基于網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術分析核桃治療高尿酸血癥的作用機制

摘要：基于網(wǎng)絡藥理學方法及分子對接技術分析核桃（Juglans regia L.）治療高尿酸血癥（Hyperuricemia， HUA）的作用機制，利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）預測核桃活性成分的作用靶點，運用OMIM、GeneCards和DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索HUA疾病靶點。使用Cytoscape 3.7.2軟件進行作用靶點-活性成分-疾病網(wǎng)絡繪制，利用Metascape平臺進行富集分析。使用AutoDockTools 1.5.6軟件進行分子對接，對活性成分及重要靶點的結合度進行驗證。結果表明，共篩選出核桃活性成分5種，與HUA有交集靶點16個；富集程度較高的信號通路包括癌癥信號通路、化學致癌-受體激活信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號通路和卡波西肉瘤相關皰疹病毒信號通路；通過分子對接驗證試驗可知，核桃中主要活性成分與重要靶點結合緊密。

關鍵詞：高尿酸血癥； 網(wǎng)絡藥理學； 分子對接技術； 核桃（Juglans regia L.）； 鞣花酸；作用機制

中圖分類號：R285.5" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）08-0120-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.08.019 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Analysis of the mechanism of walnut therapy for hyperuricemia based on network pharmacology and molecular docking technology

XU Dong-yue， ZHAO Sheng-lan

（College of Traditional Chinese Medicine， Yunnan University of Chinese Medicine，Kunming" 650500，China）

Abstract： Based on network pharmacology and molecular docking， the mechanism of action of Juglans regia L. in the treatment of Hyperuricemia （HUA） was analyzed， and the Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform （TCMSP） was used to predict the target of active components in walnut. OMIM， GeneCards and DrugBank databases were used to search for HUA disease targets. Cytoscape 3.7.2 software was used for target-active ingredient-disease network mapping， and Metascape platform was used for enrichment analysis. Molecular docking was performed using AutoDockTools 1.5.6 software to verify the binding degree of active ingredients and important targets. The results showed that 5 active compounds of walnut were selected， and 16 common targets of walnut and HUA were identified. The highly enriched signaling pathways include cancer signaling pathway， chemical carcinogenic-receptor activation signaling pathway， advanced glycation endproducts receptor for advanced glycation end products signaling pathway in diabetic complications， and Kaposi sarcoma-associated herpes virus signaling pathway. The molecular docking test showed that the main active compounds in the walnut were closely bound to important targets.

Key words： hyperuricemia； network pharmacology； molecular docking technology； walnut（Juglans regia L.）； ellagic acid； mechanism

高尿酸血癥（HUA）是一種嘌呤代謝增加、血中尿酸含量增加、單鈉尿酸鹽結晶沉積關節(jié)的代謝性疾?。?］。HUA患者會出現(xiàn)痛風性關節(jié)炎、間質性腎炎和痛風石［2］等一系列關節(jié)性疾病。有研究表明，HUA患者的數(shù)量正逐年上升，并趨于年輕化［3］。核桃（Juglans regia L.）是中國傳統(tǒng)的醫(yī)食兩用佳品，其性甘溫，生熟皆可食［2，3］?，F(xiàn)代藥理研究證實核桃含有豐富的黃酮類、酚類等多種化學成分［4］，其中針對黃酮類降尿酸的研究較廣泛。鄔文艾琳等［5］利用高尿酸血癥模型小鼠探討山核桃葉總黃酮對NLRP3炎性信號表達的影響，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，山核桃葉總黃酮高劑量組的促炎性細胞因子IL-1β和IL-18的水平顯著降低，腎臟組織NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白相對表達量均顯著降低，所以山核桃葉總黃酮可以降低炎性因子的表達，減輕炎癥反應。蔡孟森［6］以熱榨核桃粕為研究對象，發(fā)現(xiàn)其提取產(chǎn)物具有一定的降尿酸活性。因此，本研究通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接分析核桃治療HUA的活性成分及作用靶點，以期為核桃藥用開發(fā)提供科學依據(jù)，也為HUA防治提供更多思路。

1 材料與方法

1.1 核桃活性成分及作用靶點篩選

在TCMSP（http：//tcmspw.com/）中根據(jù)口服生物利用度（OB）≥15%和類藥性（DL）≥0.18檢索核桃活性成分。將篩選得到的活性成分導入TCMSP進行靶點預測，并利用化源網(wǎng)、PubChem數(shù)據(jù)庫和Swiss數(shù)據(jù)庫對活性成分進行格式轉換，進而總結作用靶點。最后將TCMSP和Swiss數(shù)據(jù)庫中獲得的靶點去重后取并集。

