICA、ECA分叉處繼續(xù)插入18～20 mm，至線栓遇輕微阻力時停止并結扎CCA上的活結。2%復方聚維酮碘溶液消毒后逐層縫合切口，將線栓尾端留置在體外，用0.9%氯化鈉溶液浸濕的棉球覆蓋傷口，腹腔注射青霉素鈉溶液0.2 mL/d（4×104 U/d）預防感染。

模型組、電針組、電針+激動劑組及抑制劑組均按上述方法造模；假手術組大鼠只分離右側頸部CCA、ICA、ECA，不進行結扎和插線；模型大鼠腦缺血2 h后，回抽線栓令頭端退至CCA結扎處，恢復大腦中動脈灌注。

再灌注2 h后依據(jù)Zea-Longa 5分法對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分［19］，0分：無神經(jīng)功能損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側前肢，提尾懸吊時左前肢屈曲；2分：爬行時向對側轉圈；3分：爬行時向對側傾倒；4分：意識水平下降或喪失，不能自主行走。1～3分視為造模成功，納入實驗。各組大鼠均造模成功。

1.5 取材及指標檢測

1.5.1 行為學檢測 采用改良神經(jīng)功能損傷評分量表（mNSS）［20］評定各組大鼠CIRI模型制備完成24 h后神經(jīng)行為學情況。mNSS 評分總分為0～18分。分數(shù)越高，代表神經(jīng)功能損傷越嚴重。

1.5.2 組織取材 神經(jīng)功能損傷評分結束后大鼠腹腔注2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉。每組隨機選取15只大鼠，迅速斷頭，取出全腦組織。每組取5只大鼠全腦用冰0.9%氯化鈉溶液沖洗，冰箱速凍，用于TTC染色。每組取4只大鼠迅速打開胸腔暴露心臟，用0.9%氯化鈉溶液進行灌注后取腦，分離右側皮質組織，將其修整成2份大小為1 mm×1 mm×1 mm的組織樣本，一份置于電鏡固定液內(nèi)室溫固定24 h，于4 ℃冰箱保存以行透射電鏡觀察，另一份用于制備單細胞懸液，以行流式細胞檢測。每組取6只大鼠斷頭后取右側腦皮質組織迅速裝入凍存管置于液氮罐中低溫保存，用于實時熒光定量PCR、Western blotting檢測。每組剩余的5只大鼠迅速打開胸腔，暴露心臟后依次予以0.9%氯化鈉溶液及4%多聚甲醛灌注，結束后于冰上斷頭分離出全腦組織，置于4%多聚甲醛中固定24～48 h，用于TUNEL染色和免疫熒光染色。

1.5.3 2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色（TTC染色）法觀察各組大鼠腦組織梗死情況 取-20 ℃冰箱冷凍20 min的腦組織，去除小腦及嗅球部分后，切成5個厚度約2 mm 的冠狀切片，將腦片置于2% TTC溶液中，37 ℃恒溫避光染色，30 min后取出腦片，置于4%多聚甲醛中固定24 h后拍照。最后使用Image J 軟件進行分析并計算大鼠的相對腦梗死體積，用百分比（%）表示。相對腦梗死體積=腦切片白色缺血區(qū)域體積/腦切片總體積×100%。

1.5.4 透射電鏡法觀察各組大鼠腦皮質神經(jīng)元細胞超微結構 取電鏡固定液固定后的腦皮質組織，以1%的鋨酸×0.1 mmol/L磷酸緩沖液（PBS）于室溫固定2 h后漂洗，15 min×3次。梯度乙醇脫水，丙酮滲透、包埋，制成超薄切片（厚度70 nm），鈾鉛雙染色各15 min，室溫干燥過夜，將切片置于透射電鏡下×10 000、×25 000觀察神經(jīng)細胞超微結構。

1.5.5 實時熒光定量PCR法檢測大鼠腦皮質miR-124-3p及GSK-3β、Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達 取腦皮質組織100 mg，按試劑盒說明，經(jīng)過總RNA抽提、反轉錄成cDNA 樣本后進行熒光定量PCR擴增。反應結束后根據(jù)測得樣品CT值，以U6、β-actin為內(nèi)參，按照2-ΔΔCT法計算目的基因的miRNA及mRNA的相對表達量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，引物序列見表１。

