Klotho在鹽敏感性高血壓腎損傷中的作用及分子機制研究

【摘要】 背景 Klotho與腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，鹽敏感性高血壓（SSH）常伴隨腎臟疾病的發(fā)生。目前klotho在SSH腎損傷中的作用及分子機制研究鮮見報道。目的 探討klotho在SSH腎損傷中的作用及分子機制。方法 于2021年6月—2022年1月選取大鼠腎小球系膜細胞株HBZY1為實驗細胞，將實驗細胞分為對照組與造模組，采用NaCl 137 mmol/L和血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）10-6 mmol/L共同誘導的HBZY1細胞損傷模型模擬SSH腎損傷，收集細胞。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）與蛋白質(zhì)印記法（Western Blot）檢測klotho mRNA和蛋白的表達。構建klotho干擾載體和過表達載體與血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）過表達載體，klotho干擾實驗分為5組，包括對照組、空載組、klotho-siRNA1組、klotho-siRNA2組、klotho-siRNA3組；klotho過表達實驗分為3組，包括對照組、空載組、klotho過表達組；AT1R過表達實驗分為3組，包括對照組、空載組、AT1R過表達組。將構建的載體轉(zhuǎn)染至細胞中并驗證轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后將實驗分兩部分進行，第一部分實驗驗證klotho的腎臟保護作用，實驗分為4組，包括對照組、造模組、klotho過表達組與klotho干擾組，第二部分實驗探索klotho的腎臟保護作用是否與AT1R相關，實驗分為3組，包括造模組、klotho過表達組、klotho+AT1R過表達組。轉(zhuǎn)染成功后進行下列檢測，細胞計數(shù)試劑8（CCK-8）法檢測細胞活力，流式細胞術檢測細胞活性氧（ROS）水平，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測細胞上清液中丙二醛（MDA）與超氧化物歧化酶（SOD）水平，免疫共沉淀（Co-IP）檢測klotho與AT1R相互作用的影響。結果 與對照組相比，造模組中klotho的mRNA水平與蛋白表達均下降（t=7.102、7.506，P=0.002、0.002）。與對照組相比，klotho-siRNA2干擾效果顯著（Plt;0.001）；klotho過表達組的klotho蛋白表達升高（Plt;0.001）；AT1R過表達組的AT1R蛋白表達升高（Plt;0.001）。Klotho對細胞活力及氧化應激損傷的影響：與對照組相比，造模組細胞活力下降（Plt;0.001），細胞內(nèi)ROS、MDA水平升高（Plt;0.001、P=0.004），細胞內(nèi)SOD水平下降（P=0.041）；與造模組相比，klotho過表達組細胞活力升高（Plt;0.001），細胞內(nèi)ROS、MDA水平下降（Plt;0.001、P=0.003），細胞內(nèi)SOD水平上升（P=0.018）；與造模組相比，klotho干擾組細胞活力下降（Plt;0.001），細胞內(nèi)ROS、MDA水平升高（Plt;0.001、P=0.002），細胞內(nèi)SOD水平下降（P=0.001）。Klotho通過AT1R對細胞活力及氧化應激損傷的影響：與造模組相比，klotho過表達組細胞活力升高（Plt;0.001），細胞內(nèi)ROS、MDA水平下降（Plt;0.001、P=0.024），細胞內(nèi)SOD水平上升（P=0.007）；與klotho過表達組相比，klotho+AT1R過表達組細胞活力下降（Plt;0.001），klotho+AT1R過表達組細胞內(nèi)ROS、MDA水平上升（Plt;0.001、P=0.001），細胞內(nèi)SOD水平下降（P=0.002）。Co-IP確定klotho與AT1R之間存在交互作用。結論 Klotho通過與AT1R相互作用，抑制氧化應激損傷，從而在SSH腎損傷中發(fā)揮保護作用。

【關鍵詞】 高血壓；鹽敏感性高血壓；腎損傷；氧化應激；Klotho；血管緊張素Ⅱ；受體，血管緊張素，1型

【中圖分類號】 R 544.1 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0010

【引用本文】 趙偉，唐榮杰，楊珊珊，等. Klotho在鹽敏感性高血壓腎損傷中的作用及分子機制研究［J］. 中國全科醫(yī)學，2023，26（24）：3042-3049. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0010.［www.chinagp.net］

