• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    橄欖苦苷通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路緩解小鼠妊娠糖尿?。?/h1>
    2023-12-28 03:29:40陳俊芳陳愛(ài)香
    關(guān)鍵詞:橄欖氧化應(yīng)激葡萄糖

    陳俊芳,王 霞,姚 霞,李 靜,陳愛(ài)香

    (1. 長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院 長(zhǎng)治 046000;2. 長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院 長(zhǎng)治 046000)

    妊娠期糖尿?。℅DM)表現(xiàn)為妊娠期不同程度的高血糖,GDM的發(fā)病率很高,是迄今為止導(dǎo)致新生兒和孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一[1]。GDM 的病因尚未完全闡明,以往的研究表明,胎盤(pán)分泌的激素如胎盤(pán)催乳素(HPL)、雌激素和黃體酮等對(duì)胰島素的拮抗作用是導(dǎo)致GDM發(fā)病的主要原因[2]。在治療糖尿病時(shí),胰島素主要用于降低血糖,但胰島素的劑量因人而異,除了胰島素抵抗外,還影響了其在減少母嬰并發(fā)癥方面的效果[3]。因此,尋找新的具有降低血糖和對(duì)抗胰島素抵抗能力的藥物,是臨床上治療GDM亟需解決的問(wèn)題。

    橄欖苦苷(Oleuropein,Ole)是一種類(lèi)環(huán)烯醚萜,是橄欖葉、種子、果肉和未成熟橄欖果皮中最主要的酚類(lèi)成分,因其抗炎、抗氧化、抗腫瘤以及心臟和神經(jīng)保護(hù)作用而被廣泛應(yīng)用于臨床[4-5]。胎盤(pán)炎癥和氧化應(yīng)激與GDM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),兩者在塑造胎兒環(huán)境中起著至關(guān)重要的作用[6]。在正常妊娠中炎癥受到高度調(diào)節(jié),這對(duì)于維持良好的胎兒發(fā)育環(huán)境至關(guān)重要。研究表明GDM 與胎盤(pán)營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和活性失調(diào)有關(guān),這可能源于胎盤(pán)、母親和胎兒的炎癥狀態(tài)改變。先前的研究已經(jīng)證明橄欖苦苷在不同的糖尿病動(dòng)物模型中的功效,例如四氧嘧啶[7]誘導(dǎo)的和肥胖[8]誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型,使橄欖苦苷成為GDM臨床治療的潛在藥物。

    腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是能量代謝的關(guān)鍵酶,可調(diào)節(jié)脂肪組織、肝臟和骨骼肌中葡萄糖和脂質(zhì)的攝取、儲(chǔ)存和利用[9]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抑制AMPK 信號(hào)傳導(dǎo)與胰島素抵抗、炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)[10-11]。AMPK還參與調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα),它們是脂肪生成的中心調(diào)節(jié)劑[12]。因此,激活A(yù)MPK的藥物可能會(huì)逆轉(zhuǎn)肥胖相關(guān)代謝疾病的影響,例如2型糖尿病和胰島素抵抗[13]。先前的研究還指出AMPK 抑制和葡萄糖攝取減少之間的聯(lián)系,這是導(dǎo)致高血糖的一個(gè)重要因素[14]。因此,AMPK激活劑已成為研發(fā)糖尿病和肥胖癥等代謝疾病治療劑的重點(diǎn)。鑒于AMPK在GDM中的重要作用以及橄欖苦苷在激活A(yù)MPK信號(hào)傳導(dǎo)中的潛力,有必要對(duì)橄欖苦苷緩解GDM的作用進(jìn)行全面評(píng)估。

    在本研究中,旨在研究橄欖苦苷在GDM小鼠模型中的治療作用。在有或沒(méi)有橄欖苦苷治療的GDM 小鼠中比較了GDM癥狀,包括增加的血糖水平、體質(zhì)量、血漿胰島素水平和肝糖原含量。通過(guò)測(cè)量肝臟氧化應(yīng)激標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)氧化應(yīng)激水平,通過(guò)檢測(cè)血清和骨骼肌中IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 的水平來(lái)評(píng)估炎癥水平。還研究了AMPK 信號(hào)通路與橄欖苦苷治療之間的聯(lián)系,以探索橄欖苦苷緩解GDM 癥狀的機(jī)制。該研究的結(jié)果可以深入了解橄欖苦苷緩解GDM癥狀的功效,并為其臨床轉(zhuǎn)化鋪平道路。