1.5.6 Western blotting法檢測大鼠腦皮質GSK-3β、p-GSK-3β、Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3蛋白表達 取腦皮質組織100 mg，裂解、離心取上清液、測定蛋白濃度、加熱使蛋白充分變性后，依次經(jīng)過電泳、轉膜、封閉，漂洗，加入一抗，過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）漂洗3遍，加入二抗，室溫孵育2 h，PBST漂洗10 min，

重復3遍。使用L增強型化學發(fā)光試劑（ECL）試劑盒檢測蛋白，Image J 處理分析灰度值，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，計算目標蛋白相對表達量，目的蛋白相對表達量=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.5.7 流式細胞檢測MPTP開放程度 取出腦皮質組織加入1 mL混合消化液，剪碎組織后37 ℃恒溫箱中振蕩消化，過濾后收集單細胞懸液，加入適當體積的檢測緩沖液、Calcein AM染色液、熒光淬滅工作液或Ionomycin對照重懸，37 ℃避光孵育30 min后，1 000×g室溫離心5 min收集細胞，加入400 μL檢測緩沖液重懸細胞后進行流式細胞儀檢測和分析。Calcein的最大激發(fā)光波長為494 nm，最大發(fā)射光波長為517 nm。MPTP 陽性細胞率越高，代表MPTP開放程度越大。

1.5.8 TUNEL染色法檢測大鼠腦皮質神經(jīng)細胞凋亡情況 將固定后的腦組織石蠟包埋、切片（厚度5 μm）。切片依次經(jīng)過烤片、浸洗、脫蠟、洗片，滴加蛋白酶K工作液37 ℃孵育25 min后PBS沖洗3次，滴加TUNEL檢測液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育60 min，PBS沖洗3次，滴加DAPI染液，避光反應10 min。PBS清洗后甩干，抗熒光淬滅封片劑封片。數(shù)字切片掃描儀（Pannoramic MIDI）掃描熒光切片，CaseViewer 2.2軟件×400觀察并記錄圖像。每只大鼠隨機選取2張切片，每張切片隨機截取3個視野，用Image J軟件計算凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI），公式為AI（%）=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.5.9 免疫熒光法檢測大鼠腦皮質GSK-3β、p-GSK-3β、Cyp-D的表達 將標本從組織固定液中取出，依次進行脫水、浸蠟、包埋、切片（厚度5 μm）后浸洗及脫蠟，抗原高壓修復，山羊血清封閉，室溫孵育30 min后滴加一抗，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗，甩干，滴加FITC標記的熒光二抗，37 ℃避光孵育30 min，PBS沖洗后封片，Pannoramic MIDI掃描熒光切片，CaseViewer 2.2軟件×400觀察并記錄圖像。每只大鼠隨機選取2張切片，每張切片隨機取3個視野，捷達JD801醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，計算平均光密度值。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，采用GraphPad Prism 8.0整理生成統(tǒng)計圖。符合正態(tài)分布的計量資料數(shù)據(jù)以（x-±s）表示，Shapiro-Wilk法檢驗各指標數(shù)據(jù)的正態(tài)性，Leven檢驗數(shù)據(jù)方差齊性。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊時，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，方差不齊時多重比較采用蓋姆斯-豪厄爾檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用獨立樣本克魯斯卡爾-沃利斯檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠mNSS評分及腦組織梗死情況比較 各組大鼠mNSS評分和相對腦梗死體積比較，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01）。假手術組大鼠腦組織無梗死，神經(jīng)功能無缺損；與假手術組比較，模型組大鼠mNSS評分升高、相對腦梗死體積增大，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；與模型組比較，電針組、抑制劑組大鼠mNSS評分降低、相對腦梗死體積減小，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；與電針組比較，電針+激動劑組大鼠mNSS評分升高、相對腦梗死體積增大，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見圖1、表2。

