摘要:通過響應(yīng)面設(shè)計,利用超聲輔助法優(yōu)化黑藜麥多糖的提取工藝;通過DPPH自由基清除率、ABTS+清除率、總抗氧化能力和羥自由基清除率分別測定黑藜麥多糖的抗氧化活性;考察溫度與pH對黑藜麥多糖抗氧化活性穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明,黑藜麥多糖的提取工藝優(yōu)化方案為提取時間30 min,提取溫度60 ℃,料液比1∶9 g/mL,得到黑藜麥多糖的提取率為9.829 4%;通過4種方法測定多糖的抗氧化活性,表明多糖純度越高其抗氧化性越強;黑藜麥多糖抗氧化性的穩(wěn)定性受溫度的影響變化顯著,溫度越高,加熱時間越長,穩(wěn)定性越低,在中性或偏酸性條件下穩(wěn)定性較好??梢姡谵见湺嗵蔷哂酗@著的抗氧化活性,其穩(wěn)定性受溫度和pH等因素的影響。
關(guān)鍵詞:黑藜麥;多糖;提取工藝;抗氧化;穩(wěn)定性
中圖分類號:R284.2" " " " "文獻標識碼:A
文章編號:0439-8114(2023)08-0160-07
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.08.026 開放科學(資源服務(wù))標識碼(OSID):
Study on ultrasonic-assisted extraction process, antioxidant activity and stability of polysaccharides from black quinoa
YANG Min1,XI Jun-wei2
(1.Shaanxi Institute of International Trade amp; Commerce,Xi’an" 712046,China;
2.Shaanxi Adverse Drug Reaction Monitoring Center, Xi’an" 710000,China)
Abstract:The Response Surface Methodology was used to optimize the extraction process of polysaccharides from black quinoa by ultrasonic-assisted extraction. The antioxidant activity of the polysaccharides from black quinoa was determined by DPPH radical scavenging rate, ABTS+ scavenging rate, total antioxidant capacity and hydroxyl radical scavenging rate. The effects of temperature and pH on the stability of the antioxidant activity of polysaccharides from black quinoa were investigated. The results showed that the optimum extraction condition of the polysaccharides from black quinoa was ultrasonic extraction time of 30 min, ultrasonic extraction temperature of 60 ℃, and solid-liquid ratio of 1∶9 g/mL. The extraction rate of polysaccharides from black quinoa was 9.829 4%. The antioxidant activity of polysaccharides was determined by four methods, it showed that the higher the purity of the polysaccharide, the stronger the antioxidant activity. The stability of the antioxidant activity of the black quinoa polysaccharide changed significantly under the influence of temperature. The higher the temperature, the longer the heating time, and the lower the stability. The antioxidative stability was better under neutral or partial acid conditions. In conclusion, the black quinoa polysaccharide had significant antioxidant activity, and its stability was affected by temperature and pH.