1.2 HUA靶點篩選

利用GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）和DrugBank［7］（https：//www.drugbank.com/），以“Hyperuricemia”為關鍵詞進行檢索，將獲得的疾病靶點去重后取并集。

1.3 核桃治療HUA潛在作用靶點篩選

將核桃活性成分的作用靶點與HUA疾病靶點使用微生信在線作圖網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進行交集分析，可獲得核桃作用于HUA的交集靶點，即為核桃治療HUA的潛在作用靶點。

1.4 交集靶點網(wǎng)絡圖繪制

利用Cytoscape 3.7.2軟件將“1.3”中得到的交集靶點進行網(wǎng)絡分析，得到作用靶點-活性成分-疾病網(wǎng)絡。

1.5 蛋白質互作網(wǎng)絡繪制

將核桃治療HUA的潛在作用靶點導入STRING在線分析平臺［8］（https：//string-db.org/），進行蛋白質相互作用分析，分析數(shù)據(jù)導入到Cystoscape 3.7.2軟件繪制蛋白質互作網(wǎng)絡（Protein-Protein Interaction Networks，PPI）分析網(wǎng)絡。

1.6 富集分析

利用Metascape（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）對篩選的交集靶點進行KEGG及GO富集分析，將分析數(shù)據(jù)導入ImageGP（http：//www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/GOenrichmentplot.html）和GraphPad Prism 8.0軟件進行富集分析圖的繪制。

1.7 分子對接分析

將關鍵靶點導入RCSB PDB數(shù)據(jù)庫，將靶點分子結構下載為PDB文件，之后導入PyMOL軟件。查找關鍵靶點對應的活性成分，并在PubChem數(shù)據(jù)庫下載活性成分2D結構，利用Chem 3D軟件進行結構優(yōu)化。將靶點蛋白質及優(yōu)化過的活性成分依次導入AutoDockTools 1.5.6軟件進行分子對接分析，利用PyMOL軟件進行可視化分析。

2 結果與分析

2.1 核桃活性成分及作用靶點

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索到13種核桃活性成分（表1）。在TCMSP和Swiss數(shù)據(jù)庫中篩選出247個作用靶點。

2.2 HUA靶點

在GeneCards、OMIM和DrugBank數(shù)據(jù)庫中以“Hyperuricemia”為關鍵詞進行檢索，獲得224個HUA疾病靶點。

2.3 核桃治療HUA潛在作用靶點

將核桃活性成分的247個作用靶點與HUA的224個疾病靶點進行交集分析后得到16個交集靶點（圖1），即核桃治療HUA的潛在作用靶點有16個（表2），包括雄激素受體、鈣蛋白酶1抗體、白細胞介素-8等。

2.4 交集靶點網(wǎng)絡繪制

將核桃活性成分、交集靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件后，得作用靶點-活性成分-疾病網(wǎng)絡（圖2），只有5個成分的16個靶點與HUA疾病的靶點交集。其中，交集靶點較多的成分依次是ellagic acid（鞣花酸，7個）、 9，10-methylene octadecanoate（9，10-亞甲基十八烷酸酯，6個）、methyl 8-［（1R，2S）-2-octylcyclopropyl］ octanoate（8-［（1R，2S）-2-辛基環(huán)丙基］辛酸甲酯，6個）、2，2′，3，3′，4，4′-Tetramethoxy -6，6′-biphenyldicarboxylic acid， dimethyl ester（2，2′，3，3′，4，4′-四甲氧基-6，6′-聯(lián)苯二甲酸二甲酯，4個）。受多成分作用的靶點依次是AR（3）、JAK2（3）、FABP2（2）、SLC22A6（2）、PPARA（2）、P2RX3（2），見圖2。

2.5 蛋白質互作網(wǎng)絡

將核桃治療HUA的16個潛在作用靶點導入STRING平臺進行蛋白質相互作用分析，設置置信度大于0.4并隱藏無相互作用的蛋白質，網(wǎng)絡分析數(shù)據(jù)結果導入到Cystoscape 3.7.2 軟件繪制PPI網(wǎng)絡（圖3）。網(wǎng)絡包括9個節(jié)點和11條邊，每個節(jié)點代表單個蛋白質靶點，邊代表蛋白質之間的相互作用關系，節(jié)點越大，即度值越大，對應顏色飽和度越高；線條粗細表明靶點之間相互作用關系的強弱，連接越強，線條越粗。因此，核桃作用于HUA的主要靶點包括血管內皮生長因子A（VEGFA）、白細胞介素-8（CXCL8）、RELA基因、雄激素受體（AR）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）和酪氨酸蛋白激酶（JAK2）等。

