甘草酸通過ROS依賴性NLRP3炎性通路減輕缺氧H9c2細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究

摘要 目的：觀察甘草酸（GA）對(duì)缺氧H9c2細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激的影響，并探討其潛在作用機(jī)制。方法：將正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞設(shè)置為對(duì)照組，缺氧培養(yǎng)H9c2細(xì)胞設(shè)置為缺氧組；GA、GA＋N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）處理的缺氧H9c2細(xì)胞設(shè)置為缺氧＋GA組、缺氧＋GA＋NAC組；將生理鹽水、雙蒸水＋GA處理的缺氧H9c2細(xì)胞設(shè)置為缺氧＋生理鹽水組、缺氧＋GA＋雙蒸水組。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK8）、5-乙炔基-2′-脫氧尿苷（EdU）染色法測(cè)定細(xì)胞增殖；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）；免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞活性氧（ROS）；實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)細(xì)胞NOD樣受體蛋白3（NLPR3）mRNA表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，缺氧組H9c2細(xì)胞存活率、EdU陽性率均降低，細(xì)胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA含量及ROS、NLRP3 mRNA水平均升高，SOD含量降低（P＜0.05）；與缺氧＋生理鹽水組比較，缺氧＋GA組H9c2細(xì)胞存活率、EdU陽性率均升高，細(xì)胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA含量及ROS、NLRP3 mRNA水平均降低，SOD含量升高（P＜0.05）。與缺氧＋GA＋雙蒸水組比較，缺氧＋GA＋NAC組H9c2細(xì)胞ROS、NLRP3及TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA降低，SOD含量升高（P＜0.05）。結(jié)論：GA可減輕缺氧誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞的炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)，其機(jī)制與抑制ROS依賴性NLRP3炎性通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 缺氧誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞；甘草酸；炎癥；氧化應(yīng)激；活性氧依賴性NOD樣受體蛋白3炎性通路；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.16.007

Experimental Study of Glycyrrhetinic Acid Alleviating Hypoxia Induced H9c2 Cell Injury through ROS-dependent NLRP3 Inflammatory Pathway

ZANG Yuchen， WANG Shengjuan

Beijing Shijitan Hospital， Capital Medical University， Beijing 100038， China， E-mail： zangyuchen@bjsjth.cn

Abstract Objective：To observe the effects of glycyrrhetinic acid（GA） on inflammation and oxidative stress of hypoxic H9c2 cells.Methods：Normal cultured H9c2 cells were set as the control group，and hypoxic cultured H9c2 cells were set as the hypoxia group，hypoxic H9c2 cells treated with GA and GA N-acetyl-L-cysteine（NAC） were set as hypoxia＋GA group and hypoxia＋NAC group，normal saline，double distilled water＋GA-treated hypoxic H9c2 cells were set as hypoxia＋normal saline group，hypoxia＋GA＋double distilled water group.Cell proliferation was measured by cell counting kit（CCK8），5-ethynyl-2′-deoxyuridine（EdU） staining method.The levels of tumor necrosis factor α（TNF-α），interleukin（IL）-6，IL-1β，malondialdehyde（MDA），and superoxide dismutase（SOD） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Reactive oxygen species（ROS） was detected by immunofluorescence.The mRNA expression of NOD-like receptor protein 3（NLRP3）was detected by real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（RT-qPCR）.Results：H9c2 cell survival and EdU positivity in the hypoxia group decreased，cell supernatant TNF-α，IL-6，IL-1β，MDA content and ROS，NLRP3 mRNA levels" increased，and SOD content" decreased（P＜0.05）.Compared with the hypoxia＋normal saline group，H9c2 cell survival and EdU positivity in the hypoxia＋GA group increased，cell supernatant TNF-α，IL-6，IL-1β，MDA content and ROS，NLRP3 mRNA levels decreased，and SOD content" increased（P＜0.05）.Compared with the hypoxia＋GA＋double-distilled water group，ROS，NLRP3，TNF-α，IL-6，IL-1β，MDA of H9c2 cells in the hypoxia＋GA＋NAC group decreased，and SOD content" increased（P＜0.05）.Conclusion：Glycyrrhetinic acid could alleviate hypoxia-induced inflammatory，oxidative stress in H9c2 cells，and its mechanism might be related to the inhibition of ROS-dependent NLRP3 inflammatory pathway.

