不同葉齡青海云杉針葉內(nèi)生真菌多樣性研究

摘 要：為尋找可能導(dǎo)致青海云杉感染頂芽銹病的原因，采用高通量測序技術(shù)對兩組1齡和2齡青海云杉針葉進(jìn)行測序，分析其內(nèi)生真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，6個(gè)樣本共得到407個(gè)可以用于物種分類的運(yùn)算分類單位（Operational Taxonomic Units，OTU），其中1齡針葉特有OTU數(shù)為16個(gè)，2齡針葉特有OTU數(shù)為20個(gè)，共有OTU數(shù)為93個(gè)。經(jīng)Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)，2齡針葉內(nèi)生真菌豐富度和多樣性略高于1齡針葉，群落結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，更有利于抵御病原菌侵染；兩組樣本的群落結(jié)構(gòu)差異較為明顯，其中1齡針葉組優(yōu)勢菌群為Kabatina和Aspergillus，2齡針葉組各菌群占比相差不大，沒有明顯優(yōu)勢菌群。經(jīng)Bata多樣性分析發(fā)現(xiàn)，兩組樣本間的不同重復(fù)分別聚在一起，相似性較高。初步推測，1齡針葉中Aspergillus真菌優(yōu)勢生長導(dǎo)致其內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)失衡，對針葉造成了一定的損害。

關(guān)鍵詞：青海云杉；高通量測序；內(nèi)生真菌；多樣性；群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S791.18 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-7909（2023）03-108-4

0 引言

青海云杉（Picea crassifolia Kom.）是松科云杉屬高大常綠針葉喬木，是我國特有樹種，主要分布在青海省、甘肅省、寧夏回族自治區(qū)及內(nèi)蒙古自治區(qū)等西北干旱地區(qū)，在造林綠化、涵養(yǎng)水源等方面發(fā)揮著重要作用。青海云杉主要生長于海拔1 700～3 000 m的陰坡山地，具有極強(qiáng)的耐寒、耐旱性，是組成高原森林系統(tǒng)最主要的樹種之一。目前，學(xué)者對青海云杉的研究多見于病蟲害防治［1-3］、育苗造林［4-6］等，還有不同生長狀態(tài)針葉內(nèi)生真菌多樣性［7］及根系內(nèi)生真菌多樣性［8］等研究。近年來，青海省海東市互助縣南門峽林區(qū)青海云杉頂芽銹病發(fā)生嚴(yán)重，導(dǎo)致云杉及林區(qū)生態(tài)平衡受到嚴(yán)重影響。在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，頂芽銹病病原菌只侵染新生針葉，對多年生針葉不具有侵染性。針對這一現(xiàn)象，筆者采用高通量測序技術(shù)，從植物內(nèi)生真菌角度出發(fā)探索健康青海云杉新生針葉（1齡針葉）和2齡針葉內(nèi)生真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化，尋找其內(nèi)生真菌與頂芽銹病病原菌之間的相關(guān)性。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究樣本于2022年7月中旬采集自互助縣南門峽林區(qū)（東經(jīng)101°53′17″E、北緯36°59′11″）。在3個(gè)不同林班采集青海云杉健康新生針葉（1齡針葉）與2年生針葉（2齡針葉）作為試驗(yàn)樣本，其中1齡針葉樣本分別命名為H1、H2、H3，2齡針葉樣本分別命名為F1、F2、F3，采集的樣本用冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室。在超凈工作臺(tái)對樣本進(jìn)行表面殺菌消毒處理，具體步驟如下。先依次將樣本在75%乙醇溶液中浸泡1 min，而后在5%次氯酸鈉溶液中浸泡5 min，最后用無菌水沖洗干凈，并用滅菌后的濾紙吸干水分。為盡量減小試驗(yàn)過程中產(chǎn)生的誤差，將殺菌消毒后的樣本放置于液氮中進(jìn)行速凍處理。試驗(yàn)所用儀器和試劑如表1所示。

1.2 樣本DNA提取及PCR擴(kuò)增

樣本基因組DNA采用CTAB法進(jìn)行提取，使用引物18S-R（5’-GTAACCCGCTGAACCTCC-3’）和18S-F（5’-GTCCGAAGACCTCACTAAATCA-3’）進(jìn)行18S片段擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2x Premix Taq 25 μL，引物18S-R和18S-F各1 μL，DNA模板50 ng，ddH2O補(bǔ)加至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物送往廣東美格基因科技有限公司測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)分析