【Abstract】 Background Klotho is closely related to the occurrence and development of kidney disease. Salt-sensitive hypertension（SSH）is often accompanied by kidney disease. At present，there are few reports on the role and molecules mechanism of klotho in renal injury in SSH. Objective To investigate the role and molecules mechanism of klotho in renal injury in SSH. Methods The rat glomerular mesangial cell line HBZY1 was selected as the experimental cells from June 2021 to January 2022，and the experimental cells were divided into the control group and the model group. The model of HBZY1 cell injury induced by NaCl 137 mmol/L and angiotensin Ⅱ（Ang Ⅱ）10-6 mmol/L was used to simulate the renal injury in SSH，and the cells were collected. The differences in the expression of klotho mRNA and protein were detected by real-time fluorescent quantitative PCR（qRT-PCR）and Western Blot. The interference vector and overexpression vector of klotho and the overexpression vector of angiotensin Ⅱ type 1 receptor（AT1R）were constructed. The klotho interference experiments were divided into five groups，including the control group，empty group，klotho-siRNA1 group，klotho-siRNA2 group and klotho-siRNA3 group；the klotho overexpression experiments were divided into three groups，including the control group，empty group and klotho overexpression group；the AT1R overexpression experiments were divided into three groups，including the control group，empty group and AT1R overexpression group. The constructed vectors were transfected into cells with verified transfection efficiency. After successful transfection，the experiment was divided into two parts. The first part of the experiment was to verify the renal protective effect of klotho，the experiment subjects were divided into four groups，including the control group，model group，klotho overexpression group and klotho interference group. The second part of the experiment was to explore whether the renal protective effect of klotho was related to AT1R，the experiment subjects were divided into three groups，including the model group，klotho overexpression group and klotho+AT1R overexpression group. After successful transfection，the tests including cell viability detected by cell counting kit-8（CCK-8） method，reactive oxygen species（ROS）content detected by flow cytometry，malondialdehyde（MDA）and superoxide dismutase（SOD）content in cell supernatant detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），interaction effect between kltho and AT1R detected by co-immunoprecipitation（Co-IP）. Results Compared with the control group，mRNA level and protein expression of klotho in the model group decreased in model group（t=7.102，7.506；P=0.002，0.002），klotho-siRNA2 interference effect was more significant（Plt;0.001），the expression of klotho protein in the klotho overexpression group increased significantly（Plt;0.001），the expression of AT1R protein in the overexpression group increased significantly（Plt;0.001）. Effects of klotho on cell viability and oxidative stress injury：compared with the control group，cell viability in the model group decreased（Plt;0.001），intracellular ROS and MDA content increased（Plt;0.001，P=0.004），and SOD content decreased（P=0.041）；compared with the model group，cell viability in the klotho overexpression group increased（Plt;0.001），intracellular ROS and MDA content decreased and SOD content increased（Plt;0.001，P=0.003，P=0.018）；compared with the model group，cell viability in the klotho interference group decreased（Plt;0.001），while intracellular ROS and MDA content increased and SOD content decreased（Plt;0.001，P=0.002，P=0.001）. Effects of klotho on cell viability and oxidative stress injury through AT1R：compared with the model group，cell viability increased（Plt;0.001），intracellular ROS and MDA content decreased and SOD content increased（Plt;0.001，P=0.024，P=0.007）in the klotho overexpression group；compared with the klotho overexpression group，cell viability decreased（Plt;0.001），ROS and MDA content increased and SOD content decreased（Plt;0.001，P=0.001，P=0.002）in the klotho+AT1R overexpression group. Co-IP determined that there was an interaction between klotho and AT1R. Conclusion Klotho plays a protective role in renal injury in SSH by inhibiting oxidative stress injury through interaction with AT1R.

【Key words】 Hypertension；Salt-sensitive hypertension；Kidney injury；Oxidative Stress；Klotho；Angiotensin Ⅱ；Receptor，angiotensin，type 1