    1 材料和方法

    1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

    6-8 周齡的C57BL/KsJ Lepdb/+(db/+)和C57BL/KsJ+/+(WT)小鼠購(gòu)自Jackson Laboratories。喂食高脂肪飲食(17%脂肪、47%碳水化合物和29%蛋白質(zhì),Harlan Teklad)。將小鼠安置在溫度為22±2℃的無(wú)菌環(huán)境中,保持12 h 光照和12 h 黑暗循環(huán),自由獲取食物和水。10-12 周齡的雌性小鼠在單獨(dú)的籠子中交配,交配后的第2 天表示為妊娠天(GD0)。妊娠小鼠隨機(jī)分組如下:正常妊娠對(duì)照組(WT小鼠),GDM組C57BL/KsJ Lepdb/+(db/+),GDM+橄欖苦苷組(10 mg·kg-1·d-1,腹腔注射),正常妊娠對(duì)照組和GDM 組腹腔注射等量生理鹽水。在GD15 進(jìn)行腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(GTT)和腹腔胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(ITT)測(cè)定,并檢測(cè)炎癥因子水平和血清葡萄糖含量。

    1.2 腹腔內(nèi)葡萄糖和胰島素耐量試驗(yàn)

    GTT 和ITT 在GD15 進(jìn)行。對(duì)于GTT,在禁食6 h后以2.0 g·kg-1的劑量腹腔注射葡萄糖,使用ACCUCHEK 血糖儀(Roche Diagnostics,Switzerland)測(cè)量基線和葡萄糖注射后(注射后30、60、90 和120 min)的血糖水平。對(duì)于ITT,在禁食6 h 后以0.75 U·kg-1的劑量腹腔注射胰島素,并在基線和胰島素注射后(注射后30、60、90和120 min)測(cè)量血糖水平。

    1.3 肝糖原含量的測(cè)量

    根據(jù)制造商(BioVision,San Francisco,LA)的方案使用商業(yè)試劑盒處理肝組織,將肝裂解物與分析試劑混合后,使用酶標(biāo)儀(Spectra Max 384,USA)測(cè)量肝糖原在340 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

    1.4 血清葡萄糖和胰島素測(cè)量

    分別于GD0、9、18 使用血糖儀測(cè)量葡萄糖水平,并用超靈敏小鼠胰島素ELISA 試劑盒(ALP CO Diagnostics,Salem,NH)分析血漿胰島素水平。

    1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

    在GD18,根據(jù)制造商的方案,使用ELISA 試劑盒測(cè)量小鼠血清IL-1β(MLB00C,R&D Systems)、IL-6(SM6000B,R&D Systems)、TNF-α(SMTA00B,R&D Systems)和MCP-1(MJE00B,R&D Systems)的水平。

    1.6 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)

    使用TRIzol 試劑(Thermo Fisher)提取細(xì)胞總RNA,根據(jù)制造商的方案,使用cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa Bio,China)將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)(TaKaRa Bio,China)進(jìn)行操作,以GAPDH 做為內(nèi)參,每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物如下:IL-6 正向5’-TGTGCTTTCTGGAGGGTCTACT-3’,反向5’-TGCCTCATCACCAACCATA AG-3’;IL-1β 正向5’-AGTAGCAGCGGTGGAAGT-3’,反向5’-CTTCC TGTATGTGCACTGGCGGTCCT-3’;TNF-α正向5’-GT CAGAAGACAAGATCACCGGA-3’,反向5’-AGGTGC ATTGATCACACCGA-3’;MCP-1正向5’-GGGTATTA GGGTTGGAATTTAATGT-3’,反向5’-CTTCCTTCTAA TTATTTCCATTTCTCTCA-3’;GAPDH正向5’-CTGG GCTACACTGAGCACC-3’,反向5’-AAGTGGTCGTTG AGGGCAATG-3’。qPCR 的反應(yīng)條件設(shè)置為:95℃預(yù)變性5 min,然后進(jìn)行39 個(gè)循環(huán)的95℃下變性30 s,60℃下退火30 s,72℃下延伸60 s。采用相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt的方法處理數(shù)據(jù)。

