腸道菌群及其代謝產(chǎn)物苯乙酰谷氨酰胺在慢性心力衰竭患者中的變化研究

【摘要】 背景 慢性心力衰竭（CHF）是各種心血管疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)或末期階段，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物在心力衰竭的病理過程中起重要作用。越來越多證據(jù)表明，腸道菌群失調(diào)及其代謝產(chǎn)物紊亂可導(dǎo)致細(xì)菌移位、釋放介質(zhì)、炎性反應(yīng)等，進(jìn)而加重CHF病情。目的 分析腸道菌群及其代謝產(chǎn)物苯乙酰谷氨酰胺（PAGln）在CHF患者中的變化，探討腸道微生物在心力衰竭中所發(fā)揮的作用。方法 選取2021年6月—2022年6月上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院心內(nèi)科收治的CHF患者58例為CHF組，另選取具有相同CHF危險(xiǎn)因素但沒有CHF臨床癥狀表現(xiàn)及既往病史的患者46例為Control組。繪制腦鈉肽（BNP）和PAGln診斷CHF的受試者工作特征（ROC）曲線。利用16S rRNA測序技術(shù)對兩組患者的腸道菌群多樣性和豐度進(jìn)行分析。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）檢測兩組標(biāo)本血漿中的PAGln水平。結(jié)果 CHF組左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、BNP、PAGln均高于Control組，左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）低于Control組（Plt;0.05）。BNP和PAGln水平診斷CHF患者的曲線下面積（AUC）分別為0.995、0.913。Venn圖表明，CHF組特有OTUs數(shù)目少于Control組。α多樣性分析表明，CHF組Chao1指數(shù)低于Control組（Plt;0.05）；β多樣性分析表明，兩組的腸道菌群總體結(jié)構(gòu)存在差異。屬水平上，CHF組埃希-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、巨單胞菌屬（Megamonas）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、副擬桿菌（Parabacteroides）、羅姆布茨菌（Romboutsia）相對豐度高于Control組（Plt;0.05），單胞菌屬（Solimonas）和多爾菌屬（Dorea）相對豐度低于Control組（Plt;0.05）。LEfSe分析結(jié)果顯示毛螺菌科（Lachnospiraceae）、華桿菌科（Solimonadaceae）、Solimonas、Dorea、伯克菌科（Burkholderiaceae）在Control組中升高（Plt;0.05），腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、埃希菌屬（Escherichia）、Bifidobacterium、雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）、Klebsiella、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、巨單胞菌屬（Megamonas）、理研菌科（Rikenellaceae）、另枝菌屬（Alistipes）、Parabacteroides、盲腸坦納菌科（Tannerellaceae）在CHF組升高（Plt;0.05）。典型相關(guān)分析（CCA）表明，BNP、PAGln、LVEDD、LVESD與CHF組菌群顯著相關(guān)，其中BNP對群落變化影響最大。相關(guān)性分析表明，Escherichia-Shigella與BNP和PAGln呈正相關(guān)（Plt;0.05）；擬桿菌屬（Bacteroides）與BNP呈負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；Romboutsia、梭桿菌屬（Fusobacterium）、內(nèi)考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）與BNP和PAGln呈負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）。結(jié)論 CHF患者腸道菌群結(jié)構(gòu)組成與具有相同合并疾病但沒有CHF臨床癥狀表現(xiàn)及既往病史的患者明顯不同，腸道菌群多樣性下降，腸道致病菌豐度明顯升高，這可能導(dǎo)致CHF患者體內(nèi)PAGln水平上升，參與CHF的發(fā)生發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】 心力衰竭；苯乙酰谷氨酰胺；胃腸道微生物組；代謝產(chǎn)物；生物多樣性

【中圖分類號】 R 541.62 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0166

【引用本文】 張振東，蔡斌，王宏偉，等.腸道菌群及其代謝產(chǎn)物苯乙酰谷氨酰胺在慢性心力衰竭患者中的變化研究［J］. 中國全科醫(yī)學(xué)，2023，26（29）：3665-3673. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0166. ［www.chinagp.net］

ZHANG Z D，CAI B，WANG H W，et al. Study on the changes of intestinal flora and its metabolite phenylacetylglutamine in patients with chronic heart failure［J］. Chinese General Practice，2023，26（29）：3665-3673.