Keywords hypoxia induced H9c2 cells; Glycyrrhetinic acid;" inflammation; oxidative stress; reactive oxygen species dependent NOD-like receptor protein 3 inflammatory pathway; experimental study

心肌梗死是由缺氧或急性持續(xù)性缺血引起，導(dǎo)致不可逆的心肌損傷和心力衰竭［1-2］。盡管預(yù)防和治療心肌梗死的醫(yī)療技術(shù)水平有較大提高，但心肌梗死死亡率未見明顯下降。甘草酸（glycyrrhetinic acid，GA）是一種從甘草中分離出來的苷元皂苷，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、保肝、抗過敏、解毒等多種藥用效果［3-4］。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，GA在心臟相關(guān)疾病治療中具有保護(hù)作用［5］，但其發(fā)揮作用的機(jī)制仍需繼續(xù)探討?；钚匝酰≧OS）主要由線粒體釋放，細(xì)胞積累過多可激活NOD樣受體蛋白3（NLPR3）炎癥小體，進(jìn)而募集半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1），引起細(xì)胞死亡［6-7］。本研究觀察GA對(duì)缺氧H9c2細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激的影響，并探討其潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

H9c2心肌細(xì)胞購自中國(guó)（上海）科學(xué)研究院細(xì)胞庫；GA（批號(hào)：1405-86-3；純度＞99%）購自美國(guó)Abmole公司；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）（批號(hào)：616-91-1）購自上海生工生物；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK8）購自美國(guó)GlpBio；5-乙炔基-2′-脫氧尿苷（EdU）-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自上海BeyoClick；人腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒、人白細(xì)胞介素（IL）-6檢測(cè)試劑盒、人IL-1β檢測(cè)試劑盒、人丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒均購自日本TAKERA；ROS熒光檢測(cè)分析試劑盒購自武漢艾美捷科技；RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）試劑盒購自北京索萊寶生物技術(shù)公司；實(shí)驗(yàn)所用引物的設(shè)計(jì)、合成由上海吉瑪基因提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

使用混合10%胎牛血清和1%雙抗（青鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細(xì)胞，37 ℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日更換1次培養(yǎng)基。

1.2.2 細(xì)胞分組與處理

將正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞分為對(duì)照組、缺氧組、缺氧＋生理鹽水組、缺氧＋GA組、缺氧＋GA＋雙蒸水組、缺氧＋GA＋NAC組。對(duì)照組為常規(guī)條件下培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞；缺氧組為1% O2、94% N2、5% CO2的氣體條件下培養(yǎng)24 h的H9c2細(xì)胞；缺氧＋生理鹽水組、缺氧＋GA組為生理鹽水及其配制的10 μmol /L的GA溶液處理12 h的H9c2細(xì)胞；缺氧＋GA＋雙蒸水組、缺氧＋GA＋NAC組為雙蒸水、10 mmol/L的NAC處理4 h的缺氧＋GA組H9c2細(xì)胞。

1.2.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖

收集待檢細(xì)胞，培養(yǎng)液調(diào)至0.5×105個(gè)/mL，接種于96孔板上，每孔200 μL。每孔10 μL的CCK8反應(yīng)液，震蕩混勻，孵育20 min。結(jié)束后上酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞的吸光度（OD490）。細(xì)胞存活率（%）＝OD490實(shí)驗(yàn)組/OD490對(duì)照組×100%。

1.2.4 EdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖

收集待檢測(cè)細(xì)胞，培養(yǎng)液調(diào)至0.5×105個(gè)/mL，200 μL取接種96孔板。每孔加入50 μmol/L的EdU，37 ℃溫箱孵育3 h。使用4%多聚甲醛固定30 min，GA中和處理5 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗。0.5%的Triton滲透劑脫色搖床孵育10 min，PBS清洗。最后用二脒基苯基吲哚（DAPI）染色細(xì)胞核。使用熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞中EdU染色細(xì)胞。EdU陽性率（%）＝EdU陽性細(xì)胞數(shù)（紅色熒光）/細(xì)胞總數(shù)（藍(lán)色熒光）×100%。