Key words: black quinoa; polysaccharide; extraction process; antioxidation; stability
藜麥(Chenopodium quinoa Willd.)是莧科藜屬一年生雙子葉草本植物,又稱藜谷、南美藜、昆諾阿藜等[1],原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈地區(qū),有5 000余年種植歷史[2]。由于其富含營養(yǎng)物質(zhì),在歷史上被人們稱為“黃金谷物”,并稱之為“神圣的食物”[3]。中國在甘肅、山西、青海、內(nèi)蒙古等地推廣種植,且產(chǎn)量不斷提高,據(jù)統(tǒng)計,中國藜麥總產(chǎn)量達2.88萬t,約占世界總產(chǎn)量的15%[4]。
多糖類化合物是由單糖基通過苷鍵連接形成的一類高分子聚合物,廣泛存在于動物細胞膜及植物細胞壁中。已知的各類植物及微生物多糖具有豐富的生物活性,如抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等,部分已開發(fā)為臨床中常用的免疫調(diào)節(jié)劑,如香菇多糖、黃芪多糖等,具有較好的臨床療效[5, 6]。藜麥多糖具有顯著的抗氧化活性[7,8],可抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性,從而改善體內(nèi)血糖水平[9,10],此外還具有降血脂[11]、調(diào)節(jié)免疫活性[12]等藥理作用。藜麥種類繁多,根據(jù)顏色不同可分為白藜麥、紅藜麥、黑藜麥,研究表明藜麥粒色越深其抗氧化性越強[13]。本研究采用超聲輔助提取黑藜麥多糖,通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化提取工藝,并測定其抗氧化活性及穩(wěn)定性,為后續(xù)研究及生產(chǎn)開發(fā)提供參考。
1 材料與方法
1.1 試驗材料及儀器
1.1.1 材料與試劑 材料:黑藜麥,購于山西億龍藜麥有限公司。
試劑:無水乙醇;5%苯酚(現(xiàn)配現(xiàn)用);98%濃硫酸;葡萄糖標準品;維生素C標準品(抗壞血酸),中國中醫(yī)藥集團有限公司;抗氧化試劑盒(總抗氧化、羥自由基清除能力),蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。
1.1.2 試驗儀器 TU-1810型紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;AUW120型電子天平,艾德姆衡器有限公司; DP-360型超聲波提取器,北京亞歐德鵬科技有限公司; KDC-40型低速離心機,江蘇省金壇市恒豐儀器制造有限公司;RE-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上??怖x器設(shè)備有限公司。
1.2 試驗方法
1.2.1 黑藜麥多糖的提取 工藝流程:粉碎→過篩→稱量→加入適量的去離子水→超聲提取→離心→濃縮→加無水乙醇,過夜沉淀→離心→干燥→多糖粗品。
1.2.2 黑藜麥多糖的含量測定 在490 nm的波長下,采用硫酸-苯酚法測定多糖的吸光度,參考文獻[14]繪制葡萄糖標準曲線,得到的一次回歸方程為y=6.712 3x+0.144 9,R2=0.996 3,葡萄糖濃度在0.01~0.10 mg/mL范圍內(nèi)試驗結(jié)果有效。多糖提取率按下列公式計算。
式中,Y表示多糖提取率(%);C表示多糖濃度(mg/mL);D表示樣品定容后的溶液體積(mL);W表示藜麥粉末的質(zhì)量(mg)。