2.2 各組大鼠腦皮質神經(jīng)細胞超微結構 假手術組大鼠腦皮質神經(jīng)細胞輪廓清晰，細胞核膜完整無皺縮，線粒體形態(tài)多呈橢圓形或梭形，大小適中，結構完整，膜邊界清晰，嵴縱行排列密集有規(guī)律，橫紋排列清晰有序，未出現(xiàn)腫脹及空泡；模型組和電針+激動劑組大鼠的神經(jīng)細胞體積縮小，核膜皺縮，線粒體腫脹，線粒體膜邊界不清，嵴斷裂稀疏，橫紋大部分消失，體內(nèi)大部分呈空泡狀態(tài)；電針組和抑制劑組大鼠細胞輪廓尚清晰，細胞核膜輕度皺縮，線粒體呈橢圓或梭形，略腫脹，結構完整，膜尚清晰，嵴和橫紋分布基本整齊有序，見圖2。

2.3 各組大鼠腦皮質神經(jīng)細胞凋亡情況 各組大鼠腦皮質神經(jīng)細胞AI比較，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。與假手術組比較，模型組大鼠腦皮質細胞AI升高，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01）；與模型組比較，電針組、抑制劑組、電針+激動劑組大鼠腦皮質細胞AI降低，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01）；與電針組比較，抑制劑組大鼠腦皮質細胞AI降低，電針+激動劑組細胞AI增高，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見圖3、表3。

2.4 各組大鼠腦皮質GSK-3β、p-GSK-3β、Cyp-D蛋白表達情況 各組GSK-3β蛋白陽性表達結果比較，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。各組p-GSK-3β蛋白、Cyp-D陽性表達結果比較，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。與假手術組比較，模型組p-GSK-3β蛋白陽性表達減弱，Cyp-D蛋白陽性表達增強，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01）；與模型組比較，電針組、抑制劑組、電針+激動劑組p-GSK-3β蛋白陽性表達增強，Cyp-D蛋白陽性表達減弱，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01）；與電針組比較，抑制劑組p-GSK-3β蛋白陽性表達增強，Cyp-D蛋白陽性表達減弱，電針+激動劑組p-GSK-3β蛋白陽性表達減弱，Cyp-D蛋白陽性表達增強，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見表3、圖4。

2.5 各組大鼠腦皮質miR-124-3p及GSK-3β、Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達比較 各組大鼠腦皮質miR-124-3p及GSK-3β、Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。與假手術組比較，模型組大鼠腦皮質miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達增高，GSK-3β mRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01）；與模型組比較，電針組、抑制劑組、電針+激動劑組miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達降低，電針組、抑制劑組、電針+激動劑組GSK-3β mRNA表達增高，差異有統(tǒng)計學意義

（Plt;0.05）；與電針組比較，抑制劑組miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達降低，GSK-3β mRNA表達增高，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），電針+激動劑組miR-124-3p、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表達增高，GSK-3β mRNA 表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見表4。

2.6 各組大鼠腦皮質p-GSK-3β/GSK-3β、Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3蛋白表達比較 各組大鼠腦皮質p-GSK-3β/GSK-3β、Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3蛋白表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。與假手術組比較，模型組大鼠腦皮質p-GSK-3β/GSK-3β值降低，Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3蛋白相對表達量增高（Plt;0.01）；與模型組比較，電針組、抑制劑組p-GSK-3β/ GSK-3β值增高，Cyp-D、Cyt-C蛋白相對表達量降低（Plt;0.01），Caspase-3蛋白相對表達量降低（Plt;0.01、Plt;0.05）；電針+激動劑組Cyp-D、Cyt-C蛋白相對表達量降低（Plt;0.01），p-GSK-3β/ GSK-3β值增高、Caspase-3蛋白相對表達量降低，差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。與電針組比較，抑制劑組Cyp-D、Cyt-C蛋白相對表達量降低（Plt;0.01）；電針+激動劑組Cyp-D、Cyt-C蛋白相對表達量增高（Plt;0.01），p-GSK-3β/ GSK-3β值降低，Caspase-3蛋白相對表達量增高，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見表5、圖5。

2.7 各組大鼠腦皮質神經(jīng)元細胞MPTP的開放程度比較 與假手術組比較，模型組MPTP開放程度明顯增加（Plt;0.01）；與模型組比較，電針組、抑制劑組、電針+激動劑組MPTP開放程度降低（Plt;0.01）；與電針組比較，抑制劑組MPTP開放程度降低（Plt;0.05）、電針+激動劑組MPTP開放程度增加（Plt;0.05），見表6、圖6。