鹽為高血壓的重要易患因素，血壓的鹽敏感性是指在高鹽攝入時血壓呈現(xiàn)的一種升高反應，與此相關聯(lián)的高血壓類型稱為鹽敏感性高血壓（salt-sensitive hypertension，SSH）［1］。調(diào)查顯示，51%的高血壓人群具有鹽敏感性，并且SSH占我國高血壓人群的50%～60%［2］。此外，相較于原發(fā)性高血壓，SSH患者血管、心臟、腎臟等損傷的發(fā)生率更高，損傷程度更嚴重［3］。其中，SSH腎損傷是長期高鹽負荷與血壓控制不佳所致的共同結局，會遷延發(fā)展至慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD），甚至為終末期腎病。Klotho作為一種抗衰老基因［4］，主要在腎臟中表達，其編碼的分泌型蛋白（klotho蛋白）可以激素樣形式進入血液循環(huán)中并發(fā)揮積極效應。研究發(fā)現(xiàn)，任何形式的腎損傷均會導致klotho表達下降，klotho缺乏出現(xiàn)于CKD的任意階段，同時也會加速CKD的進展［5］。目前，klotho已作為一種評估CKD患者病情及預后的新型標志物，并在CKD治療中發(fā)揮重要作用［6-7］。然而，迄今為止，klotho在SSH腎損傷中的作用及分子機制研究鮮見報道。因此，本實驗采用NaCl 137 mmol/L和血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）10-6 mmol/L共同誘導的HBZY1細胞損傷模型模擬SSH腎損傷，通過觀察klotho對HBZY1細胞活性及相關指標的影響，闡明klotho在SSH腎損傷中的作用及分子機制，對高血壓的管理和心血管疾病的預防意義重大。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞 大鼠腎小球系膜細胞株HBZY1（Procell，貨號：CL-0092）。

1.1.2 實驗試劑 實驗所用主要試劑包括：Opti-MEM?，TRIzol Reagent（康為世紀，貨號：CW0580S）；Ultrapure RNA 超純RNA提取試劑盒（康為世紀，貨號：CW0581M）；HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Vazyme，貨號：R223-01）；2×SYBR Green PCR Master Mix（Lifeint，貨號：A4004M）；Reactive Oxygen Species Assay Kit（凱基生物，貨號：KGT010-1100assays）；超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（酶免，貨號：MM-0386R2）；丙二醛（MDA）試劑盒（酶免，貨號：MM-0385R2）；超敏發(fā)光液（賽默飛，貨號：RJ239676）；PVDF膜（Millipore，貨號：IPVH00010）；內(nèi)參一抗：Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（中杉金橋，貨號：TA-08，1/2 000）；二抗：辣根酶標記山羊抗鼠IgG（H+L）（中杉金橋，貨號：ZB-2305）；目的一抗：Rabbit Anti klotho（Santa Cruz，貨號：sc-515942，1/1 000）；目的一抗：Rabbit Anti AT1R（Proteintech，貨號：25343-1-AP，1/1 000）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（MDL，貨號：MD913053）；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）預制膠套裝試劑盒（MDL，貨號：MD911919）；RNase Free ddH20（湖南艾特捷生物科技有限公司，貨號：RO1012）；β-actin（Affinity，貨號：AF7018）；辣根過氧化物酶（HRP）（北京索萊寶科技有限公司，貨號：P8020）；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（BioVision，貨號：2128-1000）；lipofectamine 3000（賽默飛，貨號：L3000015）；P3000（Qiagen，貨號：9013150）；RIPA裂解緩沖液（北京普利萊基因技術有限公司，貨號：C1055）。