2.6 富集分析

在Metascape分析網(wǎng)站中將交集靶點進行富集分析，KEGG富集分析包括50條通路，取富集程度最高的前10條通路繪制成氣泡圖（圖4）。KEGG通路富集分析顯示，核桃的關鍵基因靶點主要富集的通路為癌癥信號通路（Hsa05200：Pathways in cancer）、化學致癌-受體激活（Hsa05207：Chemical carcinogenesis-receptor activation）信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（Hsa04933： AGEs-RAGE signaling pathway in diabetic complications）信號通路和卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染（Hsa05167：Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）信號通路。

GO富集分析集中于分子功能（MF）、生物過程（BP）和細胞成分（CC）（圖5）。分子功能方面，主要與轉錄共激活因子（Transcription coactivator binding）、轉錄共調控子（Transcription coregulator binding）、細胞因子受體（Cytokine receptor binding）和蛋白質結構域特異性（Protein homodimerization activity）結合有關。生物過程方面，主要與腺體發(fā)育（Gland development）、MAPK級聯(lián)信號系統(tǒng)正調節(jié)（Positive regulation of MAPK cascade）、細胞對脂質（Cellular response to lipid）和有機環(huán)狀化合物（Cellular response to organie cyclie compound）的反應有關。細胞成分方面主要與質膜筏（Caveolat）、薄膜筏（Plasma membrane raft）、膜微結構域（Membrane raft）和受體復合體（Membrane microdomain）有關。

2.7 分子對接分析

取關鍵靶點中度值≥4的靶點蛋白質進行分子對接，對接結果見圖6。有研究指出，分子對接結果結合能越小，活性成分與蛋白質之間的聯(lián)系越穩(wěn)定［9］。

由表1可以看出，成分MOL001002為鞣花酸，成分MOL009104為glansreginin A，與VEGFA和RELA之間結合牢固；成分MOL009102為gemin D，與選取的6種關鍵靶點均具有高結合親和力；選取活性成分鞣花酸和glansreginin A分別與關鍵靶點VEGFA和RELA將分子對接進行可視化分析。

分子對接可視化如圖7所示，成分鞣花酸與靶點VEGFA和RELA結合牢固，成分glansreginin A與靶點VEGFA和RELA結合牢固。

3 討論

核桃是胡桃科胡桃屬植物［10］，含有豐富的蛋白質，并含有人體必需的鈣、磷、鐵等多種微量元素。周麗莎等［11］利用核桃仁提取物治療阿爾茨海默病模型大鼠，觀察大鼠體內促炎細胞因子白介素IL-1、IL-6的含量變化。結果顯示，核桃仁提取物在試驗中均能明顯降低AD模型大鼠體內IL-1、IL-6的含量。黎青勇［12］針對脫脂核桃粉進行一系列試驗，發(fā)現(xiàn)脫脂核桃蛋白酶解物（WMH）和脫脂脫酚核桃蛋白酶解物（DWMH）均具有體內降尿酸功效，并且DWMH在體外降尿酸、體內黃嘌呤氧化酶抑制、降低尿素氮和肌酐含量方面的效果更好。因此從食療角度出發(fā)，可以選取核桃為原料開發(fā)降尿酸性功能食品基料，本研究利用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，篩選核桃活性成分，推測核桃治療HUA的潛在作用靶點，有助于闡明核桃治療HUA的作用機制，為HUA的治療提供更多的科學依據(jù)。

分析結果顯示，核桃治療HUA的重要靶點主要包括VEGFA、CXCL8、RELA、AR和PPARA。VEGFA是一種在血管生成和內皮細胞生長中具有活性的生長因子，不但能誘導內皮細胞增殖［13］、促進細胞遷移，而且能增加血管通透性，從而促進炎癥反應的產(chǎn)生［14］。有研究表明血清VEGF水平與關節(jié)炎癥反應呈正相關，并且痛風性關節(jié)炎的部分藥物治療與抑制血清VEGF表達相關［15］。CXCL8即IL-8，是一種趨化因子，參與中性粒細胞活化并響應炎癥刺激［16］。CXCL8既能誘發(fā)炎癥反應，又能促進炎癥作用持續(xù)不斷［17］。對于高尿酸患者，當關節(jié)周圍沉積過多尿酸鈉結晶時，CXCL8因刺激而大量釋放，誘導白細胞趨化運動，促進中性粒細胞聚集、活化，從而造成局部血管通透性增加、炎癥反應的產(chǎn)生［18］。在高尿酸血癥患者高表達中，炎性因子與血尿酸水平呈正相關［19］。

