荷葉基質(zhì)靈芝發(fā)酵工藝優(yōu)化及活性成分測定

摘要：研究靈芝以荷葉為主要基質(zhì)的固態(tài)發(fā)酵工藝，并測定發(fā)酵前后活性成分的含量。通過單因素試驗和正交試驗，以生物量為檢測指標，考察水料比、碳源、氮源及荷葉規(guī)格4個因素對靈芝發(fā)酵的影響，得出最優(yōu)培養(yǎng)條件為：水料比3.0∶1，碳源（葡萄糖）10%，氮源（大豆蛋白）4%，七水合硫酸鎂0.1 g，磷酸二氫鉀0.15 g，荷葉規(guī)格40目，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時間12 d。發(fā)酵后基質(zhì)中的生物堿含量0.508%、多糖含量4.870%，靈芝酸含量0.720%，可溶性膳食纖維含量3.450%，不溶性膳食纖維含量9.020%，是一種功能食品的良好原料。

關鍵詞：靈芝；發(fā)酵工藝；荷葉；活性成分；正交試驗

中圖分類號：S567.3+1；TS205.5" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）08-0085-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.08.013 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Optimization of Ganoderma lucidum fermentation process with lotus leaf substrate and determination of active components

YANG Cong-fa，TANG Ben，QIN Qi，LUAN Li-ning，ZHU Yong-quan，DENG Xiang，LI Xiang

（School of Ocean Food and Biological Engineering， Jiangsu Ocean University， Lianyungangnbsp; 222005， Jiangsu， China）

Abstract：Ganoderma lucidum fermentation process with lotus leaf as the main substrate was studied and the content of active components before and after fermentation was determined. Biomass was selected as the detection index， and the effects of water material ratio， carbon source（glucose）， nitrogen source（soybean protein） and lotus leaf specification on Ganoderma lucidum fermentation were studied by single factor test and orthogonal test. The results showed that the optimal culture conditions of lotus leaf fermented by Ganoderma lucidum were as follows： water material ratio of 3.0∶1， carbon source（glucose） 10%， nitrogen source（soybean protein） 4%， magnesium sulfate heptahydrate 0.1 g， potassium dihydrogen phosphate 0.15 g， lotus leaf specification 40 mesh particle size， fermentation temperature 28 ℃， and fermentation time 12 d. After fermentation， the contents of active components in the substrate were alkaloid 0.508%， polysaccharide 4.870%， ganoderma acid 0.720%， soluble dietary fiber 3.450% and insoluble dietary fiber 9.020%， which was a good raw material for a functional food.

Key words： Ganoderma lucidum； fermentation process； lotus leaf； active components； orthogonal test

荷葉是蓮科蓮屬多年生草本挺水植物蓮荷（Lotus）的葉，被列入第二批“既是食品又是藥品”的名單之中［1］，在食用及藥用兩方面均有較廣泛的應用［2，3］。荷葉含有植物所共有的纖維素、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、單寧等常規(guī)化學成分［4］，除此之外還含有皂類、β-胡蘿卜素、黃酮［5］、維生素C、生物堿［6］等多種活性成分，具有明顯的生物活性和生理功能，不僅有活血化瘀［7］、降脂［8］、減肥［9］、降血壓和防止動脈粥樣硬化［10］等藥用及食用價值，而且具有抗有絲分裂的作用，有較強的抑菌［11］效果。中國擁有豐富的荷葉資源，各省普遍栽培，干荷葉年產(chǎn)量約10 000 t，到目前為止，對荷葉的加工利用較為有限，每年僅有100 t左右的干荷葉被應用于食品及藥品的生產(chǎn)，荷葉的開發(fā)利用發(fā)展前景十分廣闊。