Study on the Changes of Intestinal Flora and Its Metabolite Phenylacetylglutamine in Patients with Chronic Heart Failure ZHANG Zhendong1，CAI Bin2，WANG Hongwei1，2，QIAO Zengyong1，2*

1.Anhui University of Science and Technology，Huainan 232000，China

2.Department of Cardiology，the South Branch of the Sixth People's Hospital，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 201400，China

*Corresponding author：QIAO Zengyong，Chief physician/Professor；E-mail：qiaozy666@sina.com

【Abstract】 Background The intestinal flora and its metabolites play an important role in the pathology of chronic heart failure（CHF），which is a severe manifestation or terminal stage of various cardiovascular diseases. Increasing evidence has shown that dysbiosis of the intestinal flora and its metabolites can lead to bacterial translocation，release of mediators，inflammatory response and consequently aggravation of CHF. Objective To analyze the changes of intestinal flora and its metabolite phenylacetylglutamine （PAGln） in patients with CHF and explore the role played by gut microbiota in heart failure. Methods A total of 58 patients with heart failure admitted to the Department of Cardiology of the South Branch of the Sixth People's Hospital of Shanghai Jiaotong University were selected as the CHF group，and 46 patients with the same CHF risk factors but without clinical symptoms and past medical history of CHF were selected as the control group from June 2021 to June 2022. Plotting ROC curves of brain natriuretic peptide （BNP） and PAGln for the diagnosis of CHF. The abundance and diversity of intestinal flora in the two groups were analyzed using 16S rRNA sequencing. Liquid chromatography with tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） was used to detect PAGln concentrations in the plasma of samples from both two groups. Results The left ventricular end-systolic diameter （LVESD），left ventricular end-diastolic diameter （LVEDD），BNP，and PAGln in the CHF group were higher than the control group，and the left ventricular ejection fraction （LVEF） was lower than the control group （Plt;0.05）. The area under curve （AUC） of BNP and PAGln levels for the diagnosisof CHF patients was 0.995 and 0.913，respectively. Venn diagram showed that the number of OTUs specific to the CHF group was less than the control group. Alpha diversity analysis showed that the Chao1 index was lower in the CHF group than the control group （Plt;0.05）. β diversity analysis showed that the overall structure of the intestinal flora differed between the two groups. At the genus level，the relative abundances of Escherichia-Shigella，Megamonas，Klebsiella，Bifidobacterium，Parabacteroides，and Romboutsia were higher in the CHF group than the control group （Plt;0.05），and the relative abundances of Solimonas and Dorea were lower than the control group （Plt;0.05）. The results of LEfSe analysis showed that Lachnospiraceae，Solimonadaceae，Solimonas，Dorea，and Burkholderiaceae were elevated in the control group （Plt;0.05），and Enterobacteriaceae，Escherichia，Bifidobacterium，Bifidobacteriaceae，Klebsiella，Lactobacillaceae，Lactobacillus，Megamonas，Rikenellaceae，Alistipes，Parabacteroides，and Tannerellaceae were elevated in the CHF group （Plt;0.05）. Typical correlation analysis （CCA） showed that BNP，PAGln，LVEDD，and LVESD were significantly correlated with the CHF group，with BNP having the greatest effect on community changes. Correlation analysis showed that Escherichia-Shigella was positively correlated with BNP and PAGln（Plt;0.05）；Bacteroides was negatively correlated with BNP；Romboutsia，F(xiàn)usobacterium，and Phascolarctobacterium were negatively correlated with BNP and PAGln（Plt;0.05）. Conclusion The structural composition of the intestinal flora in patients with CHF was significantly different from the patients with the same co-morbidities but without clinical manifestations and previous medical history of CHF，with a decrease in flora diversity and a significant increase in the abundance of pathogenic intestinal bacteria，which may lead to an increase in the level of PAGln in CHF patients and participate in the development of CHF.