    1.7 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)

    從肝組織中提取蛋白質(zhì)樣品,用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)(碧云天,上海)蛋白質(zhì)濃度。進(jìn)行SDSPAGE電泳,將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜,使用5%的脫脂奶粉封閉1 h。TBST洗膜3次,加入相應(yīng)的一抗:AMPK(ab32047,1∶1000,Abcam),p-AMPK(ab92701,1∶1000,Abcam),HDAC4(ab235583,1∶1000,Abcam),p-HDAC4(ab39408,1∶1000,Abcam),G6Pase(ab93857,1∶1000,Abcam),β-actin(ab8226,1∶1000,Abcam),在4℃孵育過(guò)夜。TBST 洗膜后,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,孵育1 h。ECL 底物化學(xué)發(fā)光顯色后用Image J軟件進(jìn)行條帶分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,兩組之間的比較通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),然后進(jìn)行Tukey 事后檢驗(yàn),P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 橄欖苦苷可以改善GDM小鼠的糖尿病癥狀

    首先,評(píng)估橄欖苦苷對(duì)整個(gè)妊娠期GDM小鼠體質(zhì)量和血糖水平的影響。如圖1A 所示,3 組小鼠在懷孕期間體質(zhì)量均有所增加。GD18,橄欖苦苷治療的GDM 小鼠的體質(zhì)量明顯低于GDM 組小鼠,表明橄欖苦苷治療阻止了GDM 小鼠體質(zhì)量的增加。相應(yīng)地,GDM 小鼠從GD0 到GD18 的體質(zhì)量增加顯著高于正常組小鼠(圖1B)。正常妊娠小鼠的血清葡萄糖水平在GD0、9 和18 保持穩(wěn)定。與正常組小鼠相比,GDM小鼠在GD0、9和18的血糖水平顯著升高,橄欖苦苷治療顯著降低了GDM 小鼠GD9、18的血糖水平(圖1C)。數(shù)據(jù)表明橄欖苦苷改善了GDM小鼠的糖尿病癥狀。

    圖1 橄欖苦苷對(duì)GDM小鼠的糖尿病癥狀的影響(n=5)

    2.2 橄欖苦苷可以改善GDM 小鼠的葡萄糖和胰島素耐受性

    檢測(cè)橄欖苦苷對(duì)GDM 小鼠葡萄糖和胰島素耐受性的影響。在葡萄糖注射前,與正常組小鼠相比,GDM 小鼠的血糖水平顯著升高,橄欖苦苷治療組小鼠血糖水平較GDM 組顯著下降。注射葡萄糖后,3 小鼠血糖均升高。在葡萄糖注射后的所有4 時(shí)間點(diǎn)(30、60、90 和120 min),GDM 組小鼠的血糖水平均顯著高于正常組小鼠,并且橄欖苦苷顯著降低了GDM小鼠的血糖水平(圖2A)。相應(yīng)地,GDM 小鼠的葡萄糖曲線下面積(AUC)明顯大于正常組小鼠,橄欖苦苷治療組小鼠的AUC 顯著小于GDM 組小鼠。因此,數(shù)據(jù)表明橄欖苦苷改善了GDM 小鼠的葡萄糖耐量。如圖2B所示,注射胰島素導(dǎo)致所有小鼠的血糖水平降低。GDM組小鼠在注射胰島素后30、60、90和120 min的血糖水平顯著高于正常組小鼠,橄欖苦苷治療在所有4時(shí)間點(diǎn)都顯著降低了GDM小鼠的血糖水平。相應(yīng)地,橄欖苦苷治療組小鼠的AUC 顯著低于GDM 小鼠。表明橄欖苦苷改善了GDM小鼠的葡萄糖和胰島素耐受性。