1.2.3 單因素試驗 根據(jù)“1.2.1”,在超聲波功率為120 W的條件下,設(shè)計單因素試驗。選取料液比1∶10 g/mL、提取溫度60 ℃,考察提取時間10、20、30、40、50 min對黑藜麥多糖提取率的影響;選取料液比1∶10 g/mL、提取時間30 min,考察提取溫度40、50、60、70、80 ℃對黑藜麥多糖提取率的影響;選取提取溫度60 ℃、提取時間30 min,考察料液比1∶6、" 1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL對黑藜麥多糖提取率的影響。
1.2.4 響應(yīng)面試驗 以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ),利用Design-Expert 8. 0. 6軟件設(shè)計3因素3水平試驗,構(gòu)建數(shù)據(jù)模型,并得到最佳理論參數(shù)值,根據(jù)該結(jié)果對提取工藝進行優(yōu)化設(shè)計。
1.2.5 黑藜麥多糖抗氧化活性測定 以響應(yīng)面設(shè)計得到粗多糖(樣品Ⅰ),取20 mL 5 mg/mL樣品Ⅰ溶液,經(jīng)5%醋酸鉛溶液(0.1 mL)脫蛋白(樣品Ⅱ),再經(jīng)大孔吸附樹脂脫色(HPD100型,樣品Ⅱ溶液濃度為6 mg/mL,樹脂用量為12.5%,糖液pH為5.4,脫色時間為150 min),得到純化后的多糖(樣品Ⅲ)[15]。
參考文獻[16,17]的方法,將3種樣品用去離子水配制成12 mg/mL的溶液,依次稀釋1、2、3、4、5倍。以維生素C為陽性對照,用無水乙醇配制一定濃度的DPPH和ABTS+自由基溶液,通過不同反應(yīng)后,在不同條件下測定吸光度,經(jīng)計算得出DPPH和ABTS+自由基清除率。
式中,A0表示空白對照的吸光度;Ai表示樣品溶液與自由基溶液反應(yīng)后溶液的吸光度;Aj表示樣品溶液和無水乙醇混合液的吸光度。
式中,Ai表示樣品溶液與自由基溶液反應(yīng)后溶液的吸光度;Aj表示樣品溶液和無水乙醇混合液的吸光度。
將多糖樣品配制成6 mg/mL的溶液,稀釋不同倍數(shù),以維生素C為陽性對照,通過抗氧化試劑盒測定3種樣品的總抗氧化活性和羥自由基清除能力[18]。通過公式計算樣品的總抗氧化活性和羥自由基清除能力。
總抗氧化能力=(△A-0.064 5)÷0.630 8×V反總÷V樣" " " (4)
式中,△A表示測定組與空白組在波長593 nm處吸光度的差值;V反總表示反應(yīng)總體積(mL);V樣表示反應(yīng)中樣品體積(mL)。
羥自由基清除率 =[OD測定管-OD對照管OD空白管-OD對照管×100%]
式中,OD測定管表示樣品在波長為536 nm處的吸光度;OD對照管表示對照組在波長為536 nm處的吸光度;OD空白管表示空白組在波長為536 nm處的吸光度。
1.2.6 黑藜麥多糖的抗氧化穩(wěn)定性研究 根據(jù)“1.2.5”的試驗結(jié)果選取抗氧化性最優(yōu)的樣品,將樣品配制成3 mg/mL多糖溶液,分別測定在不同水浴溫度(5、30、50、70、90 ℃)和不同pH(3、5、7、9、11、13)的總抗氧化能力。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素試驗結(jié)果
2.1.1 提取時間對多糖提取率的影響 由圖1可知,當提取時間在30 min時,黑藜麥多糖提取率最大;在10~30 min時,黑藜麥多糖提取率隨時間的增加而增加;當提取時間長于 30 min時,黑藜麥多糖提取率沒有出現(xiàn)增加現(xiàn)象。這是由于短時間的超聲作用,使其溶出物相對較少,從而提取率較低,超聲波對細胞膜的破裂程度與其作用時間為正比關(guān)系,因此溶出物不斷增加,從而提取率也提高,但當超聲作用時間過長時,雜質(zhì)也隨著細胞壁的不斷破裂相繼涌現(xiàn)出來,因此多糖提取率沒有隨著時間的增加持續(xù)增加[19]。因此,為使黑藜麥多糖提取率達到最大值,可將超聲提取時間選擇為30 min。