【Key words】 Heart failure；Phenylacetylglutamine；Gastrointestinal microbiome；Metabolites；Biodiversity

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是各種心血管疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)或末期階段。隨著老齡化人口增加和疾病診療技術(shù)的發(fā)展，其患病率呈不斷上升趨勢，引起全球范圍的沉重疾病負(fù)擔(dān)和巨大經(jīng)濟(jì)壓力［1］。CHF病理機(jī)制主要包括血流動力學(xué)紊亂、神經(jīng)內(nèi)分泌過度興奮以及炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激激活等方面內(nèi)容［2］?；趯Πl(fā)病機(jī)制的深入探索，目前臨床上普遍應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑（ARB）、血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑（ARNI）、β受體阻滯劑及醛固酮抑制劑等藥物抑制心臟的病理性重構(gòu)和抵抗腎素-血管緊張素-醛同酮系統(tǒng)的過度興奮，從而降低病死率、改善患者生活質(zhì)量，但CHF總體死亡率仍然很高，患者5年存活率與惡性腫瘤接近［3］。目前認(rèn)為，CHF引起的低心臟泵血量、腸道灌注不足可能會改變腸道生理結(jié)構(gòu)，造成腸黏膜缺血和腸壁水腫，出現(xiàn)腸屏障功能受損和通透性增加，這些病理變化反過來又會導(dǎo)致細(xì)菌移位和血液內(nèi)毒素水平增加［4-5］。腸道菌群是寄宿于人類胃腸道的復(fù)雜微生物群落，在組成腸道黏膜屏障、體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)腸道炎癥及腸道免疫功能等方面發(fā)揮重要作用。研究表明，腸道菌群紊亂與腸道炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，免疫炎癥機(jī)制能導(dǎo)致心臟不良重塑和心功能障礙［6］。此外有研究發(fā)現(xiàn)，由腸道微生物代謝生成的常見慢性腎臟病毒素苯乙酰谷氨酰胺（phenylacetylglutamine，PAGln）在主要不良心血管事件（major adverse cardiovascular events，MACE）患者和糖尿病患者中血漿濃度較高，且被認(rèn)為是MACE風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測因子［7-8］，但少見關(guān)于CHF患者血漿PAGln水平變化的研究。因此，為進(jìn)一步闡明腸道菌群及其代謝產(chǎn)物PAGln和CHF之間的機(jī)制，本研究選取同一時(shí)期CHF組和Control組患者為研究對象，比較兩組腸道菌群變化和血漿PAGln水平的差異，探討腸道菌群及其代謝產(chǎn)物對CHF的影響，以期為CHF治療途徑開辟新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究選取2021年6月—2022年6月在上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院心內(nèi)科住院的CHF患者58例作為CHF組，其中男26例，女32例；年齡52～89歲，平均年齡77.5（73.0，84.0）歲；基礎(chǔ)疾病包括單純冠心病22例，單純高血壓3例，冠心病合并高血壓33例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）CHF診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》［1］；（2）按照美國紐約心臟病協(xié)會（NYHA）分級心功能Ⅲ～Ⅳ級；（3）病例資料完整，通過數(shù)字病歷系統(tǒng)收集患者的臨床資料。選取具有相同合并疾病但沒有CHF臨床癥狀表現(xiàn)及既往病史的患者46例作為Control組，其中男25例，女21例；年齡65～89歲，平均年齡78.0（74.8，81.3）歲；基礎(chǔ)疾病包括單純冠心病20例，冠心病合并高血壓26例。本研究已通過上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院倫理委員會審核批準(zhǔn)（倫理批件編號：2021-KY-25-01），所有患者（或其直系親屬）簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）肥厚或限制型心肌病、心肌炎、急性心肌梗死、先天性心臟??；（2）糖尿病、腹瀉、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、感染性疾病及惡性腫瘤；（3）嚴(yán)重肝腎功能不全；（4）入院前3～6個(gè)月服用過抗生素、類固醇激素、中草藥（包括口服、肌肉注射或靜脈注射）或益生菌（如酸奶）等；（5）入院前1周飲食大幅變化。

1.2 PAGln檢測方法 抽取兩組患者入院24 h內(nèi)靜脈血5 mL，于EDTA抗凝管中混勻，并分離1 mL血漿放入-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。隨后將收集的樣本送至上海敏心生物科技有限公司，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定血漿PAGln水平。取血漿樣品（100 μL）加入甲醇