1.2.5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、SOD含量

收集對(duì)數(shù)期各組細(xì)胞的培養(yǎng)液上清，按照TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、SOD的ELISA試劑盒要求操作，檢測(cè)上清TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、SOD含量。

1.2.6 熒光探針檢測(cè)細(xì)胞ROS

將待測(cè)細(xì)胞調(diào)至0.5×105個(gè)/mL，每孔100 μL接種在96孔板，每孔100 μL無血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h。棄去上清，同時(shí)避免劃傷底部的細(xì)胞。按照ROS活性檢測(cè)試劑盒說明書要求操作，1 000倍稀釋DCFH-DA熒光探針，每孔40 μL，37 ℃孵育4 h。取出細(xì)胞，DAPI染色細(xì)胞核，熒光顯微鏡下拍照，酶標(biāo)儀設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm測(cè)定細(xì)胞的熒光活性。

1.2.7 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞NLRP3 mRNA表達(dá)

RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取細(xì)胞RNA并合成cDNA，作為qPCR實(shí)驗(yàn)的模板。qPCR試劑盒檢測(cè)分析樣本NLRP3 mRNA水平。GAPDH作為內(nèi)參，2－△△Ct法計(jì)算結(jié)果。引物信息：NLRP3正向引物5′-CCGGGTCTAGCTGGTGAAAG-3′，反向引物5′-TCTCCTCTAGGTCCTAACGGG-3′；GAPDH正向引物5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′，反向引物5′-ACTGAGTGTGGCAGGGACTC-3′。反應(yīng)程序中95 ℃預(yù)變性，59 ℃退火，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用PEMS 3.0、Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GA對(duì)缺氧誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較，缺氧組H9c2細(xì)胞存活率降低，EdU陽性率降低（P＜0.05）；與缺氧＋生理鹽水組比較，缺氧＋GA組H9c2細(xì)胞存活率、EdU陽性率均升高（P＜0.05）。詳見圖1、表1。

2.2 GA對(duì)缺氧誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞上清炎性因子分泌的影響

與對(duì)照組比較，缺氧組H9c2細(xì)胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β含量均升高（P＜0.05）；與缺氧＋生理鹽水組比較，缺氧＋GA組H9c2細(xì)胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β含量均降低（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 GA對(duì)缺氧誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與對(duì)照組比較，缺氧組H9c2細(xì)胞上清SOD含量降低，MDA含量升高（P＜0.05）；與缺氧＋生理鹽水組比較，缺氧＋GA組H9c2細(xì)胞上清SOD含量升高，MDA含量降低（P＜0.05）。詳見表3。

2.4 GA對(duì)缺氧誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞ROS、NLRP3水平的調(diào)控

與對(duì)照組比較，缺氧組H9c2細(xì)胞ROS熒光活性上升，NLRP3 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）；與缺氧＋生理鹽水組比較，缺氧＋GA組H9c2細(xì)胞ROS熒光活性下降，NLRP3 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）。詳見圖2、表4。

2.5 NAC處理對(duì)GA調(diào)控缺氧誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞炎性因子分泌、氧化應(yīng)激水平的調(diào)控

與缺氧＋GA＋雙蒸水組比較，缺氧＋GA＋NAC組H9c2細(xì)胞ROS熒光活性下降，NLRP3 mRNA表達(dá)降低，細(xì)胞上清TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA含量均降低，SOD升高（P＜0.05）。詳見表5。