1.1.3 實驗儀器 熒光PCR儀〔伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司，貨號：CFX Connect?實時〕；超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)〔伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司，貨號：Chemi DocTM XRS+〕；全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，貨號：Tanon-5200）；NovoCyte?流式細胞儀〔艾森生物（杭州）有限公司，貨號：NovoCyte2060R〕；全自動酶標儀（六一，貨號：WD-2102B）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞造模及分組 于2021年6月—2022年1月選取大鼠腎小球系膜細胞株HBZY1為實驗細胞。首先，將實驗細胞分為對照組與造模組，其中對照組正常培養(yǎng)，造模組給予NaCl 137 mmol/L和AngⅡ 10-6 mmol/L刺激24 h建立SSH腎損傷細胞模型，收集細胞，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）與蛋白質(zhì)印記法（Western Blot）檢測klotho mRNA和蛋白表達的差異。其次，為了驗證klotho的腎臟保護作用及其相關機制，構建klotho干擾載體和過表達載體與血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）過表達載體。Klotho干擾實驗分為5組，包括對照組、空載組、klotho-siRNA1組、klotho-siRNA2組、klotho-siRNA3組，其中，空載組轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒，klotho-siRNA1組、klotho-siRNA2組、klotho-siRNA3組分別轉(zhuǎn)染含有相應序列的siRNA質(zhì)粒載體；klotho過表達實驗分為3組，包括對照組、空載組、klotho過表達組，其中，空載組轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒載體，klotho過表達組轉(zhuǎn)染含有klotho基因的重組質(zhì)粒；AT1R過表達實驗分為3組，包括對照組、空載組、AT1R過表達組，其中，空載組轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒載體，AT1R過表達組轉(zhuǎn)染含有AT1R基因的重組質(zhì)粒。將構建的載體轉(zhuǎn)染至細胞中并驗證轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后將實驗分兩部分進行，第一部分實驗驗證klotho的腎臟保護作用，實驗分為4組，包括對照組、造模組、klotho過表達組與klotho干擾組，第二部分實驗探索klotho的腎臟保護作用是否與AT1R相關，實驗分為3組，包括造模組、klotho過表達組、klotho+AT1R過表達組。采用細胞計數(shù)試劑8（CCK-8）法檢測細胞活力，流式細胞術檢測細胞活性氧（ROS）水平，ELISA法檢測細胞上清液中MDA與SOD水平，免疫共沉淀（Co-IP）檢測klotho與AT1R相互作用的影響。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 當細胞密度為70％時，更換培養(yǎng)基；取2個滅菌EP管，每管加125 μL Opti-MEM?，其中一管加入5 μL lipofectamine 3000，另一管加入2.5 μg質(zhì)粒、5 μL P3000，混勻后室溫孵育5 min；將上述兩個EP管混勻，室溫孵育15 min，將混合液滴到六孔板中對應的孔內(nèi)，將細胞放回孵箱培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染4 h后在六孔板中加入血清水平為20%的完全培養(yǎng)基1 mL；48 h后進行后續(xù)處理。

1.2.3 CCK-8法 將轉(zhuǎn)染后的細胞消化、重懸，計數(shù)，鋪板，細胞密度為7 000個/孔；待細胞貼壁后，24 h后將待測的96孔板細胞換成相同的培養(yǎng)基，每孔100 μL；每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h；酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度

（OD）值。

1.2.4 流式細胞術 按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)基稀釋活性氧熒光探針（DCFH-DA），最終濃度為10 μmol/L；棄去細胞培養(yǎng)液，向細胞中加入稀釋后的DCFH-DA，37℃培養(yǎng)箱孵育20 min；用無血清的培養(yǎng)液洗滌3次，以充分去除多余的未進入細胞的DCFH-DA；加1 mL PBS洗滌，1 500 r/min離心5 min，棄上清液；加300 μL PBS重懸細胞后上機。

1.2.5 ELISA法 從室溫平衡60 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品

50 μL；樣本孔中加入待測樣本50 μL；空白孔不加。標準品孔和樣本孔中每孔加入HRP標記的檢測抗體

100 μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350 μL），靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.2.6 qRT-PCR TRIzol使樣本充分裂解，提取RNA進行濃度、純度測定，將RNA通過逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進行檢測，以β-actin為內(nèi)參，計算出各組細胞中mRNA的相對表達水平。其中反應體系包括：2×SYBR Green PCR Master Mix（10 μL）、cDNA（1 μL）、上游引物（0.4 μL）、下游引物（0.4 μL）、RNase Free ddH20（8.2 μL）。klotho引物上游5'-ACTTTCTTCTGCCCTATTTCACG-3'、下游5'-CCAGGTAATCGTTGTATTTTATCGG-3'，β-actin引物上游5'-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3'、下游5'-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3'。

1.2.7 Western Blot 細胞加入裂解液，冰上放置

15 min，12 000 r/min高速離心機離心10 min，取上清液，加入緩沖溶液，煮沸5 min，-20℃保存。用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測細胞上清液中蛋白濃度，繪制標準曲線。制作SDS-PAGE膠，上樣，開始跑膠，電泳60 V壓縮蛋白，80 V分離蛋白（120 min），切好含有內(nèi)參或目的條帶的膠。依次放好海綿、濾紙、膠、膜、濾紙、海綿。用預冷的1×轉(zhuǎn)膜液浸沒目的膠帶復合物，用300 mA恒流轉(zhuǎn)膜。用1×TBST配置3%的脫脂牛奶封閉液，封閉1 h。將PVDF膜孵育一抗過夜。洗膜，用1×TBST浸泡10 min后棄掉，重復3次。將PVDF膜孵育二抗2 h。洗膜，用1×TBST浸泡10 min后棄掉，重復3次。用發(fā)光液浸濕PVDF膜后放置于超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)樣品放置區(qū)運行程序顯影成像。