靈芝為多孔菌科真菌赤芝（Ganoderma lucidum Karst.）或紫芝（Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang）的干燥子實體［12］，有著悠久的藥食兩用傳統(tǒng)，已被納入藥食兩用名單。靈芝含有靈芝酸［13］、靈芝多糖［14］、甾醇類、多肽、生物堿［15］等多種活性成分，具有抗腫瘤［16］、抗癲癇［17］、抗氧化［18］、降血脂、降血糖、護肝［19］、增強免疫力等作用，能夠用來治療心腦血管［20］、神經(jīng)系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)疾病，在保健食品、藥品及化妝品等方面有著廣泛的應用［21］。為此，試驗采用固態(tài)發(fā)酵的方式，利用靈芝固態(tài)發(fā)酵荷葉培養(yǎng)基，通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化靈芝固態(tài)發(fā)酵荷葉的工藝條件。靈芝在發(fā)酵過程中降解荷葉基質(zhì)中的纖維素，使荷葉中的活性成分游離，更易于人體消化吸收，同時將荷葉中難以被人體利用的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成具有藥用價值的活性物質(zhì)，提高荷葉的營養(yǎng)價值，以期能開發(fā)一種功能性食品原料，實現(xiàn)對荷葉的高效利用，解決荷葉的資源浪費問題。

1 材料與方法

1.1 材料及培養(yǎng)基

1.1.1 原料 干制荷葉片購自山東同德堂醫(yī)藥連鎖有限公司，產(chǎn)地山東菏澤；靈芝菌種為赤芝，購自江南大學傳統(tǒng)釀造食品研究中心。

1.1.2 試劑 石油醚（沸程30～60 ℃）（天津福晨化學試劑廠），氯仿（南京化學試劑廠），氫氧化鈉（無錫市晶科化工有限公司），荷葉堿標準品、齊墩果酸標準品、蘆丁標準品（北京沃凱生物科技有限公司），麥角固醇標準品（北京中科質(zhì)檢生物技術有限公司），濃硫酸、鹽酸（萊陽市康德化工有限公司），高氯酸（國藥集團化學試劑有限公司），以上試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，去離子水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

荷葉基質(zhì)培養(yǎng)基：過60目篩荷葉粉10 g，大豆蛋白2%（荷葉粉計），葡萄糖4%（荷葉粉計），七水合硫酸鎂0.10 g，磷酸二氫鉀0.15 g，初始水料比4∶1（水∶荷葉粉，體積質(zhì)量比，mL∶g），121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

DNP-9162恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）、SPX-50智能生化培養(yǎng)箱（杭州匯爾儀器有限公司）、HZQ-160振蕩培養(yǎng)箱（常州國華電器有限公司）、FW80-1高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）、YXQ LS全自動高壓滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）、T6新世紀紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海易研實驗設備有限公司）、LD5-2A低速冷凍離心機（北京醫(yī)用離心機廠）。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理和菌種制備 荷葉預處理：粉碎機粉碎，不同目數(shù)過篩備用。菌種活化：將靈芝菌種接種于PDA培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.3.2 固態(tài)培養(yǎng) 挑取長勢良好、直徑6 mm的圓形菌塊接種于荷葉基質(zhì)培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.4 單因素試驗

在前期預試驗的基礎上，以麥角固醇含量為指標，針對水料比（水∶荷葉粉，體積質(zhì)量比，mL∶g）（1.5∶1、3.0∶1、4.5∶1、6.0∶1）、氮源（大豆蛋白）（2%、4%、6%、8%）、碳源（葡萄糖）（4%、6%、8%、10%）及荷葉規(guī)格（20、40、60、80目）分別進行考察，研究不同水平對靈芝生長的影響。

1.5 正交試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎上進行正交試驗，因素水平見表1。

1.6 生物量的測定

在真菌的固體發(fā)酵中真菌與固態(tài)基質(zhì)結(jié)合緊密，難以徹底分離，直接測定菌體的生物量難以實現(xiàn)。麥角固醇作為真菌細胞膜的重要組分，能夠反映真菌的生物量情況［22］，通過測定發(fā)酵后基質(zhì)中麥角固醇的含量間接測量靈芝菌的生物量，此外，荷葉中不存在麥角固醇，不會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。

1.6.1 標準曲線的制作 分別稱取麥角固醇0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg，溶于石油醚中，定容至10 mL，紫外分光光度計設定波長為282 nm，測定吸光度，以麥角固醇濃度為橫坐標（x），吸光度為縱坐標（y），繪制得到標準曲線y=2.484 x+0.022 3，r=0.999 2。