3 討論

本研究采用“通督調(diào)神”電針預處理CIRI模型大鼠，選穴百會、風府、大椎。百會乃“三陽五會”，聚一身之陽氣匯于巔頂；大椎為“諸陽之會”，具有保健強身之效；風府可“醒腦調(diào)神”，三穴均為督脈之要穴，共用有通督調(diào)神、燮理陰陽之功［21-22］。研究表明，“通督調(diào)神”針刺能夠促進神經(jīng)髓鞘再生、調(diào)節(jié)細胞自噬，改善CIRI后大鼠神經(jīng)功能，但其更為具體的作用機制尚未明晰［23-24］。因此，探討“通督調(diào)神”電針預處理減輕CIRI作用機制，對于本病的防治意義重大。本研究中，CIRI模型大鼠mNSS評分增高、相對腦梗死體積增大、TUNEL陽性細胞率增高；電針預處理后，大鼠mNSS評分及相對腦梗死體積減少、TUNEL陽性細胞率明顯降低，表明“通督調(diào)神”電針預處理可抑制CIRI的發(fā)生和發(fā)展，減輕神經(jīng)功能損傷，與相關研究［25-26］結果一致。

細胞凋亡是CIRI的一種細胞死亡方式［27］，而線粒體功能障礙介導細胞凋亡的內(nèi)源性途徑，并發(fā)揮中心調(diào)控作用［28］。MPTP位于線粒體內(nèi)外膜之間的接觸點上，對調(diào)控線粒體通透性起關鍵作用［29］，當MPTP過度開放時，線粒體與細胞質之間的離子交換異常，導致線粒體結構和功能異常［30］。線粒體內(nèi)膜上Cyt-C釋放到細胞質中，并進一步活化Caspase-3等凋亡相關因子，誘發(fā)凋亡發(fā)生、加重神經(jīng)損傷。本研究透射電鏡顯示CIRI大鼠線粒體形態(tài)破壞嚴重，流式細胞術結果顯示MPTP開放程度升高；電針組線粒體結構尚完整，MPTP開放程度降低，提示電針預處理對CIRI后的神經(jīng)保護作用可能與抑制MPTP開放、進而保護線粒體功能有關。

miR-124是參與缺血再灌注損傷發(fā)生機制的重要調(diào)控因子［31］。李杰等［32］研究發(fā)現(xiàn)，采用沖擊波干預腦梗死大鼠可降低海馬組織miR-124表達，促進神經(jīng)干細胞增殖，改善受損神經(jīng)功能。研究發(fā)現(xiàn)，miR-124表達下調(diào)可增強GSK-3β的表達，減弱Wnt/β-catenin途徑的活性，發(fā)揮保護性作用［33］。GSK-3β是一種在體內(nèi)廣泛表達的信號轉導激酶，參與細胞的多種生理過程，如代謝、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等［34］。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β信號傳導通路與調(diào)控MPTP開放有關［35］，其磷酸化產(chǎn)物p-GSK-3β在CIRI中的神經(jīng)保護作用已被證實，即通過抑制MPTP的開放來維持線粒體再灌注損傷后的跨膜電位［36］。Cyp-D是構成MPTP最關鍵的調(diào)節(jié)蛋白，也是參與神經(jīng)元缺血性死亡的重要物質［37］。Cyt-C、Caspase-3是重要的促凋亡蛋白［38］，Caspase-3被認為是細胞凋亡的標志［39］。

本研究中，模型組大鼠腦皮質miRNA-124-3p表達升高、GSK-3β mRNA、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達比值降低、Cyp-D蛋白及微小RNA表達增高，電針和抑制劑干預后miR-124-3p表達降低、GSK-3β mRNA、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達比值增高、Cyp-D蛋白及mRNA表達降低，說明miR-124被抑制后可靶向激活GSK-3β，進而通過上調(diào)p-GSK-3β的表達，抑制Cyp-D介導的MPTP開放，起到保護線粒體的作用。與模型組比較，電針組和抑制劑組Cyt-C、Caspase-3蛋白及mRNA表達降低，說明細胞凋亡得到抑制、細胞功能相對穩(wěn)定。該結果進一步驗證電針預處理可能通過負向調(diào)控大鼠神經(jīng)細胞miRNA-124-3p，進而抑制MPTP開放發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