2.1.2 提取溫度對多糖提取率的影響 由圖2可知,當提取溫度從40 ℃開始上升時,黑藜麥多糖提取率呈上升的趨勢,當溫度持續(xù)上升達到60 ℃時,此時黑藜麥多糖提取率達到最大值,當提取溫度超過60 ℃時,黑藜麥多糖提取率沒有繼續(xù)增加反而開始出現(xiàn)下降的趨勢。這是由于當溫度適中時,多糖的溶出隨水分蒸發(fā)的增多而增多,溫度過高時多糖發(fā)生降解反應(yīng),導致提取率出現(xiàn)下降趨勢[20]。因此,為使黑藜麥多糖提取率達到最大值,可將提取溫度選擇為60 ℃。
2.1.3 料液比對多糖提取率的影響 由圖3可知,當料液比在1∶6~1∶10 g/mL時,黑藜麥多糖提取率隨溶劑的增加出現(xiàn)上升的趨勢;當料液比在1∶10~" 1∶14 g/mL時,多糖提取率并沒有隨溶劑的增加而增加,反而出現(xiàn)下降的趨勢。多糖提取率的最大值出現(xiàn)在料液比為1∶10 g/mL的條件。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是,小溶劑量不能使黑藜麥多糖完全溶出;大溶劑量時,由于超聲波輻射被溶劑大量吸收,使其不能完全作用于黑藜麥,從而影響多糖提取[21]。因此,綜合以上分析,為使黑藜麥多糖提取率達到最大值,可將料液比選擇為1∶10 g/mL。
2.2 響應(yīng)面法對黑藜麥多糖提取工藝的優(yōu)化結(jié)果
2.2.1 響應(yīng)面數(shù)值分析結(jié)果 響應(yīng)面軟件通過3因素3水平的編碼表(表1),設(shè)計出對提取工藝的優(yōu)化方案,共有17組試驗(表2)。試驗結(jié)果如下,其中X1表示提取時間;X2表示提取溫度;X3表示料液比,Y表示多糖提取率。
通過響應(yīng)面法獲得多項式回歸方程為:
[Y=9.69+0.22X1+0.53X2-1.20X3-1.77X1X2-1.24X1X3+0.65X2X3-1.89X23-3.22X21-1.69X22]" " "(6)
對該數(shù)學模型進行全面分析,方差分析結(jié)果見表3。多項式回歸方程模型P小于0.05,表明模型顯著。失擬項呈不顯著,模型可信度高。決定系數(shù)R2為0.983 5,調(diào)整系數(shù)為0.962 2,表明模型可解釋度高。除提取時間對響應(yīng)值的影響不顯著外,其余各項均表現(xiàn)為顯著,各因素影響程度排序為料液比gt;提取溫度gt;提取時間。
2.2.2 各因素交互作用分析
1)提取時間與提取溫度的交互作用。由圖4可知,多糖提取率隨著提取時間和提取溫度的增加而呈逐步上升的趨勢,隨后黑藜麥多糖提取率又開始下降。根據(jù)三維曲面圖可得,提取溫度的坡面比提取時間的坡面陡,則表明黑藜麥多糖提取率受提取溫度的影響大于受提取時間的影響。等高線橢圓程度較大,說明提取溫度和提取時間的交互作用顯著。當提取時間在30~40 min且提取溫度在60~70 ℃時,黑藜麥中多糖的提取量為最大。該區(qū)間即為最佳工藝參數(shù)區(qū)間。
2)提取時間與料液比的交互作用。由圖4可知,在一定的提取溫度條件下,當料液比和提取時間不斷增加時,黑藜麥多糖提取率由上坡的趨勢轉(zhuǎn)變?yōu)橄缕碌内厔?。通過對曲面圖的坡度進行比較,料液比的坡度要平于提取時間,得出料液比的二次項作用要優(yōu)于提取時間。等高線橢圓程度較大,說明料液比和提取時間的交互作用顯著。當最佳料液比參數(shù)范圍為1∶9~1∶11 g/mL,最佳提取時間范圍為30~40 min時,提取率的數(shù)值最大。
3)提取溫度與料液比的交互作用。由圖4可知,提取時間條件不變,隨著料液比以及提取溫度的增加,多糖提取率隨之呈先緩慢上升再逐漸下降的趨勢。由三維曲面圖可知,料液比坡面的變化程度比提取溫度大,說明料液比對多糖提取率的影響大于提取溫度。等高線橢圓程度較大,說明料液比和提取溫度的交互作用顯著。最佳提取溫度區(qū)間為55~65 ℃,料液比區(qū)間為1∶8~1∶10 g/mL,在這個區(qū)間內(nèi)黑藜麥中多糖的提取量為最大。該區(qū)間即為最佳工藝參數(shù)區(qū)間。