    圖2 橄欖苦苷對(duì)GDM小鼠的葡萄糖和胰島素耐受性的影響(n=5)

    2.3 橄欖苦苷抑制GDM小鼠的炎癥

    為評(píng)估橄欖苦苷對(duì)GDM小鼠炎癥的影響,首先監(jiān)測(cè)了血清中炎癥細(xì)胞因子的水平。與正常組小鼠相比,GDM 小鼠的血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 和MCP-1水平都顯著升高。與GDM組小鼠相比,橄欖苦苷治療組小鼠血清中這些炎癥因子的水平顯著降低(圖3A-3D)。在骨骼肌中也得到了相同的結(jié)果(圖3E)。表明橄欖苦苷可以抑制GDM小鼠的炎癥。

    圖3 橄欖苦苷對(duì)GDM小鼠炎癥的影響(n=5)

    2.4 橄欖苦苷促進(jìn)肝臟中AMPK活化

    為了研究橄欖苦苷治療GDM 的潛在機(jī)制,在GD18 時(shí)取小鼠肝臟組織,通過(guò)Western blot 檢測(cè)橄欖苦苷對(duì)AMPK 信號(hào)通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組小鼠相比,GDM 組小鼠的AMPK 活化受到抑制,而橄欖苦苷顯著恢復(fù)了p-AMPK 的表達(dá)。組蛋白去乙?;?(HDAC4)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)是糖代謝中的關(guān)鍵酶,發(fā)現(xiàn)在GDM 小鼠中,HDAC4 激活和G6Pase 表達(dá)水平上調(diào),而橄欖苦苷治療可以逆轉(zhuǎn)AMPK 相關(guān)蛋白的激活模式,降低G6Pase 的表達(dá),見(jiàn)圖4。表明橄欖苦苷對(duì)GDM 小鼠的治療作用可能是通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路介導(dǎo)的。

    圖4 橄欖苦苷對(duì)AMPK信號(hào)通路的影響(n=5)

    2.5 橄欖苦苷改善GD小鼠的生殖結(jié)果

    為了解橄欖苦苷對(duì)妊娠結(jié)局的影響,檢查了各組小鼠的產(chǎn)仔數(shù)和出生體質(zhì)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷顯著恢復(fù)了GDM 組小鼠增加的出生體質(zhì)量(圖5A)和減少的產(chǎn)仔數(shù)(圖5B),表明橄欖苦苷的抗炎和抗氧化作用轉(zhuǎn)化為GDM小鼠妊娠結(jié)局的改善。

    3 討論

    GDM 是妊娠期間由胰島素抵抗和胰腺β 細(xì)胞功能障礙引起的一種暫時(shí)性葡萄糖不耐受形式,是最常見(jiàn)的妊娠并發(fā)癥之一,與孕產(chǎn)婦和新生兒結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)的顯著增加有關(guān),GDM 女性的后代更有可能患上糖尿病和代謝綜合征[15]。目前治療GDM 的方案十分有限,胰島素是主要的治療方法,但會(huì)導(dǎo)致低血糖的發(fā)生,并且和不良的胎盤(pán)、胎兒和母體結(jié)局相關(guān)[16]。雖然二甲雙胍能有效治療GDM,但它可以穿過(guò)胎盤(pán),對(duì)胎兒的長(zhǎng)期影響未知[17]。因此,迫切需要尋找能有效治療GDM且副作用小的藥物。

    橄欖苦苷是橄欖果實(shí)、葉子、樹(shù)枝和油中最活躍的酚類(lèi)化合物之一,具有多種生物學(xué)功能。由于橄欖苦苷在臨床前和臨床研究中對(duì)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的有益作用,越來(lái)越多的研究集中在橄欖苦苷的抗糖尿病功能上[18]。在本研究中,使用GDM 小鼠模型評(píng)估橄欖苦苷對(duì)GDM癥狀(母體體質(zhì)量和血糖)、葡萄糖和胰島素耐量的治療作用。結(jié)果證明橄欖苦苷通過(guò)顯著降低體質(zhì)量和血糖水平來(lái)緩解GDM小鼠的癥狀,并且改善了葡萄糖和胰島素耐受性。此外,橄欖苦苷還通過(guò)降低出生體質(zhì)量和增加產(chǎn)仔數(shù)來(lái)改善GDM 小鼠的生殖結(jié)局。這些結(jié)果展現(xiàn)出了橄欖苦苷對(duì)GDM的保護(hù)作用,表明橄欖苦苷可能作為治療GDM的潛在藥物。