1.6.2 樣品中麥角固醇含量的測定 采用醇堿回流法測定麥角固醇含量［23］，稱取約1 g粉碎后的樣品倒入圓底燒瓶，加20% NaOH溶液20 mL，無水乙醇20 mL，85 ℃熱水浴回流提取2.5 h，圓底燒瓶冷卻后將回流提取物移入分液漏斗，用移液管精確加入25 mL石油醚，塞上漏斗塞，將漏斗連同鐵架臺放在水平搖床上搖晃15 min（選取合適轉(zhuǎn)速，注意排氣，防止塞子頂出），靜置過夜。取上層石油醚萃取液，定容至25 mL，移入棕色玻璃瓶中密封、避光保存，于282 nm處測定吸光質(zhì)。通過標準曲線得到樣品中麥角固醇濃度，代入公式計算樣品中麥角固醇含量。

[X=25 c／1 000 m×100%] （1）

式中，X為麥角固醇含量（%）；25為萃取相石油醚體積（mL）；c為樣品中麥角固醇濃度（mg/mL）；" " 1 000為單位換算；m為稱取的樣品質(zhì)量（g）。

1.6.3 生長曲線的測定 取潔凈錐形瓶，按“1.1.3”荷葉基質(zhì)培養(yǎng)基配制滅菌，接種后，自48 h開始每間隔24 h取一瓶培養(yǎng)基滅菌，烘干粉碎后測定麥角固醇含量，繪制生長曲線。

1.7 活性成分測定

針對發(fā)酵前后荷葉基質(zhì)活性成分及含量的變化進行研究，測定生物堿、多糖、靈芝酸、膳食纖維的含量。生物堿采用索氏提取法提?。?4］，多糖采用水浴回流法提?。?5］，靈芝酸采用乙醇回流法提?。?6］，膳食纖維的測定參照GB 5009.88—2014［27］進行。

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及分析采用SPSS 26軟件進行，作圖采用Origin 2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝生長曲線

根據(jù)麥角固醇含量繪制靈芝生長曲線，從圖1可以看出，靈芝菌在培養(yǎng)基上生長至12 d后基本穩(wěn)定，故選擇12 d為優(yōu)化的發(fā)酵時間。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 水料比單因素試驗 從圖2可以看出，水料比對麥角固醇含量影響明顯，整體呈先上升后下降的趨勢，水料比3.0∶1時麥角固醇含量最高，繼續(xù)添加去離子水，麥角固醇含量隨之下降，水料比6.0∶1時，觀察到有培養(yǎng)基不能完全凝固，培養(yǎng)后期仍有部分液體存在，對靈芝菌的發(fā)酵產(chǎn)生了影響。

2.2.2 氮源添加量單因素試驗 從圖3可以看出，大豆蛋白的添加量對麥角固醇含量的影響表現(xiàn)為先上升后下降，氮源添加量為6%時，麥角固醇含量最高，繼續(xù)添加大豆蛋白，麥角固醇含量明顯下降，氮源添加量應控制為6%。

2.2.3 碳源添加量單因素試驗 從圖4可以看出，碳源（葡萄糖）的最佳添加量為8%。碳源添加量低于8%時，麥角固醇含量與碳源的添加量呈正相關，當碳源的添加量高于8%時，麥角固醇的含量呈下降趨勢。結(jié)合實際觀察的菌絲生長情況，推測靈芝菌在碳源添加量為10%時，生長速度加快，提早進入衰亡期，故麥角固醇含量下降。

2.2.4 荷葉規(guī)格單因素試驗結(jié)果 從圖5可以看出，當荷葉規(guī)格為20目時，麥角固醇含量最低，荷葉規(guī)格為40、60、80目時，麥角固醇含量測定結(jié)果較好，其中以荷葉規(guī)格40目時含量最高。結(jié)合實際觀察到的生長情況，發(fā)現(xiàn)當荷葉以80目添加至培養(yǎng)基時，靈芝菌絲僅在培養(yǎng)基表面生長，菌絲未蔓延至培養(yǎng)基內(nèi)部，推測培養(yǎng)基結(jié)合過于緊密，透氣性差，阻礙了靈芝菌的生長。因此，荷葉規(guī)格控制在40目為宜。

