參芪益心方對缺氧復氧心肌細胞氧化應激和凋亡的作用機制

摘要 目的：探討參芪益心方對缺氧復氧心肌細胞氧化應激、凋亡的調(diào)控及其潛在的機制。方法：應用SD大鼠制備含藥血清。缺氧復氧處理制造損傷心肌細胞模型。設(shè)置心肌細胞為NC組 、H/R組及給藥組，采用不同濃度含藥血清（3%、6%、9%）處理損傷心肌細胞，設(shè)置為低劑量組（L組）、中劑量組（M組）、高劑量組（H組）。細胞計數(shù)試劑盒（CCK8）檢測細胞存活率；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測細胞活化的半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）、Toll樣受體家族成員4（TLR4）、核因子κB（NF-κB）和NF-κB二聚體的抑制蛋白ɑ（I-κBɑ）；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測細胞乳酸脫氫酶（LDH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量；免疫熒光法檢測細胞活性氧（ROS）活性、細胞鈣離子含量。結(jié)果：與NC組比較，H/R組細胞存活率、GSH-Px、SOD含量、I-κBɑ蛋白表達降低，Cleaved Caspase-3蛋白表達、凋亡率、LDH、ROS、MDA、鈣離子含量及TLR4、NF-κB蛋白表達升高（P＜0.05）。與H/R組比較，L組、M組、H組H/R組細胞存活率、GSH-Px、SOD含量、I-κBɑ蛋白表達升高，Cleaved Caspase-3蛋白表達、凋亡率、LDH、ROS、MDA、鈣離子含量及TLR4、NF-κB蛋白表達降低，且呈濃度依賴性。結(jié)論：參芪益心方可抑制缺氧復氧誘導的心肌細胞氧化應激和凋亡，其作用機制可能與維持鈣穩(wěn)態(tài)、抑制NF-κB信號通路活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞 缺氧復氧誘導的心肌細胞；參芪益心方；氧化應激；凋亡；鈣離子；核因子κB信號通路；大鼠；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.16.010

急性心肌梗死是臨床常見的心血管疾病，該病具有較高的發(fā)病率和死亡率［1］。在恢復血流的過程中造成心肌缺血后再灌注引起損傷［2］，因此，探討降低心肌灌注引起的心肌損傷，提高灌注成為治療的重點。中藥方劑是將幾種草藥整合成一個“方劑”，中醫(yī)學公認的理論是“君臣佐使”［3］。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：“‘君’治愈疾病的主要原因或癥狀；‘臣’能增強‘君’的功效，或治療伴隨癥狀；‘佐劑’的主要功能是減少或消除君藥或臣藥的潛在毒性作用，‘使劑’將上述草藥運送到靶器官”。參芪益心方治療心血管相關(guān)疾病歷史悠久［4-5］，但該方劑的治病機制尚未明確。本研究旨在探討參芪益心方減輕缺氧復氧誘導的心肌細胞氧化應激和凋亡的機制與鈣穩(wěn)定和核因子κB（NF-κB）信號通路之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

50只10周齡無特定病原體（SPF）級雌性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物許可證號：SYXK（京）2020-0012。

1.1.2 實驗試劑

參芪益心方組方：白人參20 g，黃芪20 g，桂枝10 g，丹參15 g，白術(shù)15 g，茯苓20 g，葶藶子15 g，益母草15 g，淫羊藿20 g，仙鶴草30 g，甘草10 g。由醫(yī)院藥劑科提供。大鼠心肌細胞H9c2（貨號：CRL-1446）購自美國菌種保藏中心；DMEM培養(yǎng)基（貨號：11995065）購自Gibco；細胞計數(shù)試劑盒（CCK8）（貨號：CK04）購自日本同仁化學研究所；活性氧（ROS）檢測試劑盒（貨號E004）、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（貨號：A020-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒（貨號：A005）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（貨號：A001-3）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（貨號：A003-1-2）購自南京建成生物工程研究所；膜聯(lián)蛋白V-碘化丙錠（Annexin V-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：CA1040）購自北京索萊寶生物公司；實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）試劑盒（貨號：95057-200）購自北京愛普拜生物公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號：RG088S）購自上海碧云天生物研究所；細胞鈣離子檢測試劑盒（貨號：HR9071）購自北京百奧萊博科技公司。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備［6］