1.2.8 Co-IP RIPA裂解緩沖液裂解細胞后，BCA法測定蛋白濃度，取等量的蛋白首先用IgG和A/G蛋白交聯(lián)瓊脂糖膠粒預處理，然后用klotho抗體與瓊脂糖膠粒孵育，最后取等量蛋白行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后再用相應的抗體進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)分析及實驗作圖均采用GraphPad Prism 8.0軟件進行。各項實驗至少進行3次獨立平行實驗，結果均以（x-±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NaCl和AngⅡ處理對HBZY1細胞中klotho mRNA和蛋白的影響 與對照組相比，造模組中klotho的mRNA水平與蛋白表達均下降，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.102、7.506，P=0.002、0.002），見圖1。

2.2 Klotho干擾和過表達與AT1R過表達驗證結果 對照組、空載組、klotho-siRNA1組、klotho-siRNA2組、klotho-siRNA3組間蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=23.13，Plt;0.001）；與對照組相比，三條klotho干擾序列均具有干擾效果，其中klotho-siRNA2干擾效果最好，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001），見圖2。對照組、空載組、klotho過表達組間蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=414.80，Plt;0.001）；與對照組相比，klotho過表達組的klotho蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001），見圖3。對照組、空載組、AT1R過表達組間蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=53.97，Plt;0.001）；與對照組相比，AT1R過表達組的AT1R蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001），見圖4。

2.3 Klotho對細胞活力的影響 對照組、造模組、klotho過表達組、klotho干擾組間細胞活力比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=537.60，Plt;0.001）；與對照組相比，造模組細胞活力下降，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001）；與造模組相比，klotho過表達組細胞活力升高，klotho干擾組細胞活力下降，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001），見圖5。

2.4 Klotho對細胞氧化應激損傷的影響 對照組、造模組、klotho過表達組、klotho干擾組間ROS、MDA，SOD水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=1 677.00、54.33、47.15，Plt;0.001）。與對照組相比，造模組細胞內(nèi)ROS、MDA水平升高，SOD水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001、P=0.004、P=0.041）。與造模組相比，klotho過表達組ROS、MDA水平下降，SOD水平上升（Plt;0.001、P=0.003、P=0.018）；而klotho干擾組ROS、MDA水平升高，SOD水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001、P=0.002、P=0.001），見圖6。

2.5 Klotho通過AT1R對細胞活力的影響 造模組、klotho過表達組、klotho+AT1R過表達組間細胞活力比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=335.50，Plt;0.001）；與造模組相比，klotho過表達組細胞活力升高，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001）；與klotho過表達組相比，klotho+AT1R過表達組細胞活力下降，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001），見圖7。

2.6 Klotho通過AT1R對細胞氧化應激損傷的影響 造模組、klotho過表達組、klotho+AT1R過表達組間ROS、MDA，SOD水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=7 815.00、26.77、22.54，Plt;0.001、P=0.001、P=0.002）。與造模組相比，klotho過表達組細胞ROS、MDA水平下降，SOD水平上升，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001、P=0.024、P=0.007）。與klotho過表達組相比，klotho+AT1R過表達組細胞ROS、MDA水平上升，SOD水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001、P=0.001、P=0.002），見圖8。

2.7 Klotho與AT1R相互作用 免疫共沉淀實驗證明，用klotho抗體下拉后能檢測到AT1R的表達，表明klotho和AT1R之間確實存在相互作用，見圖9。

3 討論

1997年，KURO-O等［8］通過培育基因缺陷小鼠發(fā)現(xiàn)了一種抑制衰老的基因——klotho基因，該實驗發(fā)現(xiàn)，klotho基因的缺失會引發(fā)一系列機體衰老退化的表現(xiàn)，如動脈鈣化、骨質(zhì)疏松、皮膚皺縮、生長遲緩、步態(tài)障礙、壽命縮短等。最初的動物實驗發(fā)現(xiàn)klotho主要在腎臟中表達，腎臟klotho表達的消除使血液循環(huán)中klotho水平降低80%，這與人體研究中所得結論一致［9］。近年來，在各種腎損傷模型的研究中，包括阿霉素腎病模型、環(huán)孢霉素A腎病模型、多柔比星腎病模型、糖尿病腎病模型等均發(fā)現(xiàn)klotho表達下降［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，造模組klotho mRNA與蛋白表達均顯著下降，提示在SSH腎損傷中存在klotho表達下降，這與上述研究結果一致。