2.3 正交試驗結(jié)果

從表2可以看出，對樣品中麥角固醇含量影響最大的因素為水料比，其余依次為荷葉規(guī)格、碳源添加量、氮源添加量。從極差分析推斷得出最優(yōu)方案為A2B1C3D2，即水料比3.0∶1，氮源（大豆蛋白）添加量4%，碳源（葡萄糖）添加量10%，荷葉規(guī)格40目。

通過方差分析（表3）可知，水料比、碳源添加量、荷葉規(guī)格對樣品中麥角固醇含量有顯著影響，氮源添加量對樣品中麥角固醇含量的影響不顯著。

2.4 驗證試驗

正交試驗的最佳發(fā)酵條件與極差分析所得的發(fā)酵工藝條件不一致，故根據(jù)正交試驗極差分析得出的荷葉基質(zhì)培養(yǎng)基的工藝參數(shù)進行驗證試驗，所得樣品中麥角固醇的含量測定結(jié)果平均值為0.741%，優(yōu)于正交試驗中最優(yōu)結(jié)果0.730%，故最優(yōu)方案為A2B1C3D2，即水料比3.0∶1，氮源（大豆蛋白）添加量4%，碳源（葡萄糖）添加量10%，荷葉規(guī)格40目。

2.5 活性成分測定結(jié)果

由表4可知，發(fā)酵后基質(zhì)中生物堿的含量略微上升，為0.508%，推測發(fā)酵過程中靈芝菌產(chǎn)酶分解了荷葉細胞壁，增加了生物堿的溶出，以及發(fā)酵過程中合成了微量的靈芝生物堿；發(fā)酵后多糖的含量大幅上升，達到4.87%；靈芝酸含量為0.72%；可溶性膳食纖維含量上升至3.45%，不溶性膳食纖維含量下降至9.02%，二者的比值由 1∶4.25 變?yōu)?1∶2.61。發(fā)酵后活性成分含量的上升提高了荷葉基質(zhì)的功能性，膳食纖維含量的變化更貼合均衡飲食的需求。

3 小結(jié)

試驗采用固態(tài)發(fā)酵的方式，以荷葉為主要基質(zhì)發(fā)酵靈芝菌，通過單因素試驗和正交試驗，最終得到荷葉培養(yǎng)基的最佳配比為水料比3.0∶1，氮源（大豆蛋白）添加量4%，碳源（葡萄糖）添加量10%，荷葉規(guī)格40 目，七水合硫酸鎂0.1 g，磷酸二氫鉀0.15 g，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時間12 d。發(fā)酵前后活性成分對比表明，生物堿、多糖、靈芝酸、可溶性膳食纖維含量均有上升，不溶性膳食纖維含量下降。相較于未發(fā)酵的荷葉，靈芝發(fā)酵的荷葉基質(zhì)活性成分含量更高，更具有利用價值。試驗為拓展荷葉和靈芝的資源利用領域，豐富食品藥品加工工藝提供了參考。

參考文獻：

［1］ 鐘先鋒， 黃桂東. 荷葉成分及功能的研究進展［J］.食品與機械， 2006， 22（4）：138-140， 144.

［2］ 唐裕芳，張妙玲，劉忠義，等.荷葉研究現(xiàn)狀與展望［J］.食品研究與開發(fā)， 2004， 25（4）：14-16.

［3］ 劉貝濤. 荷葉的化學成分和藥理作用探究［J］.當代化工研究， 2016（7）：134-135.

［4］ 高振華，孫伶俐，王 豪，等. 荷葉化學成分及其藥理活性研究［J］.廣東化工， 2020， 47（5）：100-102.

［5］ 蔡 敏，李長春，畢宏光，等.荷葉黃酮的提取和純化工藝研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學， 2015， 54（22）：5691-5693， 5697.

［6］ 陳 曦，戚 進.荷葉中黃酮和生物堿的研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志， 2015， 21（18）：211-214.

［7］ 朱 怡，顧聯(lián)斌. 荷葉臨床效用發(fā)微［J］.上海中醫(yī)藥雜志， 2017，51（6）：77-78.

［8］ 邢 毅. 荷葉堿的提取分離及荷葉提取物降血脂功能研究［D］. 江蘇無錫：江南大學， 2019.