從50只大鼠中隨機選10只作為空白組，剩余大鼠均灌胃參芪益心方?？瞻捉M大鼠灌胃等量的生理鹽水，剩余大鼠灌胃參芪益心方35 g（35 g方劑藥物煎熬為5 mL），每日2次，連續(xù)3 d。末次給藥后，取動脈血血清并滅活處理，分裝后，－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng)及模型的制備

使用DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清＋1%雙抗），置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度空氣中培養(yǎng)心肌細胞，2 d更換1次培養(yǎng)基，設(shè)置為NC組。H/R組細胞制備：將心肌細胞的細胞培養(yǎng)液更換為1%血清，培養(yǎng)箱內(nèi)的氣體成分更換為94%N2、5%CO2的混合氣體中培養(yǎng)，缺氧培養(yǎng)4 h。缺氧結(jié)束后，將細胞用常規(guī)培養(yǎng)液和常規(guī)細胞培養(yǎng)箱中進行復氧培養(yǎng)。

1.2.3 細胞分組與處理

將心肌細胞隨機分為NC組、H/R組、L組、M組、H組。NC組、H/R組細胞的處理方法同1.2.2。將含藥血清用培養(yǎng)液調(diào)至3%含藥血清、6%含藥血清和9%含藥血清，待用。將心肌細胞依次用3%含藥血清、6%含藥血清和9%含藥血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，之后進行缺氧復氧處理，分別設(shè)置為L組、M組、H組。

1.2.4 CCK8實驗檢測細胞存活

收集培養(yǎng)48 h的細胞，采用培養(yǎng)液調(diào)整濃度0.5×105個/mL。取200 μL分裝置96孔板，再加入CCK8反應液5 μL，微微震蕩混勻，避光孵育20 min。酶標儀上檢測細胞490 nm波長下的吸光度（OD490）。細胞存活率（%）＝OD490實驗組/OD490對照組×100%。

1.2.5 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測細胞活化的半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）、Toll樣受體家族成員4（TLR4）、NF-κB和NF-κB二聚體的抑制蛋白ɑ（I-κBɑ）表達

收集培養(yǎng)48 h的細胞，RIPA冰上裂解30 min，提取總蛋白；經(jīng)二喹啉甲酸（BCA）定量，沸水變性后，取上清液上樣；十二烷基酸鈉聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳液進行蛋白電泳，上層配制6.5%濃縮膠，下層配制8.5%分離膠進行灌膠，電泳時先穩(wěn)流后穩(wěn)壓，持續(xù)3～5 h。結(jié)束后，將膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；用2.5%脫脂奶粉的封閉液于37 ℃封閉2 h，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗膜3次，滴加一抗溶液，4 ℃孵育過夜，洗膜，再滴加二抗溶液37 ℃孵育2 h。超敏電化學發(fā)光（ECL）試劑盒對膜顯影、定影，曝光。Image J軟件處理蛋白灰度，將蛋白條帶轉(zhuǎn)化為灰度值。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

收集培養(yǎng)48 h的細胞，PBS清洗5次，用500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細胞。取Annexin V-FITC反應液5 μL，避光孵育15 min，再加入PI溶液5 μL，繼續(xù)避光孵育10 min，流式細胞儀分析細胞凋亡情況。細胞總凋亡率（%）＝早期凋亡率＋晚期凋亡率。

1.2.7 ELISA檢測細胞LDH、GSH-Px、SOD和MDA

按照相關(guān)指標的試劑盒說明書要求操作，處理細胞，配制試劑，加樣，孵育，判定結(jié)果。

1.2.8 免疫熒光法檢測細胞ROS相對活性

按照ROS檢測試劑盒（化學熒光法）操作流程要求操作。先將DCFH-DA熒光探針（1∶2 000）加入培養(yǎng)液，37 ℃孵育1 h。收集細胞，用PBS洗滌2次，1 000×重力加速度（g）離心10 min，制成重懸液。在激發(fā)波長510 nm、發(fā)射波長530 nm條件下檢測細胞熒光強度。以平均熒光強度（MIF）值代表ROS水平。