    炎癥和氧化應(yīng)激與母體胰島素抵抗的增加有關(guān),是導(dǎo)致GDM 發(fā)病的兩個(gè)主要因素[19],研究發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷能夠恢復(fù)升高的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平。懷孕期間炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的失調(diào)可能是孕婦激素水平和能量代謝改變的結(jié)果[20],增加的激素產(chǎn)生可以促進(jìn)脂肪分解,進(jìn)而導(dǎo)致炎癥因子分泌、脂質(zhì)代謝和葡萄糖代謝異常以及胰島素抵抗,并且失調(diào)的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化也可能導(dǎo)致過(guò)度的氧化應(yīng)激,從而進(jìn)一步破壞胎兒發(fā)育環(huán)境[21]。TNF-α是炎癥反應(yīng)中最早的細(xì)胞因子之一,被認(rèn)為是胰島素抵抗的預(yù)測(cè)因子[22]。此外,TNF-α作為起始因子并激活I(lǐng)L-6的分泌,IL-6是炎癥反應(yīng)中重要的促炎因子,GDM 患者處于慢性炎癥狀態(tài),血清中IL-6和TNF-α等炎癥因子水平顯著高于正常妊娠[23]。在目前的研究中,證實(shí)GDM 小鼠的IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平顯著升高,橄欖苦苷治療后,GDM 小鼠肝臟中的氧化應(yīng)激水平,以及血清和骨骼肌中的炎癥水平都顯著降低。許多研究描述了TNF-α 在胰島素抵抗的病理生理學(xué)中的直接作用[24]。與先前的研究結(jié)果一致,證明骨骼肌中TNF-α 的產(chǎn)生增加導(dǎo)致GDM小鼠的胰島素敏感性降低,而橄欖苦苷抑制TNF-α 的產(chǎn)生并改善GDM 小鼠的胰島素敏感性??傊?,這些數(shù)據(jù)證實(shí)了橄欖苦苷的抗氧化和抗炎效力,以及在GDM小鼠中的治療作用。

    AMPK 是調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的關(guān)鍵代謝酶,運(yùn)動(dòng)和離體收縮可以激活A(yù)MPK 并刺激骨骼肌吸收葡萄糖,已有多項(xiàng)研究表明激活A(yù)MPK 通路可以增加胰島素敏感性,從而改善糖尿病癥狀[25-26]。為了探索橄欖苦苷治療GDM 的分子機(jī)制,重點(diǎn)研究了AMPK 信號(hào)通路。研究結(jié)果表明GDM 小鼠的AMPK 活化受損,這可能導(dǎo)致GDM 小鼠胰島素抵抗。橄欖苦苷治療增加了AMPK 活化,進(jìn)而導(dǎo)致葡萄糖攝取增加和胰島素抵抗降低,這也與前人的研究結(jié)果相符合[27]。以前的研究建立了兩種橄欖苦苷降血糖的可能作用機(jī)制:①改善葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素釋放;②增強(qiáng)外周葡萄糖攝取[28]。已經(jīng)觀察到橄欖苦苷可以加速細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取,從而導(dǎo)致血漿葡萄糖降低。AMPK信號(hào)傳導(dǎo)與葡萄糖的攝取相關(guān)[14],這也解釋了橄欖苦苷增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取的原因。AMPK 信號(hào)抑制也與胰島素抵抗、炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)。研究結(jié)果表明橄欖苦苷可以通過(guò)激活A(yù)MPK 信號(hào)通路改善GDM 小鼠癥狀,降低血糖和炎癥水平,并且改善小鼠妊娠結(jié)局,正如GDM 小鼠產(chǎn)仔數(shù)增加和出生體質(zhì)量降低所示。此外,還需要在細(xì)胞水平上研究橄欖苦苷對(duì)胰島的影響,以更深入地了解橄欖苦苷治療GDM的機(jī)制。