（400 μL）漩渦混合、超聲振蕩，然后離心（12 000 r/min，4 ℃，10 min），移取上清液并上機(jī)分析。使用Acquity UPLC HSS T3（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱進(jìn)行色譜分離，色譜分離條件：流速0.30 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；色譜流動相組成：A水（0.1%甲酸），B甲醇；樣本梯度洗脫程序：0～1.0 min 10% B；

1.0～2.5 min 10%～90% B；2.5～3.5 min 90% B；3.5～4.0 min

10%～90% B；4.0～5.0 min 10% B。使用設(shè)置模式為熱電噴霧離子源模式的質(zhì)譜儀（AB SCIEX 5500 QQQ -MS）檢測PAGln，使用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）采集數(shù)據(jù)，利用MultiQuant軟件進(jìn)行積分，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行PAGln含量計(jì)算。

1.3 16S rRNA測序 收集CHF組和Control組患者入院后24 h內(nèi)清晨新鮮糞便5.0 g于無菌管中，將采樣管裝入自封袋，隨后在2 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，存放于-80 ℃超低溫冰箱。隨后將收集的樣本送至廣東美格基因科技有限公司進(jìn)行測序。按照DNA提取試劑盒（DP712）說明書進(jìn)行微生物群落DNA抽提，使用Illumina Nova 6000高通量測序平臺對DNA樣品進(jìn)行測序。使用引物為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域。PCR反應(yīng)在50 μL的體積中進(jìn)行：25 μL的2x Premix Taq，1 μL的正向和反向引物，以及50 ng的DNA。PCR循環(huán)在BioRadS1000熱循環(huán)儀（Bio-Rad Laboratory，加拿大）中完成。溫度為94 ℃，時(shí)間為5 min，然后94 ℃變性30個(gè)循環(huán)，52 ℃

退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳而純化。然后利用GeneTools Analysis Software（Version 4.03.05.0，SynGene）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行濃度對比，按照等質(zhì)量原則計(jì)算各樣品所需體積，將各PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合。使用E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit（Omega，USA）凝膠回收試劑盒回收PCR混合產(chǎn)物，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段。按照NEBNext? Ultra? II DNA Library Prep Kit for Illumina?（New England Biolabs，USA）標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行建庫操作。測序原始序列則使用Illumina Nova 6000平臺進(jìn)行PE250測序，利用fastp（0.14.1）軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。根據(jù)UPARSE聚類方法將不同處理組序列信息聚類為用于物種分類的OTUs（Operational Taxonomic Units），OTUs相似性設(shè)置為97%。與SILVA（16S）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得物種注釋信息。并根據(jù)物種注釋情況進(jìn)一步分析α多樣性、β多樣性、物種豐度、典型相關(guān)分析（CCA）等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以相對數(shù)表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher's確切概率法；呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；變量間的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)；繪制腦鈉肽（BNP）和PAGln診斷CHF的受試者工作特征（ROC）曲線。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。α多樣性指數(shù)主要通過Chao1和Simpson等指數(shù)反映豐富度和均勻性。Chao1主要是估計(jì)群落中包含物種的數(shù)目；Simpson數(shù)值范圍為0～1，當(dāng)群落只有一種物種時(shí)，此時(shí)Simpson值最小為0，同時(shí)也是直觀理解的多樣性最小。當(dāng)物種種類無限多（豐富度最高），并且每個(gè)物種數(shù)目均一致（均勻度最高）時(shí)，Simpson值為1。主坐標(biāo)分析法（principal coordinates analysis，PCoA）是表征微生物群落差異的一種方法，通過對樣本距離矩陣進(jìn)行降維，簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，展現(xiàn)樣本在特定距離下的分布情況，分析兩組樣本間微生物群落組成的相異性。相對豐度是指每個(gè)物種在樣本中所占比例，可以用于比較不同樣本中不同物種的相對豐度。LefSe分析通過進(jìn)行分組比較的內(nèi)部進(jìn)行亞組比較分析，從而找到組間在豐度上有顯著差異的物種。CCA分析可以解釋臨床表型數(shù)據(jù)（包括本研究中的PAGln）與菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線資料比較 兩組患者年齡、性別、冠心病、高血壓、吸煙史、收縮壓、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）水平以及ACEI/ARB、β受體阻滯劑使用比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。兩組患者心房顫動、心率、超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、三酰甘油（TG）、血肌酐、尿素氮、尿酸、利尿劑使用比例比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表1。

