基于PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路探討井穴放血對(duì)急性高原低氧腦損傷的保護(hù)作用＊

李夢(mèng)馨，王 超，童 麗，灑玉萍，任延明，李永平

（青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部中醫(yī)系，青海省糖脂代謝疾病防控中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 西寧 810001）

高原環(huán)境會(huì)造成機(jī)體內(nèi)許多重要臟器的損傷，其中大腦生理功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)需要氧氣與能量的不間斷供應(yīng)，對(duì)缺氧耐受性極差。當(dāng)機(jī)體急進(jìn)高原低氧環(huán)境中時(shí)，腦組織首當(dāng)其沖受到缺氧損傷[1]。缺氧環(huán)境下線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性遭到破壞，電子傳遞鏈運(yùn)輸障礙，氧化磷酸化能力異常，能量合成不足，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）大量生成，激活線粒體自噬[2]。線粒體自噬作為機(jī)體一種自我保護(hù)的適應(yīng)性機(jī)制可以清除受損線粒體，維持線粒體功能穩(wěn)定，減輕急性高原低氧腦損傷。

井穴位于肢體末端，為臟腑、經(jīng)氣生發(fā)之源，所選取的手十二井穴所屬經(jīng)脈與腦聯(lián)系密切，具有醒腦開竅、活血祛瘀、振奮陽(yáng)氣之功效。臨床使用井穴治療腦病由來(lái)已久，本課題組的前期實(shí)驗(yàn)表明井穴放血通過(guò)調(diào)控線粒體自噬水平保護(hù)急性高原低氧腦損傷[3]，近年來(lái)許多研究也表明井穴放血對(duì)不同類型的腦損傷起到保護(hù)作用[4-6]。但目前對(duì)急性高原低氧腦損傷研究較少，且井穴放血保護(hù)急性高原低氧腦損傷的具體作用機(jī)制仍未完全明確，需要進(jìn)一步探索。因此本研究使用低壓氧艙減壓至6000 m 海拔高度，將實(shí)驗(yàn)大鼠低壓低氧處理72 h 復(fù)制急性高原低氧腦損傷大鼠模型，對(duì)比不同處理方法對(duì)急性高原低氧腦損傷大鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、海馬組織超微結(jié)構(gòu)、自噬體形成、海馬組織細(xì)胞凋亡情況及PI3K/AKT/mTOR 通路相關(guān)分子表達(dá)的影響來(lái)探究井穴放血對(duì)急性高原低氧腦損傷的保護(hù)作用機(jī)制，為實(shí)驗(yàn)研究及臨床防治急性高原低氧腦損傷提供新思路及理論支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1天。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

HE 染液：武漢塞維爾生物科技有限公司；812 環(huán)氧樹脂包埋套裝、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛染液：北京中鏡科儀技術(shù)有限公司；四氧化鋨：徠卡；DAPI 染色液：北京雷根生物有限公司；檸檬酸鹽修復(fù)液：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑盒：Roche Group；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、細(xì)胞裂解液：Beyotime；預(yù)染蛋白Marker、AKT 抗體：ABClone；ECL 發(fā)光試劑盒：Affinity；Glycine、SDS、Tris for molecular biology：德國(guó)Biofroxx；RNA TRIzol Reagent：合肥博美生物科技有限公司；Prime Script RT reagent Kit、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ：北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；PI3K、mTOR抗體：Abcam。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

低壓氧艙（中航風(fēng)雷），RS36型全自動(dòng)染色機(jī)（常州派斯杰），數(shù)碼三目攝像顯微鏡（Panthera，麥克奧迪），透射電子顯微鏡（JEM-1400FLASH，日本電子JEOL），數(shù)字切片掃描儀（Pannoramic 250，3DHISTECH（Hungary）），電泳儀（JY200C，北京君意），化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（5200，上海天能），實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x（PIKORed 96，ThermoFisher），全功能酶標(biāo)儀（MK3，ThermoFisher）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與操作

2.1.1 動(dòng)物分組

隨機(jī)分為對(duì)照組（Control 組）和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為模型組（Model 組）、井穴放血組（BAJP 組）、非穴位放血組（BANA組），每小組15只。

2.1.2 操作方法

BAJP 組大鼠用采血針按少商、商陽(yáng)、中沖、關(guān)沖、少?zèng)_、少澤的順序，先左前肢，后右前肢，點(diǎn)刺穴位放血。依照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的“動(dòng)物針灸穴位圖譜”定位。BANA 組大鼠剪尾尖放血，兩組放血量均為15-20 μL。Control 組、Model 組大鼠抓取10秒。以上操作均每日1次，連續(xù)7天。