1.2.9 檢測細胞鈣離子含量

收集培養(yǎng)48 h的細胞，PBS充分洗滌3次。將細胞鈣離子檢測試劑盒中的Fluo-3 AM染色液逐滴加入細胞，直至浸沒細胞，37 ℃孵育45 min。PBS洗滌3次，繼續(xù)培養(yǎng)20 min。多功能儀調(diào)至激發(fā)波長490 nm、發(fā)射波長516 nm，檢測細胞熒光鈣離子含量。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用最小顯著差異法（LSD-t）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌細胞存活率比較

與NC組比較，H/R組細胞48、72、96 h存活率均降低（P＜0.05）；與H/R組比較，L組、M組、H組細胞48、72、96 h存活率均升高（P＜0.05）；與L組比較，M組、H組細胞48、72、96 h存活率均升高（P＜0.05）；與M組比較，H組細胞48、96 h存活率均升高（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 各組H/R心肌細胞Cleaved Caspase-3蛋白表達及凋亡率比較

與NC組比較，H/R組細胞Cleaved Caspase-3蛋白表達、凋亡率均升高（P＜0.05）；與H/R組比較，L組、M組、H組細胞Cleaved Caspase-3蛋白表達、凋亡率均降低（P＜0.05）；與L組比較，M組、H組細胞Cleaved Caspase-3蛋白表達、凋亡率均降低（P＜0.05）；與M組比較，H組細胞Cleaved Caspase-3蛋白表達、凋亡率均降低（P＜0.05）。詳見圖1、圖2及表2。

2.3 各組H/R心肌細胞LDH、ROS、GSH-Px、SOD和MDA含量比較及各組心肌細胞熒光強度

與NC組比較，H/R組細胞LDH、ROS和MDA含量均升高，GSH-Px、SOD含量降低（P＜0.05）；與H/R組比較，L組、M組、H組細胞LDH、ROS和MDA含量均降低，GSH-Px、SOD含量升高（P＜0.05）；與L組比較，M組、H組細胞LDH、ROS和MDA含量均降低，GSH-Px、SOD含量升高（P＜0.05）；與M組比較，H組細胞LDH、ROS和MDA含量均降低，GSH-Px、SOD含量升高（P＜0.05）。詳見圖3、表3。

2.4 各組H/R心肌細胞鈣離子含量比較

與NC組比較，H/R組細胞鈣離子含量升高（P＜0.05）；與H/R組比較，L組、M組、H組細胞鈣離子含量降低（P＜0.05）；與L組比較，M組、H組細胞鈣離子含量降低（P＜0.05）；與M組比較，H組細胞鈣離子含量降低（P＜0.05）。詳見表4。

2.5 各組H/R心肌細胞TLR4、NF-κB和I-κBɑ蛋白表達比較

與NC組比較，H/R組細胞TLR4、NF-κB蛋白表達升高，I-κBɑ蛋白表達降低（P＜0.05）；與H/R組比較，L組、M組、H組細胞TLR4、NF-κB蛋白表達降低，I-κBɑ蛋白表達升高（P＜0.05）；與L組比較，M組、H組細胞TLR4、NF-κB蛋白表達降低，I-κBɑ蛋白表達升高（P＜0.05）；與M組比較，H組細胞TLR4、NF-κB蛋白表達降低，I-κBɑ蛋白表達升高（P＜0.05）。詳見圖4、表5。