2.2 兩組患者超聲心動圖指標(biāo)、BNP及PAGln水平比較 CHF組左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、BNP、PAGln均高于Control組，左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）低于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表2。

2.3 Spearman秩相關(guān)分析 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示：PAGln與BNP（rs=0.792，Plt;0.001）、LVESD（rs=0.566，Plt;0.001）、LVEDD（rs=0.473，Plt;0.001）呈正相關(guān)，PAGln與LVEF（rs=-0.604，Plt;0.001）呈負(fù)相關(guān)。

2.4 血BNP和PAGln對CHF診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示，血BNP和PAGln水平診斷CHF患者的曲線下面積（AUC）分別為0.995、0.913。其對應(yīng)的靈敏度和特異度分別為100.0%和96.6%、82.6%和98.3%。最佳截?cái)嘀捣謩e為579.2 ng/L、61.735 μg/L，見圖1。

2.5 兩組腸道菌群物種群落分析 通過Venn圖比較CHF組和Control組腸道菌群的物種組成情況和相似度，由圖2可知，在門水平上，兩組共有OTUs數(shù)目為22個(gè)，CHF組特有OTUs數(shù)目為1個(gè)，Control組特有OTUs數(shù)目為24個(gè)；屬水平上，兩組共有OTUs數(shù)目為284個(gè)，CHF組特有OTUs數(shù)目為17個(gè)，Control組特有OTUs數(shù)目為275個(gè)。CHF組特有OTUs數(shù)目少于Control組，表明CHF組微生物多樣性水平低于Control組。

2.6 兩組腸道菌群多樣性及菌種類型分析 如表3所示，兩組Chao1指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；兩組Simpson指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。如圖3所示，橫縱坐標(biāo)主成分的貢獻(xiàn)率分別為22.3%和11.1%，累積貢獻(xiàn)率為33.4%，能較好地解釋原始樣本中的信息；兩組樣本點(diǎn)之間明顯分離，說明Control組和CHF組之間腸道菌群組成存在一定差異。

2.7 兩組腸道菌群菌種類型分析 門水平上（圖4），Control組和CHF組主要的菌種均為出厚壁菌門（Firmicutes），組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（52.02%與49.97%，Pgt;0.05）；擬桿菌門（Bacteroidetes）是兩組占比第2的菌種，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（30.38%與32.48%，Pgt;0.05）。而變形菌門（Proteobacteria）及放線菌門（Acti-nobacteria）等其余菌種占比相對較低。屬水平上，CHF組埃希-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、巨單胞菌屬（Megamonas）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、副擬桿菌（Parabacteroides）、羅姆布茨菌（Romboutsia）相對豐度高于Control組（Plt;0.05），單胞菌屬（Solimonas）和多爾菌屬（Dorea）相對豐度低于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。

LEfSe分析（圖5）結(jié)果顯示，兩組共有12種腸道菌群豐度有差異，其中毛螺菌科（Lachnospiraceae）、華桿菌科（Solimonadaceae）、Solimonas、Dorea、伯克菌科（Burkholderiaceae）在Control組中升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、埃希菌屬（Escherichia）、Bifidobacterium、雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）、Klebsiella、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、巨單胞菌屬（Megamonas）、理研菌科（Rikenellaceae）、另枝菌屬（Alistipes）、Parabacteroides、盲腸坦納菌科（Tannerellaceae）在CHF組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。

2.8 臨床數(shù)據(jù)和腸道菌群的關(guān)聯(lián)分析 如圖6所示，黑色箭頭表示臨床表型數(shù)據(jù)，其長度表示該指標(biāo)對腸道菌群的影響程度。圖中CCA1和CCA2對物種分布的總解釋量達(dá)到了70.1%，表明在各項(xiàng)數(shù)據(jù)的約束下，兩組糞便樣品可以更好地分類，證明心力衰竭對腸道菌群有明顯的影響。圖7表明，BNP、PAGln、LVEDD、LVESD與CHF組菌群相關(guān)，其中BNP對群落變化影響最大。相關(guān)性分析通過計(jì)算臨床表型數(shù)據(jù)與物種豐度間的Spearman秩相關(guān)系數(shù)，得到兩兩之間的相關(guān)性和顯著性，選取屬水平上豐度前20名的物種與臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，如圖7所示，Escherichia-Shigella與BNP和PAGln呈正相關(guān)（Plt;0.05）；擬桿菌屬（Bacteroides）與BNP呈負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；Romboutsia、梭桿菌屬（Fusobacterium）、內(nèi)考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）與BNP和PAGln呈負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）。