KEGG通路富集分析顯示，核桃關鍵基因靶點的主要富集通路與癌癥信號通路、化學致癌-受體激活信號通路、AGEs-RAGE信號通路和卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路有關。AGEs-RAGE信號通路，RAGE是AGEs的主要受體，稱為晚期糖基化終產(chǎn)物受體，屬于免疫球蛋白超家族。AGEs-RAGE信號通路激活NF-kappa B［20］，促使機體釋放大量生長因子、促炎性因子IL-1［21］等。同時腎小管上皮細胞受到刺激，導致TGF-β和VEGF的產(chǎn)生［22］，促使腎小管間質纖維化、腎組織異常增生，導致腎小球損傷［23］。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，核桃治療HUA的生物過程主要與腺體發(fā)育、MAPK級聯(lián)信號系統(tǒng)正調節(jié)、細胞對脂質和有機環(huán)狀化合物的反應有關。MAPK級聯(lián)［24］激活是多種信號通路的中心，在許多細胞增殖相關信號通路中具有關鍵作用。當受到生長因子刺激后，處于靜止狀態(tài)的MAPK接收活化信號而被激活，表現(xiàn)為逐級磷酸化［25］，參與細胞對環(huán)境的應激適應及炎癥反應等多種重要的病理生理過程。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡藥理學對核桃治療HUA的作用靶點及信號通路進行預測，并結合分子對接技術驗證結果。結果發(fā)現(xiàn)，核桃有一定的抗高尿酸血癥作用，核桃可能通過鞣花酸、gemin D等多種成分作用于VEGFA、CXCL8、RELA等多靶點并結合多條通路改善炎癥反應，從而減輕HUA癥狀，這為日后核桃藥用開發(fā)提供了更多的科學依據(jù)，也為HUA的臨床治療提供了更多思路。

參考文獻：

［1］ REMEDIOS C，SHAH M，BHASKER A G，et al. Hyperuricemia： A reality in the Indian obese［J］.Obes Surg， 2012，22（6）：945-948.

［2］ 吳源陶，鄒譯嫻，張春虎，等.基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接探討四妙丸治療痛風的分子機制［J］.中南藥學， 2020，18（7）：1120-1126.

［3］ 朱 賀.不同劑量非布司他聯(lián)合依托考昔、別嘌呤醇對高尿酸血癥合并痛風患者的療效比較［J］.中國醫(yī)學創(chuàng)新，2021，18（34）：52-55.

［4］ 史金鳳，林玉萍，陳朝銀，等.核桃仁酚性成分及其生物活性研究進展［J］.中成藥，2018，40（6）：1360-1364.

［5］ 鄔文艾琳，張 杰，陳偉圣，等.基于NLRP3炎癥信號通路探討山核桃葉總黃酮抗高尿酸血癥作用機制研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2019，29（13）：1543-1546，1550.

［6］ 蔡孟森.熱榨核桃粕的綜合利用［D］.廣州：華南理工大學，2015.

［7］ FU X L，CONG H F，ZHAO S Y，et al. Construction of glycometabolism-and hormone-related lncRNA-mediated feedforward loop networks reveals global patterns of lncRNAs and drug repurposing in gestational diabetes［J］.Front endocrinol（Lausanne），2020，11：93.

［8］ SZKLARCZYK D，GABLE A L，NASTOU K C，et al. The STRING database in 2021：Customizable protein-protein networks， and functional characterization of user-uploaded gene/measurement sets［J］.Nucleic Acids Res，2021，49（D1）：D605-D612.

［9］ KUN-YI H，SAMIK G，HIROAKI K，et al.Combining machine learning systems and multiple docking simulation packages to improve docking prediction reliability for network pharmacology［J］.Plos one，2013，8（12）：e83922.

［10］ 張 亭，杜 倩，李 勇.核桃的營養(yǎng)成分及其保健功能的研究進展［J］.中國食物與營養(yǎng)，2018，24（7）：64-69.