為進一步驗證“通督調(diào)神”電針預處理對CIRI大鼠神經(jīng)細胞線粒體MPTP的影響是否與miR-124-3p/GSK-3β/Cyp-D信號通路相關，本研究設置了miR-124-3p抑制劑組和電針+激動劑組。結果顯示，抑制劑組miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3表達降低，GSK-3β表達增高，總體結果與電針組趨同，而電針與miR-124-3p激動劑聯(lián)用后，其抑制miR-124-3p、進而激活GSK-3β抑制MPTP開放的作用被逆轉。進一步說明“通督調(diào)神”電針預處理對CIRI大鼠神經(jīng)功能損傷發(fā)生發(fā)展的抑制作用，可能是通過調(diào)控miR-124-3p/GSK-3β/Cyp-D信號通路，抑制神經(jīng)細胞線粒體MPTP開放。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，“通督調(diào)神”針刺法對中風高危因素的干預可有效控制“中風先兆”的進展［40-41］，本研究對今后開展針灸預處理防治缺血性腦卒中的臨床應用具有積極的促進作用。然而，電針預處理預防CIRI的作用機制復雜，仍有待進一步深入研究。本研究中大鼠為吸入異氟烷麻醉狀態(tài)下電針，麻醉藥對大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的影響是否影響到本實驗尚未得知，這使得本實驗存在一定的局限性和不足，后續(xù)研究將通過查閱文獻、實體實驗等方式優(yōu)化電針方式，減少干預因素。

作者貢獻：張國慶、童婷婷、李奎武提出研究構思與實驗設計，負責實驗實施，觀察指標的測量與數(shù)據(jù)收集；張國慶負責撰寫論文初稿；李奎武負責統(tǒng)計學分析；吳曉晴、汪俊麗負責數(shù)據(jù)收集與統(tǒng)計結果審核；童婷婷、張利達、張君宇負責整體實驗評估，觀察指標的數(shù)據(jù)收集；韓為、王穎負責文章的質量控制及審校，對文章整體進行監(jiān)督管理；所有作者確認了論文終稿。

本文無利益沖突。

參考文獻

HE Z，NING N Y，ZHOU Q X，et al. Mitochondria as a therapeutic target for ischemic stroke［J］. Free Radic Biol Med，2020，146：45-58. DOI：10.1016/j.freeradbiomed.2019.11.005.

LAPCHAK P A，ZHANG J H. The high cost of stroke and stroke cytoprotection research［J］. Transl Stroke Res，2017，8（4）：307-317. DOI：10.1007/s12975-016-0518-y.

POWERS W J，RABINSTEIN A A，ACKERSON T，et al. Guidelines for the early management of patients with acute ischemic stroke：2019 update to the 2018 guidelines for the early management of acute ischemic stroke：a guideline for healthcare professionals from the American heart association/American stroke association［J］. Stroke，2019，50（12）：e344-418. DOI：10.1161/STR.0000000000000211.

GUO P P，JIN Z，WU H S，et al. Effects of irisin on the dysfunction of blood-brain barrier in rats after focal cerebral ischemia/reperfusion［J］. Brain Behav，2019，9（10）：e01425. DOI：10.1002/brb3.1425.

TIAN W Q，ZHU M M，ZHOU Y D，et al. Electroacupuncture pretreatment alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating mitophagy via mTOR-ULK1/FUNDC1 axis in rats［J］. J Stroke Cerebrovasc Dis，2022，31（1）：106202. DOI：10.1016/j.jstrokecerebrovasdis.2021.106202.

LONG M，WANG Z G，ZHENG D，et al. Electroacupuncture pretreatment elicits neuroprotection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats associated with transient receptor potential vanilloid 1-mediated anti-oxidant stress and anti-inflammation［J］. Inflammation，2019，42（5）：1777-1787. DOI：10.1007/s10753-019-01040-y.

HE Z，NING N Y，ZHOU Q X，et al. Mitochondria as a therapeutic target for ischemic stroke［J］. Free Radic Biol Med，2020，146：45-58. DOI：10.1016/j.freeradbiomed.2019.11.005.

LI S Q，ZHOU Y，GU X C，et al. NLRX1/FUNDC1/NIPSNAP1-2 axis regulates mitophagy and alleviates intestinal ischaemia/reperfusion injury［J］. Cell Prolif，2021，54（3）：e12986. DOI：10.1111/cpr.12986.