3 討論

為了盡量減少混雜因素，本研究招募了年齡、性別和心血管疾病與CHF患者相似的患者作為Control組。本研究通過16S rRNA擴(kuò)增序列測定發(fā)現(xiàn)，盡管兩組患者的CHF危險(xiǎn)因素（冠心病、高血壓等）沒有顯著差異，但兩組腸道菌群結(jié)構(gòu)明顯不同。組間OTUs分布比較發(fā)現(xiàn)，門水平上，CHF組特有OTUs數(shù)目占比為2.1%，Control組為51.1%，屬水平上，CHF組特有OTUs數(shù)目占比為2.9%，Control組為47.7%，CHF組特有OTUs數(shù)目少于Control組，說明心力衰竭引起腸道微生物群物種種類的減少。兩組微生物多樣性比較發(fā)現(xiàn)，α多樣性分析中CHF組Chao1指數(shù)低于Control組（Plt;0.05），表明兩組菌群物種種類有顯著差異；兩組Simpson指數(shù)比較無差異，表明兩組微生物群物種分布接近。微生物多樣性結(jié)果說明心力衰竭導(dǎo)致原有的物種多樣性下降。β多樣性分析發(fā)現(xiàn)兩組樣本點(diǎn)之間明顯分離，并在一定范圍內(nèi)聚集，表明Control組和CHF組之間腸道菌群組成存在差異，說明心力衰竭改變了正常的腸道菌群組成和分布。研究證明，CHF患者腸道灌注不足，腸道結(jié)構(gòu)功能發(fā)生改變，腸黏膜中細(xì)菌濃度顯著升高，這可能與疾病導(dǎo)致腸缺氧、腸道局部pH改變有關(guān)；同時(shí)由于心排血量減少所導(dǎo)致的腸道低灌注可進(jìn)一步破壞腸黏膜的屏障功能，使得細(xì)菌移位從而引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腸道菌群的多樣性顯著降低，加速心力衰竭進(jìn)展［9］。兩組腸道菌群相對豐度占比顯示，在門水平上，CHF組Firmicutes豐度低于Control組，Bacteroidota豐度高于Control組。有研究發(fā)現(xiàn)，CHF患者Bacteroidota豐度增高，F(xiàn)irmicutes豐度降低，并且Firmicutes豐度和腸道微生物多樣性與膳食纖維的攝入量呈正相關(guān)［10］。而CHF患者由于長期胃腸道淤血，普遍存在食欲不振等消化道癥狀，導(dǎo)致膳食纖維攝入不足，引起Firmicutes豐度下降。在屬水平上，Control組Solimonas、Dorea的相對豐度均高于CHF組。CHF組Escherichia-Shigella、Megamonas、Klebsiella、Bifidobacterium和Parabacteroides的相對豐度均高于Control組。LEfSe分析結(jié)果則顯示，在屬水平上，Solimonas、Dorea在Control組中明顯增高，Escherichia-Shigella、Bifidobacterium、Klebsiella、Lactobacillus、Megamonas、Alistipes、Parabacteroides在CHF組中明顯增高。兩種檢驗(yàn)分析中均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的菌屬為Solimonas、Dorea、Escherichia-Shigella、Megamonas、Klebsiella、Bifidobacterium和Parabacteroides，這些種菌屬可能更加具有生物標(biāo)志物意義。動物模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓性心力衰竭大鼠中Parabacteroides顯著增加［11］。心力衰竭時(shí)腸動力不足、黏膜絨毛吸收障礙、腸上皮黏膜屏障受損，導(dǎo)致腸道通透性增加，腸腔內(nèi)細(xì)菌、食物殘?jiān)炔荒芗皶r(shí)清除，促進(jìn)Klebsiella、Escherichia-Shigella等革蘭陰性細(xì)菌增殖，致使脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等有毒介質(zhì)易于進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)，引起炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重心力衰竭病情［12］。PASINI等［13］研究顯示CHF患者腸道致病菌如Shigella數(shù)量增加，并且推測血流動力學(xué)不穩(wěn)定時(shí)可能導(dǎo)致Klebsiella過度生長。Klebsiella能調(diào)控三甲胺（trimethylamine，TMA）合成途徑，TMA可被腸道微生物代謝生成氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）［14］。研究發(fā)現(xiàn)CHF患者血漿TMAO水平升高預(yù)示更高的死亡風(fēng)險(xiǎn)，喂養(yǎng)TMAO的C57BL6/J雄性小鼠可出現(xiàn)心力衰竭、利鈉肽水平升高及心室重塑［15］。因此，TMAO可能是腸道菌群參與心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的另一個(gè)重要途徑。Bifidobacterium作為有益菌能發(fā)揮多種生理作用，包括降低不利細(xì)菌（如大腸桿菌）數(shù)量、抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生、調(diào)節(jié)宿主機(jī)體免疫、降低糞便氨濃度和腸道pH值來改善腸道環(huán)境。有報(bào)道顯示心力衰竭患者Bifidobacterium豐度和血漿吲哚酚酸鹽（indoxyl sulfate，IS）呈負(fù)相關(guān)，而IS水平與左心室收縮功能受損密切相關(guān)［16］。據(jù)此推測，CHF患者Bifidobacterium豐度增高，可能起到一定對抗IS的作用。綜上表明腸道菌群結(jié)構(gòu)組成改變，可能導(dǎo)致有毒介質(zhì)和微生物相關(guān)代謝產(chǎn)物水平增高，從而加重CHF進(jìn)展。