Klotho參與機體多種病理生理反應，被認為是機體衰老進程中的重要調(diào)節(jié)因素。Klotho基因所編碼的三種klotho蛋白α-klotho、β-klotho、γ-klotho蛋白均為膜結合性蛋白功能局限，主要是作為成纖維細胞生長因子的受體來發(fā)揮相應作用［11］。其中，α-klotho蛋白可在蛋白酶的作用下將胞外結構域進行剪切，所得產(chǎn)物稱為可溶性klotho蛋白［12］。研究發(fā)現(xiàn)，可溶性klotho蛋白具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、調(diào)節(jié)鈣磷代謝、調(diào)控血糖穩(wěn)態(tài)等多種生物功能［13-14］。既往研究已證實klotho在腎損傷中的保護作用［15］。在腺嘌呤誘導的腎衰竭模型中，klotho-siRNA治療加劇了腎纖維化的進展，同時導致假手術組小鼠中出現(xiàn)腎損傷，然而，外源性補充klotho逆轉(zhuǎn)了上述現(xiàn)象［16］。不僅如此，HU等［17］發(fā)現(xiàn)，在腎臟缺血再灌注損傷誘導后給予klotho治療可以減少α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）與Ⅰ型膠原蛋白（I collagen）表達，抑制腎臟纖維化，減輕腎損傷，提示即使在腎損傷發(fā)生后，klotho同樣具有治療潛力。本研究采用klotho-siRNA干擾與過表達手段來探討klotho對HBZY1細胞活力的影響。發(fā)現(xiàn)與對照組相比，造模組細胞活力下降。與造模組相比，klotho過表達組細胞活力升高，而klotho干擾組細胞活力進一步下降，提示klotho對腎臟細胞具有保護作用。KIMURA等［18］發(fā)現(xiàn)，過表達klotho的小鼠腎組織中ROS水平低，過氧化氫、SOD等抗氧化酶活性高，而klotho缺陷小鼠ROS水平高，抗氧化酶活性低，表明klotho基因具有較強的抗氧化活性。本研究亦發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，造模組細胞內(nèi)ROS、MDA水平升高，SOD水平下降。與造模組相比，klotho過表達組ROS、MDA水平下降，SOD水平升高，而klotho干擾組細胞內(nèi)ROS、MDA水平進一步升高，SOD活性進一步下降。提示在HBZY1細胞中，klotho可通過抑制氧化應激損傷來發(fā)揮保護作用。

AngⅡ是氧化應激和ROS介導的信號傳導的有效中介，AngⅡ通過激活AT1R誘導ROS的產(chǎn)生。在高血壓小鼠心肌纖維化中，通過阻斷AT1R可明顯抑制AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞ROS生成和膠原表達［19］。此外，在AngⅡ誘導的新生大鼠心肌細胞肥大的研究中，klotho可顯著抑制心肌細胞肥大，進一步研究表明，klotho預處理顯著下調(diào)AT1R蛋白表達，而不影響血管緊張素Ⅱ2型受體蛋白表達［20］。本研究中，與造模組相比，klotho干預后ROS、MDA水平下降，SOD水平升高，細胞活力升高，而AT1R過表達后逆轉(zhuǎn)了上述現(xiàn)象。不僅如此，Co-IP實驗確定klotho與AT1R之間存在相互作用。提示klotho通過與AT1R受體相互作用，抑制氧化應激損傷，從而發(fā)揮細胞保護作用。

綜上所述，本研究從細胞水平驗證了klotho在SSH腎損傷中的保護作用，并從蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的角度，證明klotho通過與AT1R相互作用，抑制氧化應激損傷，從而發(fā)揮保護作用。后續(xù)計劃在細胞實驗中進一步探索klotho與AT1R之間的具體作用位點，并在動物實驗中探討klotho對SSH腎損傷的保護作用機制，為臨床應用及藥物研發(fā)提供更加充分的理論依據(jù)。

作者貢獻：趙偉進行文章的構思與設計，結果的分析與解釋及撰寫論文；唐榮杰、楊珊珊進行細胞實驗；楊芳負責文章的質(zhì)量控制及審校；孫鋒進行數(shù)據(jù)整理；廉秋芳進行論文的修訂，對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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（收稿日期：2022-10-14；修回日期：2023-02-04）

（本文編輯：康艷輝）