［9］ WU C H， YANG M Y， CHAN K C， et al. Improvement in high-fat diet-induced obesity and body fat accumulation by a Nelumbo nucifera leaf flavonoid-rich extract in mice［J］. J Agr Food Chem， 2010， 58（11）：7075-7081.

［10］ 丁 暢， 銀 萍， 趙 奇， 等. 荷葉堿通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路促進自噬減少巨噬細胞泡沫化的機制研究［J］. 中國病理生理雜志， 2020， 36（7）：1230-1236.

［11］ 袁麗萍，王 衛(wèi)，吉莉莉，等.荷葉中黃酮抑菌作用的研究進展［J］.山東化工， 2018， 47（22）：46-47.

［12］ 范蘇玉. 靈芝多糖和三萜提取物體外免疫學評價［D］. 鄭州：河南中醫(yī)藥大學， 2016.

［13］ 邢康康， 劉 艷， 賀宗毅， 等. 靈芝酸研究進展［J］.食用菌學報， 2017， 24（3）：96-103.

［14］ 邵 楠， 徐 靜， 宋 航， 等. 靈芝多糖實驗研究進展［J］. 遼寧中醫(yī)藥大學學報， 2021， 23（10）：91-95.

［15］ XIE C， YAN S， TANG P， et al. Mapping themetabolic signatures of fermentation broth， mycelium， fruiting body and spores powder from Ganoderma lucidum byuntargeted metabolomics［J］. LWT- Food science and technology， 2020， 129：109494.

［16］ 熊小文， 李 曄， 李 鵬， 等. 赤芝子實體的化學成分及其抗腫瘤活性［J］.中國醫(yī)院藥學雜志， 2015， 35（21）：1902-1906.

［17］ 趙 爽， 蔣利和， 王居平， 等. 外源性神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合靈芝三萜化合物對癲癇腦損傷神經(jīng)保護作用［J］. 現(xiàn)代預防醫(yī)學 2017， 44（4）：701-705.

［18］ 殳葉婷， 高 潔， 彭文瀟， 等. 靈芝多糖的抗氧化作用研究［J］.南京中醫(yī)藥大學學報， 2020， 36（4）：504-508.

［19］ GAO Z，YUAN F F，LI H P，et al. The ameliorations of Ganoderma applanatum residue polysaccharides against CCl4 induced liver injury［J］.International journal of biological macromolecules，2019，137：1130-1140.

［20］ LIEMENA H A， SARGOWO D， NUGROHO F W， et al. Potent protective effects of polysaccharide peptide on vascular endothelium and cardiac remodelling in post myocardial infarction patients： A prospective double-blind randomized controlled trial［J］. European heart journal： Acute cardiovascular care， 2021， 10（Supplement1）：i154-i155.

［21］ 李夢嬌，盧瑋玉，吳彥彥，等. 靈芝功能性成分及其應用進展［J］.食品安全導刊， 2021（25）：182-183.

［22］ 習興梅， 曾光明， 郁紅艷， 等. 真菌生物量指示劑麥角固醇的分離及測定方法［J］.微生物學通報， 2006， 33（3）：128-132.

［23］ 魏培蓮， 岑沛霖， 盛春琦. 3種固態(tài)發(fā)酵生物量測定方法的比較［J］.食品與生物技術學報， 2006， 25（1）：60-64， 69.

［24］ 邢 毅， 劉 杰. 索氏提取荷葉生物堿及純化工藝探究［J］.食品工業(yè)， 2018， 39（4）：230-233.

［25］ 邢 穎， 景艷芳. 提取方法對荷葉多糖得率及抗氧化活性的影響［J］.食品與機械， 2020， 36（6）：166-169， 175.

［26］ 胡瓊方， 董建生， 高文庚. 靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物提取與測定［J］.食品研究與開發(fā)， 2018， 39（10）：104-109.

［27］ GB 5009.88—2014， 食品安全國家標準 食品中膳食纖維的測定［S］.

收稿日期：2022-02-21

基金項目：江蘇省海洋資源開發(fā)研究院開放課題（HKK201617）；江蘇省研究生科研與實踐創(chuàng)新計劃（SJCX20_1315）

作者簡介：楊從發(fā)（1965-），男，江蘇鹽城人，副教授，博士，主要從事食品加工與安全的研究工作，（電話）13951256312（電子信箱）ycff1965@163.com。