3 討 論

GA在較多肝臟疾病中具有保肝作用［8-9］，在心臟缺血再灌注損傷中可降低敏感性和室性心律失常的發(fā)生［10］。Zhang等［11］通過烏頭堿、甘草苷和GA的正交組合觀察心肌細(xì)胞的損傷發(fā)現(xiàn)，烏頭堿可降低心肌細(xì)胞存活率，下調(diào)鈉/鈣交換體（NCX1）和二氫喋呤還原體-α1（DHPR-α1）表達(dá)，上調(diào)ryanodine受體2型（RyR2）表達(dá)，具有明顯的損傷作用，烏頭堿與甘草苷或GA配伍可不同程度減輕烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，提示甘草苷、GA可調(diào)節(jié)鈣相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞。Wang等［12］研究顯示，GA不僅可改善氧糖剝奪H9c2細(xì)胞核大小、染色質(zhì)濃縮，同時(shí)以劑量依賴性方式降低細(xì)胞凋亡率和乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）和IL-1β水平；GA可增加Bcl-2蛋白表達(dá)，降低了Caspase-8和Bax蛋白表達(dá)，提高了Bcl-2/Bax比值，增加了磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）蛋白的表達(dá)，說明GA以劑量依賴性減少H9c2細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號(hào)通路有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，GA可減弱缺氧H9c2細(xì)胞的增殖抑制，增加了細(xì)胞存活率和EdU陽性率，說明GA有益于提高H9c2細(xì)胞的缺氧耐受力。進(jìn)一步研究顯示，GA抑制了致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和MDA分泌，促進(jìn)SOD分泌，提示GA具有抗缺氧誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激作用。GA發(fā)揮心臟保護(hù)作用的潛在機(jī)制有待進(jìn)一步深入探討。

NLRP3炎性小體主要由線粒體產(chǎn)生，可被ROS、鈣異常、融合蛋白及雙磷脂酰甘油激活［13］。ROS是激活NLRP3成熟為NLRP3炎性小體的重要第二信使［14］。NAC具有雙重活性，即活性氧和蛋白酶抑制作用。有研究顯示，NAC保護(hù)心肌細(xì)胞是通過抑制活性氧保護(hù)心肌缺血/再灌注損傷，而不是蛋白酶［15］。Dai等［16］通過建立敗血癥小鼠模型發(fā)現(xiàn)，脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠伴有心功能降低和心肌損傷，消皮素D（GSDMD）基因敲除對(duì)小鼠具有心臟保護(hù)作用，且核因子-κB信號(hào)通路和ROS-NLPR3炎癥通路失活，說明ROS-NLPR3炎癥通路參與GSDMD相關(guān)敗血癥心臟疾病的病理過程。張曉青等［17］研究顯示，慢性心力衰竭小鼠模型心肌組織ROS、NLRP3、Caspase-1水平均上調(diào)，心肌細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，經(jīng)中藥鹿芪方治療后，ROS/NLRP3/Caspase-1通路的活性得到抑制，模型小鼠心肌炎癥反應(yīng)減輕，說明ROS/NLRP3/Caspase-1通路參與慢性心力衰竭引起的心肌炎。本研究結(jié)果顯示，在缺氧H9c2細(xì)胞中ROS活性、NLRP3表達(dá)均提高，與ROS、NLRP3在炎癥相關(guān)疾病中的活性一致。進(jìn)一步研究顯示，GA處理后缺氧H9c2細(xì)胞該通路的活性明顯抑制，提示ROS依賴性NLRP3炎性通路可能參與了GA的藥理作用機(jī)制。NAC處理后，GA治療的缺氧H9c2細(xì)胞中ROS、NLRP3水平下降，且GA處理后的TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA抑制和SOD促進(jìn)作用得到增強(qiáng)，說明ROS依賴性NLRP3通路在GA的心肌細(xì)胞抗炎抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

綜上所述，GA抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激，其作用機(jī)制與抑制ROS依賴性NLRP3通路有關(guān)，為GA在心臟相關(guān)疾病的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2022-06-20）

（本文編輯薛妮）

基金項(xiàng)目 北京市衛(wèi)生科技發(fā)展專項(xiàng)基金項(xiàng)目（No.2018-7-110）

作者單位 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院（北京" 100038），E-mail：zangyuchen@bjsjth.cn

引用信息 臧雨宸，王勝娟.甘草酸通過ROS依賴性NLRP3炎性通路減輕缺氧H9c2細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2023，21（16）：2951-2956.