2.2 急性高原低氧腦損傷大鼠造模方法

將低壓氧艙減壓至6000 m 海拔高度，實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)過(guò)低壓低氧處理72 h 后取出，期間動(dòng)物自由飲水及進(jìn)食。

2.3 取材及指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 取材

對(duì)照組大鼠分組后即取材，實(shí)驗(yàn)組大鼠低壓低氧72 h 出艙后立刻取材。實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射20%烏拉坦麻醉后取腦，2 只大鼠全腦組織固定于10%多聚甲醛中；3 只大鼠在冰臺(tái)上分離海馬，固定于3%戊二醛溶液中。余大鼠取全腦組織保存于-80℃冰箱中，用于后續(xù)Western blot、PCR相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

2.3.2 腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，切片后脫蠟至水，蘇木精染色，鹽酸酒精分化后返藍(lán)，伊紅染色后脫水、透明，中性樹膠封固，光鏡觀察。

2.3.3 海馬組織超微結(jié)構(gòu)變化、神經(jīng)元細(xì)胞損傷及自噬體形成情況

樣品經(jīng)3%戊二醛預(yù)固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級(jí)脫水，Ep812包埋，醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察。

2.3.4 海馬組織細(xì)胞凋亡情況

標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，切片后脫蠟至水，檸檬酸微波修復(fù)，PBS 充分清洗后于暗處入熒光TUNEL 孵育液37℃孵育1 h，DAPI染核，甘油明膠封片，鏡檢。

2.3.5 PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)情況

按1:10 質(zhì)量比將樣本與RIPA 裂解液放入研磨管，研磨后入4℃冰箱裂解30 min，12000 r·min-1離心10 min，取上清液用BCA 法測(cè)定樣品蛋白濃度。取樣本進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入1:2000 稀釋過(guò)的PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 和1:100000 的β-actin 4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜，放二抗（1:5000），室溫孵育2 h，TBST洗膜，加ECL發(fā)光液，曝光掃描，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.3.6 AKT、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量

樣本總RNA 使用TRIzol 法常規(guī)提取，反轉(zhuǎn)錄完成后加入熒光定量PCR 試劑擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，通過(guò)2-△△CT計(jì)算mTOR、AKT相對(duì)mRNA表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列表

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的方式表示，組間采用單因素方差分析，多重兩兩比較方差齊時(shí)使用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)使用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 井穴放血對(duì)大鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

HE 染色觀察大鼠海馬CA1 區(qū)的病理變化。常氧狀態(tài)下大鼠海馬CA1 區(qū)未見明顯細(xì)胞壞死，錐體細(xì)胞層排列正常。低壓低氧處理72 h 后的大鼠海馬CA1區(qū)可見錐體細(xì)胞大量變性壞死，正常細(xì)胞數(shù)量顯著減少，排列紊亂。經(jīng)過(guò)井穴放血治療后，AHH 大鼠海馬CA1 區(qū)的壞死錐體細(xì)胞數(shù)量明顯減少，非穴位放血組治療后的AHH 大鼠海馬CA1 區(qū)的錐體細(xì)胞壞死情況無(wú)明顯改善。具體見圖1。

圖1 腦錐體細(xì)胞變性壞死

3.2 井穴放血對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)及線粒體自噬體形成情況的影響

海馬組織損傷主要表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞凋亡、線粒體腫脹和胞漿內(nèi)出現(xiàn)自噬，按照嚴(yán)重程度的趨勢(shì)為：Model組、BANA 組>BAJP 組>Control組，按照自噬體數(shù)量的趨勢(shì)為：BAJP 組>Model 組、BANA 組>Control 組。具體見圖2。

圖2 大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變及線粒體自噬體的形成情況

3.3 井穴放血對(duì)大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡情況的影響

分析圖3，其中綠色為凋亡細(xì)胞核，藍(lán)色為正常細(xì)胞核?？梢钥闯黾?xì)胞凋亡比率由高到底分別為Model組>BANA組>BAJP組>Control組。與Control組大鼠相比，Model 組大鼠海馬CA1 區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)量增加；井穴放血治療后，AHH 大鼠的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少；非穴位放血治療對(duì)AHH 大鼠的細(xì)胞凋亡沒有明顯作用。具體見圖3。

圖3 大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡情況

3.4 井穴放血對(duì)大鼠海馬PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路各分子表達(dá)水平的影響