PAGln是必需氨基酸苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）被腸道微生物分解代謝后生成的副產(chǎn)物，苯丙氨酸被腸道菌群分解代謝后形成苯丙酮酸和苯乙酸（PAA）［17］，肝酶能催化PAA與谷氨酰胺（Gln）生成PAGln。本研究發(fā)現(xiàn)：Spearman秩相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PAGln與BNP呈正相關(guān)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)。ROC分析顯示，血BNP和PAGln對應(yīng)的靈敏度和特異度分別為100.0%和96.6%、82.6%和98.3%。LVEF、LVEDD、LVESD則是臨床上常見的超聲心動圖指標(biāo)，能夠有效反映左心室結(jié)構(gòu)變化和射血功能。BNP則是目前心力衰竭診療中廣泛應(yīng)用的生物活性激素，是診斷疾病的重要指標(biāo)。CCA分析則表明，5個(gè)具有顯著差異的臨床表型數(shù)據(jù)對物種分布的解釋量為70.1%，其中BNP和PAGln對CHF組菌群影響較大，并且兩者對CHF組菌群影響接近；BNP和PAGln箭頭之間夾角呈銳角，表明兩者之間呈正相關(guān)。NEMET等［7］發(fā)現(xiàn)MACE患者和糖尿病患者血漿PAGln濃度較高，OTTOSSON等［8］發(fā)現(xiàn)PAGln血漿濃度可獨(dú)立預(yù)測MACE的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。還有報(bào)道認(rèn)為PAGln可以作用于心臟中β2-腎上腺素能受體，引起交感神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮，這種持續(xù)、過度的交感神經(jīng)系統(tǒng)激活對心臟、腎臟及血管功能均產(chǎn)生不利影響［18］。以上結(jié)果提示PAGln水平與心臟功能密切相關(guān)，并且和心力衰竭的指標(biāo)具有良好的相關(guān)性，可能作為心臟收縮和舒張功能的潛在篩查指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，CHF組患者血漿PAGln濃度高于Control組。相關(guān)性分析表明，Escherichia-Shigella與BNP和PAGln呈正相關(guān)，據(jù)報(bào)道，肝臟中苯丙氨酸與Gln結(jié)合可合成苯乙?；拾彼幔╬henylacetylglycine，PAGly，小鼠代謝物）或PAGln（人代謝物），腸道微生物fldH基因簇與porA基因競爭，將PAGly和PAGln代謝為PAA［7］。因此，提示PAGln可能由Escherichia-Shigella代謝產(chǎn)生。Escherichia-Shigella是一種屬于變形菌門的革蘭氏陰性菌，研究表明CHF患者Escherichia-Shigella豐度增高［16］。而在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Escherichia-Shigella豐度與心肌酶水平、促炎因子、心臟損傷指標(biāo)呈正相關(guān)，與心臟功能和線粒體能量標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)［19］。推測Escherichia-Shigella豐度增高引起過度炎癥會加重心力衰竭進(jìn)展。此外，相關(guān)性分析表明Bacteroides與BNP呈負(fù)相關(guān)；Romboutsia、Fusobacterium、Phascolarctobacterium與BNP和PAGln呈負(fù)相關(guān)。