由響應(yīng)面法得到的優(yōu)化方案為提取時間30.86 min、提取溫度60.48 ℃、料液比1∶9.33 g/mL。在該提取條件下,黑藜麥多糖提取率的理論值為9.916 1%。為確保提取工藝的切實性,對該優(yōu)化方案進行修正,修正后的試驗方案為提取時間30 min,提取溫度60 ℃,料液比1∶9 g/mL。在修正后的條件下進行放大3倍的驗證試驗。試驗后通過計算,得出黑藜麥多糖的平均提取率為9.829 4%,接近理論值,確保了此方法的合理性。
2.3 黑藜麥多糖抗氧化活性及其穩(wěn)定性研究結(jié)果
2.3.1 黑藜麥多糖抗氧化活性研究結(jié)果 通過4種方法測定3種樣品多糖的抗氧化活性。由圖5可知,3種樣品的抗氧化性均與其濃度成正比,同一濃度下,抗氧化活性大小表現(xiàn)為樣品Ⅲgt;樣品Ⅱgt;樣品Ⅰ,說明多糖純度越高其抗氧化性越強,當樣品Ⅲ多糖濃度為6 mg/mL時,其DPPH自由基清除率為88.7%,ABTS+清除率為95.7%;當樣品Ⅲ多糖濃度為1.50 mg/mL時,其總抗氧化活性為90.15 U/mL,羥自由基清除率為94.65%,均小于同一濃度下維生素C的抗氧化活性。
2.3.2 黑藜麥多糖抗氧化活性穩(wěn)定性研究結(jié)果 由圖6可知,不同溫度下,隨加熱時間的增加黑藜麥多糖總抗氧化能力呈下降趨勢。當溫度為30 ℃時,在2~4 h內(nèi)黑藜麥多糖抗氧化活性出現(xiàn)先升高后下降的趨勢,總體呈下降趨勢。加熱時間在1 h內(nèi),黑藜麥多糖總抗氧化能力在5 ℃溫度中下降趨勢較緩慢,其余溫度下,其總抗氧化能力急劇下降。在溫度為90 ℃,加熱時間為5 h時,其總抗氧化能力接近于0。結(jié)果表明,溫度對黑藜麥多糖總抗氧化能力的影響較為顯著,溫度越高,加熱時間越長,抗氧化活性越低,溫度的變化可引起多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[22]。
由圖7可知,黑藜麥多糖的總抗氧化能力隨pH的增加,其穩(wěn)定性呈下降趨勢,在pHlt;7范圍內(nèi),總抗氧化能力的減小幅度不大,說明黑藜麥多糖在偏酸性或中性的條件下貯存可減少其抗氧化活性的降低。
3 小結(jié)與討論
通過響應(yīng)面設(shè)計,利用超聲輔助法(功率為120 W)優(yōu)化黑藜麥多糖的提取工藝,最佳工藝為提取時間30 min,提取溫度60 ℃,料液比1∶9 g/mL,得到黑藜麥多糖的提取率為9.829 4%;通過4種方法測定多糖的抗氧化活性,表明多糖純度越高其抗氧化性越強;黑藜麥多糖抗氧化性的穩(wěn)定性受溫度的影響變化顯著,溫度越高,加熱時間越長,穩(wěn)定性越低,酸堿度在中性或偏酸性條件下穩(wěn)定性較好。
隨著研究的進展,藜麥多糖在體外及動物模型中均表現(xiàn)出良好的生物活性,關(guān)于黑藜麥多糖的抗氧化活性的研究較少且不全面,試驗將粗黑藜麥多糖進一步純化,較全面地測定其抗氧化活性,且對其抗氧化活性的穩(wěn)定性從貯存的角度進行進一步分析。藜麥種子作為人們?nèi)粘J秤玫墓任镏?,其多糖類成分是否能在人體營養(yǎng)物質(zhì)代謝中發(fā)揮作用亟待研究,如何更好地利用其營養(yǎng)價值,使其作為人們健康生活的重要飲食組分進入食譜具有重要的研究前景和研究意義。
參考文獻:
[1] 張亞萍, 王致和, 張秀華, 等. 14個藜麥品種(系)在祁連山區(qū)的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)及其與產(chǎn)量的關(guān)系分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學, 2021, 53(8): 17-21.
[2] 劉月瑤, 路 飛, 高雨晴, 等. 藜麥的營養(yǎng)價值、功能特性及其制品研究進展[J]. 包裝工程, 2020, 41(5): 56-65.
[3] 胡一晨, 趙 鋼, 秦培友, 等. 藜麥活性成分研究進展[J]. 作物學報, 2018, 44(11): 1579-1591.
[4] 郭慧敏, 耿艷樓, 呂 瑋, 等. 藜麥開發(fā)利用研究進展[J]. 糧食與油脂, 2021, 34(3): 9-11.