ANZELL A R，MAIZY R，PRZYKLENK K，et al. Mitochondrial quality control and disease：insights into ischemia-reperfusion injury［J］. Mol Neurobiol，2018，55（3）：2547-2564. DOI：10.1007/s12035-017-0503-9.

HUANG J L，MANAENKO A，YE Z H，et al. Hypoxia therapy—a new hope for the treatment of mitochondrial dysfunctions［J］. Med Gas Res，2016，6（3）：174-176. DOI：10.4103/2045-9912.191365.

REN Z L，WANG C D，WANG T，et al. Ganoderma lucidum extract ameliorates MPTP-induced Parkinsonism and protects dopaminergic neurons from oxidative stress via regulating mitochondrial function，autophagy，and apoptosis［J］. Acta Pharmacol Sin，2019，40（4）：441-450. DOI：10.1038/s41401-018-0077-8.

YANG H，LI R Z，ZHANG L，et al. p53-cyclophilin D mediates renal tubular cell apoptosis in ischemia-reperfusion-induced acute kidney injury［J］. Am J Physiol Renal Physiol，2019，317（5）：F1311-1317. DOI：10.1152/ajprenal.00072.2019.

LIU X R，LI F，ZHAO S F，et al. MicroRNA-124-mediated regulation of inhibitory member of apoptosis-stimulating protein of p53 family in experimental stroke［J］. Stroke，2013，44（7）：1973-1980. DOI：10.1161/STROKEAHA.111.000613.

MIAO W，YAN Y，BAO T H，et al. Ischemic postconditioning exerts neuroprotective effect through negatively regulating PI3K/Akt2 signaling pathway by microRNA-124［J］. Biomedecine Pharmacother，2020，126：109786. DOI：10.1016/j.biopha.2019.109786.

TANG S L，HUANG Q H，WU L G，et al. MiR-124 regulates osteoblast differentiation through GSK-3β in ankylosing spondylitis［J］. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2018，22（20）：6616-6624. DOI：10.26355/eurrev_201810_16136.

YANG K，CHEN Z X，GAO J J，et al. The key roles of GSK-3β in regulating mitochondrial activity［J］. Cell Physiol Biochem，2017，44（4）：1445-1459. DOI：10.1159/000485580.

余曙光，徐斌. 實驗針灸學［M］. 3版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2021.

包新杰，趙浩，魏俊吉，等. 線栓法建立大鼠局灶性腦缺血模型的改進［J］. 中國腦血管病雜志，2011，8（5）：248-252. DOI：10.3969/j.issn.1672-5921.2011.05.006.

LONGA E Z，WEINSTEIN P R，CARLSON S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke，1989，20（1）：84-91. DOI：10.1161/01.str.20.1.84.

XIN J H，MA X X，CHEN W Y，et al. Regulation of blood-brain barrier permeability by Salvinorin A via alleviating endoplasmic reticulum stress in brain endothelial cell after ischemia stroke［J］. Neurochem Int，2021，149：105093. DOI：10.1016/j.neuint.2021.105093.

鄭仕平，韓為，儲浩然，等. 通督調(diào)神針灸預處理對腦缺血再灌注大鼠相關微小RNA調(diào)控機制的研究［J］. 針刺研究，2015，40（2）：99-103. DOI：10.13702/j.1000-0607.2015.02.003.

彭靜，陳曦. “補腎通督，醒腦益智”法電針治療血管性癡呆80例［J］. 中國針灸，2022，42（6）：623-624. DOI：10.13703/j.0255-2930.20210413-0005.

劉燕，王陳妮，蘭崴，等. 通督調(diào)神針刺對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能及VEGF、NGF、MBP表達的影響［J］. 中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2022，28（2）：218-223. DOI：10.19945/j.cnki.issn.1006-3250.2022.02.020.

谷詩濃，劉毓佳，王振杰，等. 基于細胞自噬探討通督調(diào)神針法對缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能及Beclin-1蛋白表達的影響［J］. 針灸臨床雜志，2020，36（10）：64-68.

黃亞光，楊松柏，杜利鵬，等. 電針預處理通過調(diào)控皮層區(qū)自噬改善大鼠腦缺血再灌注損傷［J］. 針刺研究，2019，44（12）：867-872. DOI：10.13702/j.1000-0607.190307.