利用Illumina HiSeq 2500測序平臺(tái)進(jìn)行測序，將得到的數(shù)據(jù)用FLASH v1.2.7軟件進(jìn)行拼接、過濾優(yōu)化，得到優(yōu)化序列（Tags）；再利用Usearch軟件對Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得運(yùn)算分類單位（Operational Taxonomic Units，OTU）數(shù)量?；贠TU豐度表，利用usearch-alpha_div進(jìn)行Alpha多樣性分析，再利用R軟件的prcomp函數(shù)進(jìn)行Bata多樣性分析，最后進(jìn)行共有及特有物種統(tǒng)計(jì)、群落組成分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)基本情況

由表2可知，6個(gè)樣本測序共獲得481 023對Reads，雙端Reads拼接過濾后共產(chǎn)生427 613條有效序列，有效序列數(shù)占比超過87.72%，且GC含量為49.1%，Q30含量大于97.6%，表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，堿基錯(cuò)誤率較低。

稀釋性曲線可以反映測序深度及物種豐富程度。由圖1稀釋性曲線可知，隨著樣本測序條數(shù)增加，稀釋性曲線表現(xiàn)為先急劇增加，隨后逐漸趨于平緩，表明測序樣本包含絕大多數(shù)的微生物物種信息，測序結(jié)果可以反映青海云杉針葉內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)。

6個(gè)樣本在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類，共獲得407個(gè)可以用于物種分類的OUT，其中H1、H2、H3、F1、F2、F3的OUT數(shù)分別為66、66、68、67、72、68個(gè)，且H組特有OTU數(shù)為16個(gè)，F(xiàn)組特有OTU數(shù)為20個(gè)，兩組樣本共有OTU數(shù)為93個(gè)（見圖2）。其中，共有OTU數(shù)占H組和F組OTU數(shù)的比例分別為82.3%和85.3%。共有OTU數(shù)較多，表明兩組樣本內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高。

2.2 內(nèi)生真菌Alpha多樣性分析

Richness和Chao1指數(shù)表示物種豐富度，香農(nóng)指數(shù)與物種多樣性呈正相關(guān)，辛普森指數(shù)與物種多樣性呈負(fù)相關(guān)。由內(nèi)生真菌群落Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，H組樣本Richness和Chao1指數(shù)除H2外均低于F組樣本，H組樣本辛普森指數(shù)均低于F組樣本，但兩組樣本香農(nóng)指數(shù)差異不明顯（見表3）。由此可見，F(xiàn)組樣本內(nèi)生真菌多樣性與豐富度略高于H組，其內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。

2.3 群落組成分析

利用QIIME軟件對獲得的OTU在不同分類水平上進(jìn)行注釋分類。由圖3可知，在門水平上，相對豐度較高的內(nèi)生真菌種類共注釋到了3個(gè)門，分別是子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和被孢霉菌門（Mortierellomycota）。其中，H組中Basidiomycota占比3.88%，Ascomycota占比44.71%；F組中Basidiomycota占比19.98%，Ascomycota占比37.22%。Mortierellomycota在兩組樣本中占比均不超過1%，其他未被注釋菌群（Unassigned）占比較高。

由圖4可知，在科水平上，兩組樣本相對豐度較高的物種有（Dothioraceae）、（Aspergillaceae）、（Taphrinaceae）、叢赤殼科（Nectriaceae）、（Mrakiaceae）、格孢腔菌科（Pleosporaceae）、（Sporidiobolaceae）及（Tremellaceae）。除了未被注釋的菌群外，Dothioraceae、Aspergillaceae、Taphrinaceae等菌群占比相對較高。H組中占比較高的優(yōu)勢菌群是Dothioraceae和Aspergillaceae；F組中占比較高的優(yōu)勢菌群主要是Taphrinaceae。上述3科菌群在兩組樣本中占比差異較明顯。