相較于常氧狀態(tài)下的大鼠，急性高原低氧腦損傷大鼠海馬組織細(xì)胞內(nèi)PI3K、AKT、mTOR分子的磷酸化水平顯著降低（P<0.01），井穴放血治療進(jìn)一步降低了AHH 大鼠這些分子的磷酸化水平（P<0.01），非穴位放血療法對(duì)各分子磷酸化水平并未產(chǎn)生明顯作用，與BAJP 組結(jié)果存在明顯差異（P<0.01），以上趨勢(shì)通過(guò)PCR 檢測(cè)AKT、mTOR mRNA 獲得了進(jìn)一步的證實(shí)。具體見圖4。

圖4 各組大鼠海馬組織PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)及AKT、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

4 討論

機(jī)體急進(jìn)高原低氧環(huán)境會(huì)損傷腦、肺、胃腸等許多重要臟器[7-8]，不耐缺氧的腦組織會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞膜鈉泵異常、血腦屏障受損、腦血流量增加、腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞、機(jī)體炎癥反應(yīng)等改變，導(dǎo)致急性高山病、高原性頭痛、高原性腦水腫等高原腦病。主要觀察的海馬CA1 區(qū)作為腦部對(duì)氧氣狀態(tài)最敏感的區(qū)域，又稱為易損區(qū)，隨著海拔升高、缺氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，其受損傷程度加重[9]。腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中含有大量線粒體，為腦功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)及神經(jīng)元細(xì)胞中神經(jīng)遞質(zhì)的合成、有氧代謝等生理活動(dòng)提供了能量支持，受到缺氧損害時(shí)會(huì)出現(xiàn)電子運(yùn)輸鏈障礙，氧化磷酸化功能異常，導(dǎo)致能量供應(yīng)不足、ROS 大量產(chǎn)生，機(jī)體出現(xiàn)記憶力下降、認(rèn)知功能受損等腦損傷表現(xiàn)[10]。線粒體自噬是異常狀態(tài)下受損線粒體膜電位發(fā)生變化，在細(xì)胞一些機(jī)制的作用下被識(shí)別后包裹入自噬體內(nèi)，與溶酶體結(jié)合后降解成營(yíng)養(yǎng)成分供給細(xì)胞循環(huán)利用，以此來(lái)控制線粒體數(shù)量與質(zhì)量，保證能量的正常供應(yīng)及機(jī)體功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)[11]。線粒體自噬作為細(xì)胞自我調(diào)節(jié)的適應(yīng)性機(jī)制維持著細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，但其保護(hù)急性高原低氧腦損傷的分子機(jī)制未完全明確，需進(jìn)一步探索。

急性高原低氧腦損傷在中醫(yī)學(xué)中并無(wú)對(duì)應(yīng)的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬于“頭痛”、“眩暈”等范疇。在中醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)中，由于高原地區(qū)氧氣稀薄、氣候寒冷、大風(fēng)干燥等特點(diǎn)，導(dǎo)致宗氣不足、氣虛運(yùn)血無(wú)力；寒性凝滯、血運(yùn)不暢；燥邪傷津耗氣，津血同源，血脈不充，產(chǎn)生瘀血，因此我們將急性高原低氧腦損傷辨證為“氣虛血瘀證”。《針灸大成》曰：“凡初中風(fēng)跌倒，卒暴昏沉，痰涎壅滯，不省人事，……急以三棱針，刺手十指十二井穴，當(dāng)去惡血。”表明手十二井穴可用來(lái)急救腦卒中昏迷，有效保護(hù)腦損傷。本課題組前期研究表明井穴放血可以通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α/BNIP3 通路促進(jìn)線粒體自噬水平升高，保護(hù)急性高原低氧腦損傷[6]。眾多研究[12-16]亦表明井穴放血可以調(diào)節(jié)神經(jīng)功能，清除腦組織中過(guò)量產(chǎn)生的氧自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷，增強(qiáng)大腦耐缺氧能力，抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，改善認(rèn)知功能，改善腦組織的缺血缺氧狀態(tài)，且對(duì)腦血流量具有雙向調(diào)節(jié)作用。因此，我們結(jié)合中醫(yī)學(xué)對(duì)高原環(huán)境的認(rèn)識(shí)，以“治未病”思想為指導(dǎo)，結(jié)合經(jīng)絡(luò)學(xué)說(shuō)、標(biāo)本根結(jié)理論及現(xiàn)代研究結(jié)果等，探究活血祛瘀、醒腦開竅、振奮陽(yáng)氣之手十二井穴對(duì)急性高原低氧腦損傷的保護(hù)作用。

磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）與其下游分子蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）對(duì)細(xì)胞的增殖、自噬、凋亡起著重要的調(diào)控作用。近些年一些研究表明，PI3K/AKT/mTOR通路與應(yīng)激狀態(tài)下線粒體穩(wěn)態(tài)有著密不可分的聯(lián)系，對(duì)線粒體自噬起著負(fù)向調(diào)控作用[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，27-P-CAUA可以抑制HER2/PI3K/AKT信號(hào)通路誘發(fā)線粒體自噬[19]。激活PI3K/AKT 信號(hào)通路可以抑制細(xì)胞凋亡，減輕神經(jīng)元細(xì)胞氧化損傷和海馬組織萎縮，改善阿爾茨海默病大鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知功能[20]，亦可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來(lái)影響細(xì)胞自噬與凋亡[21-22]。這些結(jié)果表明PI3K/AKT/mTOR 通路可能與腦損傷中線粒體自噬調(diào)控有著重要關(guān)系，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，低壓氧艙模擬6000 m 高原環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠低壓低氧處理72 h，大鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)受損，海馬組織顯微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著損傷，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、線粒體腫脹、自噬體出現(xiàn)，證明成功構(gòu)建了急性高原低氧腦損傷大鼠模型。觀察到井穴放血治療后的AHH 大鼠海馬CA1 區(qū)變性壞死的錐體細(xì)胞及海馬組織凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少、線粒體腫脹減輕、自噬體數(shù)量顯著增多，而非穴位放血療法對(duì)AHH大鼠腦損傷無(wú)明顯改善作用，這表明井穴放血保護(hù)急性高原低氧腦損傷具有穴位特殊性。AHH 大鼠海馬組織細(xì)胞內(nèi)PI3K、AKT、mTOR3 個(gè)分子磷酸化水平明顯下降，PI3K/AKT/mTOR 通路在缺氧環(huán)境中被抑制，結(jié)合電鏡觀察到線粒體腫脹、自噬體數(shù)量增多，說(shuō)明線粒體自噬作為機(jī)體自我保護(hù)機(jī)制被激活了。經(jīng)過(guò)井穴放血治療后，3 個(gè)分子磷酸化水平進(jìn)一步下降，同時(shí)觀察到海馬組織內(nèi)變性壞死錐體細(xì)胞和海馬組織凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少、線粒體腫脹程度減輕、自噬體數(shù)量進(jìn)一步增加，表明井穴放血可以通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)線粒體自噬水平升高，改善線粒體生理，維持線粒體的動(dòng)態(tài)平衡，抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，保護(hù)急性高原低氧腦損傷。非穴位放血療法對(duì)3個(gè)分子磷酸化水平?jīng)]有明顯影響，進(jìn)一步說(shuō)明井穴放血保護(hù)急性高原低氧腦損傷存在穴位特殊性。以上趨勢(shì)通過(guò)PCR 中AKT、mTOR mRNA表達(dá)水平也可進(jìn)一步獲得證實(shí)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)表明，機(jī)體急進(jìn)高原缺氧環(huán)境中時(shí)，海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞損傷，線粒體電子傳遞鏈障礙，氧化磷酸化能力受到影響，無(wú)法為機(jī)體提供足量ATP，過(guò)量氧自由基產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定造成極大的破壞，細(xì)胞為維護(hù)其穩(wěn)態(tài)，PI3K/AKT/mTOR 通路被抑制，線粒體自噬激活。十二井穴刺絡(luò)放血療法進(jìn)一步抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路各分子表達(dá)，促進(jìn)線粒體自噬水平升高，清除過(guò)量產(chǎn)生的ROS，增強(qiáng)機(jī)體抗細(xì)胞凋亡、耐缺氧的能力，從而保證細(xì)胞生理功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。

綜上所述，井穴放血可以對(duì)急性高原低氧腦損傷起到保護(hù)作用，具有穴位特殊性，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路促進(jìn)線粒體自噬水平升高實(shí)現(xiàn)的。本研究為防治急性高原低氧腦損傷提供了有效靶點(diǎn)及新思路，為井穴放血的臨床使用提供了理論支持。本實(shí)驗(yàn)僅將井穴放血與非穴位放血作對(duì)比，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將考慮加入穴位對(duì)照組，并從多組學(xué)角度探究不同穴位對(duì)急性高原低氧腦損傷保護(hù)作用的差異。