ZHANG G F，YANG P，YIN Z，et al. Electroacupuncture preconditioning protects against focal cerebral ischemia/reperfusion injury via suppression of dynamin-related protein 1［J］. Neural Regen Res，2018，13（1）：86-93. DOI：10.4103/1673-5374.224373.

JIN Z，GUO P P，LI X Y，et al. Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/reperfusion injury via Notch signaling pathway［J］. Biomedecine Pharmacother，2019，120：109452. DOI：10.1016/j.biopha.2019.109452.

BOCK F J，TAIT S W G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death［J］. Nat Rev Mol Cell Biol，2020，21（2）：85-100. DOI：10.1038/s41580-019-0173-8.

BONORA M，GIORGI C，PINTON P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition［J］. Nat Rev Mol Cell Biol，2022，23（4）：266-285. DOI：10.1038/s41580-021-00433-y.

MORCIANO G，NAUMOVA N，KOPROWSKI P，et al. The mitochondrial permeability transition pore：an evolving concept critical for cell life and death［J］. Biol Rev Camb Philos Soc，2021，96（6）：2489-2521. DOI：10.1111/brv.12764.

LIU K，YAN L H，JIANG X J，et al. Acquired inhibition of microRNA-124 protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury partially through a mitophagy-dependent pathway［J］. J Thorac Cardiovasc Surg，2017，154（5）：1498-1508. DOI：10.1016/j.jtcvs.2017.05.046.

李杰，馬躍文，康楠，等. 體外放散式?jīng)_擊波促進腦梗死大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細胞增殖并抑制miR-124的表達［J］. 中國組織工程研究，2021，25（31）：4981-4987.

TANG S L，HUANG Q H，WU L G，et al. MiR-124 regulates osteoblast differentiation through GSK-3β in ankylosing spondylitis［J］. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2018，22（20）：6616-6624. DOI：10.26355/eurrev_201810_16136.

WONG T C，F(xiàn)UNG J Y，PANG H H，et al. Analysis of survival benefits of living versus deceased donor liver transplant in high model for end-stage liver disease and hepatorenal syndrome［J］. Hepatology，2021，73（6）：2441-2454. DOI：10.1002/hep.31584.

JUHASZOVA M，ZOROV D B，KIM S H，et al. Glycogen synthase kinase-3beta mediates convergence of protection signaling to inhibit the mitochondrial permeability transition pore［J］. J Clin Invest，2004，113（11）：1535-1549. DOI：10.1172/JCI19906.

ZHOU L J，MO Y B，BU X，et al. Erinacine facilitates the opening of the mitochondrial permeability transition pore through the inhibition of the PI3K/Akt/GSK-3β signaling pathway in human hepatocellular carcinoma［J］. Cell Physiol Biochem，2018，

50（3）：851-867. DOI：10.1159/000494472.

PéREZ M J，QUINTANILLA R A. Development or disease：duality of the mitochondrial permeability transition pore［J］. Dev Biol，2017，426（1）：1-7. DOI：10.1016/j.ydbio.2017.04.018.

WANG H J，ZHU J，JIANG L P，et al. Mechanism of Heshouwuyin inhibiting the Cyt c/Apaf-1/Caspase-9/Caspase-3 pathway in spermatogenic cell apoptosis［J］. BMC Complement Med Ther，2020，20（1）：180. DOI：10.1186/s12906-020-02904-9.

JIN Z，GUO P P，LI X Y，et al. Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/reperfusion injury via Notch signaling pathway［J］. Biomedecine Pharmacother，2019，120：109452. DOI：10.1016/j.biopha.2019.109452.

張利達，韓為，高志波，等. “通督調(diào)神”法針刺聯(lián)合頸動脈內(nèi)膜剝脫術治療頸動脈狹窄：隨機對照研究［J］. 中國針灸，2022，42（2）：121-125. DOI：10.13703/j.0255-2930.20210202-k0007.

羅佛賜，韓為，張利達，等. 通督調(diào)神針刺聯(lián)合西藥對短暫性腦缺血發(fā)作合并高尿酸血癥患者頸動脈斑塊的影響［J］. 上海針灸雜志，2021，40（7）：789-794. DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2021.07.0789.

（收稿日期：2022-12-20；修回日期：2023-03-10）

（本文編輯：趙躍翠）