[5] 張亞坤, 王金榮, 黃 進, 等. 多糖的磷酸化修飾及其生物活性研究進展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報,2021,12(20):8172-8177.
[6] 姜 浩, 孫 濤, 姚皓昱, 等. 食用真菌多糖的研究進展[J].食品工業(yè)科技,2022,43(12):447-456.
[7] 李佳妮, 白寶清, 金曉第, 等. 酶解超聲波協(xié)同提取藜麥多糖及體外活性評價[J]. 食品研究與開發(fā), 2019, 40(8): 57-64.
[8] 林冰潔, 毛肇潔, 余 遠, 等. 藜麥麩皮多糖的提取及理化性質(zhì)和活性研究[J]. 食品科技, 2021, 46(8): 171-178.
[9] 張 亮,張愛婧,孫 宇. 不同粒色藜麥多糖的超聲輔助酶解提取工藝的優(yōu)化及其體外活性比較[J]. 中國食品添加劑, 2021, 32(6):15-23.
[10] TAN M H, CHANG S L, LIU J N, et al. Physicochemical properties, antioxidant and antidiabetic activities of polysaccharides from quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) seeds[J]. Molecules, 2020, 25(17): 3840-3857.
[11] CAO Y N, ZOU L, LI W, et al. Dietary quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) polysaccharides ameliorate high-fat diet-induced hyperlipidemia and modulate gut microbiota[J]. International journal of biological macromolecules, 2020, 163: 55-65.
[12] FAN S H, LI J N, BAI B Q. Purification, structural elucidation and in vivo immunity-enhancing activity of polysaccharides from quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) seeds[J]. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 2019, 83(12): 2334-2344.
[13] 陳銀煥,楊修仕,郭慧敏,等.不同品種藜麥粉對饅頭品質(zhì)及抗氧化活性的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2020,46(2): 157-164.
[14] 鄭姍姍.玉米須中多糖及黃酮類成分的提取與抗氧化活性分析[J].中國民族民間醫(yī)藥,2017,26(16):33-36.
[15] 呂 鑫,顧志榮,祁 梅,等.鎖陽多糖的提取及純化工藝[J].中國野生植物資源,2022,41(4):34-43.
[16] 許海燕,王 珊,彭修娟,等. 多指標優(yōu)選地黃提取工藝及抗氧化活性研究[J].中國野生植物資源,2022,41(9):18-23.
[17] 侯敏娜,侯少平,胡亞茹,等.蒙古黃芪多糖和皂苷共提工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究[J].中國食品添加劑,2022,33(6):16-23.
[18] 侯少平,張海龍.鄂藥砍戶達正丁醇萃取層物質(zhì)的抗氧化活性研究[J].陜西農(nóng)業(yè)科學,2018,64(12):37-39.
[19] 郭 怡,楊 璇,肖 萍.響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥多糖提取工藝條件[J].天津農(nóng)學院學報,2020,27(4):43-48,77.
[20] 張占軍,王富花,葛 洪,等.響應(yīng)面法優(yōu)化百合多糖超聲輔助提取工藝[J].食品研究與開發(fā),2017,38(18):40-44.
[21] 蔣玉蓉,袁俊杰,孫雪婷,等. 藜麥葉片多糖最佳提取工藝及抗氧化性研究[J].中國食品學報,2017,17(2):110-118.
[22] 隋亞君. 桃金娘多糖的分離純化及其化學結(jié)構(gòu)研究[D].南寧: 廣西大學, 2006.
收稿日期:2023-02-20
基金項目:國家科技部重大新藥創(chuàng)制項目(2018ZX09721-005-009-013);陜西國際商貿(mào)學院中藥質(zhì)量標志物創(chuàng)新團隊(SSY18TD02)
作者簡介:楊 敏(1986-),女,陜西咸陽人,實驗師,主要從事中藥制藥及成分分析研究,(電話)18091041916(電子信箱)375477274@qq.com;通信作者,奚軍偉(1979-),男,陜西大荔人,副主任藥師,主要從事中藥制藥及藥品不良反應(yīng)研究,(電話)13575571093(電子信箱)315948175@qq.com。