［11］ 周麗莎，朱書秀，王小月.核桃仁提取物對老年癡呆模型大鼠IL-1、IL-6含量影響的實驗研究［J］.江漢大學學報（自然科學版），2012，40（1）：89-91.

［12］ 黎青勇.核桃源降尿酸肽靶向抑制黃嘌呤氧化酶活性的構效機制研究［D］.廣州：華南理工大學，2018.

［13］ SHEN K K，JI L L，LU B，et al. c-Jun N-terminal kinase mediated VEGFR2 sustained phosphorylation is critical for VEGFA-induced angiogenesis in vitro and in vivo［J］.Cell Biochem Biophys，2012，64：17-27.

［14］ ZHANG X T，ZOU G Y，LI X Y，et al. An isoflavone derivative potently inhibits the angiogenesis and progression of triple-negative breast cancer by targeting the MTA2/SerRS/VEGFA pathway［J］.Cancer Biol Med， 2020，17（3）：693-706.

［15］ 姜德友，劉 爽，韓潔茹，等.補腎利濕法對急性痛風性關節(jié)炎大鼠VEGF表達水平的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2013， 19（24）：236-239.

［16］ YUE D L，LIU S S，ZHANG T F，et al. NEDD9 promotes cancer stemness by recruiting myeloid-derived suppressor cells CXCL8 in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Cancer Biol Med，2021，18（3）：705-720.

［17］ ZHANG S Q，WANG L L，LI Y T，et al. MicroRNA-126 attenuates the effect of chemokine CXCL8 on proliferation， migration， apoptosis，and MAPK-dependent signaling activity of vascular endothelial cells cultured in a medium with high glucose concentration［J］.Bull Exp Biol Med，2021，171：202-207.

［18］ 何露露，武 媛，胡翊健，等.桂枝芍藥知母湯在痛風性關節(jié)炎的應用及對血清IL-8、TGF-β的影響［J］.中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2021，19（20）：75-77.

［19］ 鄭 紅，李旭東，王華國.促炎癥脂肪因子與高尿酸血癥相關性研究［J］.西部醫(yī)學，2014，26（10）：1374-1376.

［20］ 楊超茅，楊志新，馬曉玲. AGEs-RAGE信號通路在糖尿病腎病中的作用機制及中醫(yī)藥研究進展［J］.中醫(yī)學報，2019，34（9）：1864-1868.

［21］ ZHANG F X，HUANG X W，QI Y H，et al. Juglanin inhibits osteoclastogenesis in ovariectomized mice via the suppression of NF-κB signaling pathways［J］.Front Pharmacol，2020，11：596230.

［22］LIU F X，F(xiàn)U Y C，WEI C J，et al. The expression of GPR109A， NF-kB and IL-1β in peripheral blood leukocytes from patients with type 2 diabetes［J］.Ann Clin Lab Sci，2014，44：443-848.

［23］ OJIMA A，MATSUI T，NISHINO Y，et al. Empagliflozin， an inhibitor of sodium-glucose cotransporter 2 exerts anti-inflammatory and antifibrotic effects on experimental diabetic nephropathy partly by suppressing AGEs-receptor axis［J］.Horm Metab Res，2015，47（9）：686-692.

［24］ WU T，SHEN M Y，GUO X M，et al. Cyclocarya paliurus polysaccharide alleviates liver inflammation in mice via beneficial regulation of gut microbiota and TLR4/MAPK signaling pathways［J］.Int J Biol Macromol， 2020， 160：164-174.

［25］ LIAO Z H，ZHU H Q，CHEN Y Y，et al. The epigallocatechin gallate derivative Y inhibits human hepatocellular carcinoma by inhibiting angiogenesis in MAPK/ERK1/2 and PI3K/AKT/ HIF-1α/VEGF dependent pathways［J］.J Ethnopharmacol，2020，259：112852.

收稿日期：2022-05-23

基金項目：國家自然科學基金項目（81760735）；云南省生物醫(yī)藥重大專項（202002AA100005；202102AE09003）；云南省科技廳-云南中醫(yī)藥大學聯(lián)合專項重點項目（2019FF002-006）

作者簡介：徐冬月（1997-），女，吉林鎮(zhèn)賚人，在讀碩士研究生，研究方向為中藥資源開發(fā)與利用研究，（電話）13116229311（電子信箱）18721673507@163.com；通信作者，趙聲蘭（1962-），女，教授，碩士研究生導師，主要從事藥食資源研究與開發(fā)利用工作，（電子信箱）13330431529@163.com。