由圖5可知，在屬水平上，兩組樣本相對豐度較高的物種有Kabatina、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、Udeniomyces、匍柄霉屬（Stemphylium）、Rhodosporidiobolus、絲狀擔(dān)子菌屬（Filobasidium）及隱球酵母屬（Cryptococcus）。H組優(yōu)勢菌群為Kabatina和Aspergillus，其余菌群占比均較低；F組中除了未被注釋的菌群外，其余菌群相對豐度較為平衡，各屬菌群占比相似，沒有明顯優(yōu)勢菌群。在屬水平上，兩組樣本差異較為明顯，主要體現(xiàn)在Kabatina和曲霉屬（Aspergillus）上，這兩種菌群在H組中相對豐度明顯高于F組。

2.4 Beta多樣性分析

利用QIIME軟件對兩組進(jìn)行Beta多樣性分析，比較不同樣本間物種多樣性的相似程度（見圖6）。由PCoA分析可知，第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）分別可以解釋所有的變量的64.9%和15.3%，共解釋變量的80.2%。H組（1齡針葉）和F組（2齡針葉）中的3個(gè)樣本分別聚在一起，組內(nèi)內(nèi)生真菌群落差異不明顯，相似性高。

3 結(jié)論與討論

利用高通量測序技術(shù)對1齡和2齡青海云杉針葉的6個(gè)樣本進(jìn)行內(nèi)生真菌多樣性分析，發(fā)現(xiàn)2齡針葉內(nèi)生真菌多樣性與豐富度略高于1齡針葉，菌群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，更有利于抵御外來病原菌侵染；兩組樣本優(yōu)勢菌群存在明顯差異，H組樣本中Kabatina和Aspergillus為明顯優(yōu)勢菌群，F(xiàn)組樣本中各屬組成占比相對均衡，沒有明顯差距。有研究結(jié)果顯示，Aspergillus屬多種真菌會(huì)對植物造成病害，如水稻稻曲?。?］、武夷巖茶赤葉斑?。?0］、蘋果黑點(diǎn)病［11］等。尚未發(fā)現(xiàn)與Kabatina相關(guān)的研究文獻(xiàn)，該屬真菌作用尚不明確。初步推測，青海云杉新生針葉內(nèi)生真菌中Aspergillus占比較高，導(dǎo)致其內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)失衡，可能對新生葉造成一定損害，加之新生針葉表皮細(xì)胞尚未發(fā)育成熟，在應(yīng)對銹病病原菌侵入時(shí)沒有建立良好的抵御屏障；在這一系列因素的共同作用下，青海云杉頂芽銹病病原菌更易侵染新生針葉。此次研究中的PCoA結(jié)果顯示，兩組樣本中的3個(gè)重復(fù)聚在一起，相似性高，數(shù)據(jù)結(jié)果合理、可靠。

參考文獻(xiàn)：

［1］賀樹榮.青海云杉主要病蟲害及其防治策略［J］.河南農(nóng)業(yè)，2022（26）：25-27.

［2］任立民.云杉葉銹病發(fā)生規(guī)律調(diào)查及防治藥劑篩選［J］.青海農(nóng)林科技，2022（4）：106-109.

［3］劉亨銀.青海云杉常見病蟲害防治技術(shù)［J］.廣東蠶業(yè)，2021（11）：91-92.

［4］江麗.青海云杉育苗培育及造林技術(shù)分析［J］.廣東蠶業(yè)，2022（3）：111-113.

［5］吳延瑾.青海云杉林撫育間伐效果研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2022（8）：111-113.

［6］程雪玲.青海云杉育苗造林技術(shù)［J］.農(nóng)村實(shí)用技術(shù)，2021（12）：119-120.

［7］方泰軍，白露超.青海云杉針葉內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析［J］.分子植物育種，2022（15）：5198-5204.

［8］徐穎，樊永軍，趙雅茹，等.包頭市九峰山青海云杉根系內(nèi)生真菌的多樣性及群落構(gòu)建機(jī)制：基于三代測序技術(shù)［J］.干旱區(qū)資源與環(huán)境，2022（8）：119-124.

［9］祝浩文，張亞玲.水稻稻曲病病原菌研究及其綜合防治技術(shù)［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2018（20）：70-72.

［10］武廣珩，王東曉，傅仙玉，等.武夷巖茶赤葉斑病的病原菌鑒定［J］.武夷學(xué)院學(xué)報(bào)，2018（9）：8-12.

［11］戴蓬博，張榮，孫廣宇.中國蘋果病害病原菌物名錄［J］.菌物學(xué)報(bào)，2021（4）：936-964.