Fusobacterium是一類能產(chǎn)丁酸的細(xì)菌，丁酸能促進(jìn)腸道合成粘蛋白，保護(hù)腸黏膜的完整性［20］。有研究發(fā)現(xiàn)Romboutsia與收縮壓呈負(fù)相關(guān)，能促進(jìn)丁酸鹽合成［21］。Bacteroides是產(chǎn)生短鏈脂肪酸（short-chainfatty acids，SCFAs）的細(xì)菌之一，能抑制腸內(nèi)皮質(zhì)酮合成從而發(fā)揮降壓作用［22］。丁酸鹽在小鼠模型中可以抑制高血壓誘導(dǎo)的心臟炎性反應(yīng)、心肌肥大和纖維化［20］。Phascolarctobacterium與IL-6水平呈負(fù)相關(guān)，能減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心臟纖維化［23］。炎癥、心肌肥大和心肌纖維化是心力衰竭的基本病理機(jī)制，心力衰竭時(shí)腸壁通透性增高，致病菌及內(nèi)毒素更易釋放入血，進(jìn)一步刺激炎癥和免疫反應(yīng)激活。PAGln則可通過調(diào)節(jié)腎上腺素能受體信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致交感神經(jīng)系統(tǒng)過度激活，加劇心力衰竭進(jìn)展，同時(shí)其已被證明與產(chǎn)生SCFAs的腸道菌群（如毛螺菌科和雙歧桿菌科等）呈負(fù)相關(guān)［24］。SCFAs是膳食纖維通過盲腸和近端結(jié)腸中的厭氧細(xì)菌發(fā)酵而來。研究表明，去氧皮質(zhì)酮處理后的小鼠模型左心室壁肥厚均能通過高纖維飲食和醋酸纖維飲食而明顯降低［25］。還有研究發(fā)現(xiàn)，SCFAs能通過G蛋白偶聯(lián)受體通道介導(dǎo)，從而對Akt2基因敲除小鼠所引起的心肌細(xì)胞收縮功能障礙起到有益作用；還可通過抑制組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC），從而增加T細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，達(dá)到抗炎作用［26-27］。由此認(rèn)為，Bacteroides、Romboutsia、Fusobacterium、Phascolarctobacterium均可產(chǎn)生SCFAs并通過作用于G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮抑制炎癥過度反應(yīng)和心肌纖維化。

綜上所述，SCFAs患者中存在腸道菌群紊亂，物種多樣性降低，存在特異性差異菌屬，這些結(jié)果表明心力衰竭時(shí)腸道菌群正常功能受損會加重疾病發(fā)展。另外，腸道菌群代謝產(chǎn)物PAGln水平的高低可能反映心力衰竭的嚴(yán)重程度，可以作為早期篩查、診斷及治療指標(biāo)。此外，菌群移植治療已在腸易激綜合征、肥胖、糖尿病以及阿爾茨海默病等患者中使用，隨著該治療技術(shù)的成熟，未來可能成為心力衰竭治療的新方向。

作者貢獻(xiàn)：張振東進(jìn)行資料收集整理并撰寫論文；張振東、蔡斌整理數(shù)據(jù)；蔡斌、王宏偉進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；喬增勇進(jìn)行論文的修訂、質(zhì)量控制及審校，對文章負(fù)責(zé)。

本文無利益沖突。

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（收稿日期：2022-08-17；修回日期：2023-04-12）

（本文編輯：賈萌萌）