3 討 論

中藥治療心臟疾病的療效得到廣泛認可［7］，包括參芪益心方，但其作用機制尚未明確。Zhuang等［8］采用阿霉素成功建立心肌衰竭大鼠模型，結(jié)果顯示，參芪益心方治療大鼠左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、心肌細胞凋亡率及P53蛋白、Bax和Caspase-3蛋白和mRNA表達均降低，左室射血分數(shù)（LVEF）、左室短縮分數(shù)（LVFS）、每搏量（SV）及Bcl-2蛋白、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1α（PGC-1α）和Bcl-2 mRNA表達均升高，對模型大鼠有心臟保護作用，提示保護作用的機制可能與PGC-1α表達及線粒體凋亡有關(guān)。金娟等［9］研究顯示，參芪益心方抑制了阿霉素誘導的心肌細胞凋亡，發(fā)揮保護作用的機制為抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和凋亡。本研究結(jié)果顯示，參芪益心方對缺氧復氧誘導的心肌細胞的活性具有明顯的增強作用，對缺氧復氧誘導的心肌細胞凋亡有抑制作用，抑制Cleaved Caspase-3蛋白表達，并呈濃度依賴性；參芪益心方可呈濃度依賴性抑制缺氧復氧心肌細胞LDH、ROS和MDA分泌，促進GSH-Px、SOD分泌，發(fā)揮顯著的抗氧化應激功能。上述實驗結(jié)果提示參芪益心方除對損傷的心肌細胞具有增殖促進和凋亡抑制作用外，還有明顯的抗氧化應激功效。

鈣離子是細胞內(nèi)的第二信使，參與調(diào)節(jié)細胞的多種基礎(chǔ)生理活動［10-11］。心肌細胞鈣離子的穩(wěn)態(tài)對維持心肌細胞功能具有重要作用。鈣超載是引起心肌細胞損傷、凋亡的主要因素［12］。Zhao等［13］研究顯示，人參皂苷保護烏頭堿引起心肌細胞損傷的途徑包括維持鈣離子穩(wěn)定，激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路及其下游蛋白的級聯(lián)反應。童靜［14］在阿霉素誘導H9c2損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，中藥川芎嗪對阿霉素誘導的心肌細胞具有抗凋亡、增強心肌細胞收縮力的作用，其機制為維持肌漿網(wǎng)、線粒體鈣相關(guān)轉(zhuǎn)運體在細胞內(nèi)的平衡。本研究結(jié)果顯示，在缺氧復氧心肌細胞中鈣離子含量升高，參芪益心方可降低損傷細胞內(nèi)鈣離子含量。結(jié)果提示參芪益心方具有與人參皂苷、川芎嗪相似的維持心肌細胞鈣離子平衡作用，發(fā)揮對心肌細胞的保護作用。

NF-κB信號通路參與人類較多炎性疾病、癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程，已得到實驗研究的證實，其中包括心肌損傷引起的心肌炎、心肌梗死等［15］。Li等［16］研究顯示，在過氧化氫誘導的心肌細胞中PI3K/AKT和NF-κB信號通路的活性異常升高，降低心肌細胞的活力，凋亡能力增強，氧化應激反應升高，提示NF-κB信號通路參與心肌細胞的損傷過程。本研究結(jié)果顯示，在缺氧復氧心肌細胞NF-κB信號通路中的關(guān)鍵因子TLR4、NF-κB蛋白表達升高，I-κBɑ蛋白表達降低，說明NF-κB信號通路處于激活狀態(tài)。經(jīng)參芪益心方處理后，TLR4、NF-κB蛋白表達呈濃度依賴性降低，I-κBɑ蛋白表達呈濃度依賴性升高，NF-κB信號通路活性逐漸恢復正常。結(jié)果說明，參芪益心方可維持缺氧復氧引起的心肌細胞NF-κB信號通路活性的穩(wěn)定，減輕心肌細胞損傷。

綜上所述，參芪益心方可抑制缺氧復氧引起的心肌細胞氧化應激和凋亡，其潛在的作用機制與維持鈣穩(wěn)態(tài)、抑制NF-κB信號通路有關(guān)，同時本研究為參芪益心方應用于心臟保護提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2022-05-09）

（本文編輯薛妮）

基金項目 湖北省科技計劃項目（No.2017FFB6322）

作者單位 十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院（湖北十堰" 442000），E-mail：125600596@qq.com

引用信息 盧曜嘉，鄭勝鵬，馬春明，等.參芪益心方對缺氧復氧心肌細胞氧化應激和凋亡的作用機制［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2023，21（16）：2967-2971.