    總之,本研究報(bào)告了使用植物提取物橄欖苦苷治療GDM,結(jié)果表明橄欖苦苷可以緩解GDM 小鼠癥狀,恢復(fù)血清葡萄糖水平和胰島素敏感性,還能降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,改善妊娠結(jié)局,還證明橄欖苦苷可能通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路發(fā)揮其治療作用。

    猜你喜歡
    橄欖氧化應(yīng)激葡萄糖
    橄欖林中的鄉(xiāng)村酒店
    葡萄糖漫反射三級(jí)近紅外光譜研究
    基于炎癥-氧化應(yīng)激角度探討中藥對(duì)新型冠狀病毒肺炎的干預(yù)作用
    糖耐量試驗(yàn)對(duì)葡萄糖用量的要求
    冬清肺火用橄欖
    橄欖情
    葡萄糖對(duì)Lactobacillus casei KDL22發(fā)酵及貯藏性能的影響
    氧化應(yīng)激與糖尿病視網(wǎng)膜病變
    多發(fā)性肺硬化性血管瘤18~F-脫氧葡萄糖PET/CT顯像1例
    榨橄欖器

    av在线天堂中文字幕| 国产高清激情床上av| 深夜a级毛片| 久久99热这里只有精品18| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲av免费高清在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美一级a爱片免费观看看| 免费无遮挡裸体视频| 免费看a级黄色片| 高清日韩中文字幕在线| 午夜福利在线观看吧| 男人狂女人下面高潮的视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产熟女xx| av天堂中文字幕网| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 色综合亚洲欧美另类图片| 婷婷六月久久综合丁香| 一级a爱片免费观看的视频| 无遮挡黄片免费观看| 91字幕亚洲| 国产高潮美女av| 日韩免费av在线播放| 神马国产精品三级电影在线观看| 精品人妻1区二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产探花极品一区二区| 国产野战对白在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲精品在线美女| 国产成人福利小说| 51国产日韩欧美| 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美又色又爽又黄视频| 观看美女的网站| aaaaa片日本免费| 国产av麻豆久久久久久久| 日本黄大片高清| 国产精品免费一区二区三区在线| 给我免费播放毛片高清在线观看| 丁香六月欧美| ponron亚洲| 免费高清视频大片| x7x7x7水蜜桃| 18+在线观看网站| 久久热精品热| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲国产色片| netflix在线观看网站| 好男人电影高清在线观看| 欧美精品国产亚洲| 无人区码免费观看不卡| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 一区福利在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲成av人片在线播放无| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩国内少妇激情av| 亚洲成人中文字幕在线播放| 午夜福利在线观看吧| 亚洲天堂国产精品一区在线| 动漫黄色视频在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 波野结衣二区三区在线| 黄色女人牲交| 日韩亚洲欧美综合| netflix在线观看网站| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲黑人精品在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 成年版毛片免费区| 国产欧美日韩一区二区三| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 又爽又黄a免费视频| 小说图片视频综合网站| 精品久久久久久久久av| 99久久精品国产亚洲精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 18禁在线播放成人免费| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美在线黄色| 男人的好看免费观看在线视频| 99热这里只有是精品50| 91字幕亚洲| 我要看日韩黄色一级片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美日韩黄片免| 长腿黑丝高跟| 又爽又黄无遮挡网站| 伊人久久精品亚洲午夜| 一进一出好大好爽视频| 麻豆成人午夜福利视频| 一本综合久久免费| 黄色女人牲交| 日韩有码中文字幕| 国产精品99久久久久久久久| 在线观看一区二区三区| 成年人黄色毛片网站| av专区在线播放| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 午夜a级毛片| 成人午夜高清在线视频| 国产成人欧美在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精品,欧美在线| 久久久色成人| 国产精品一区二区免费欧美| 精品一区二区三区人妻视频| 18禁在线播放成人免费| 亚洲精品456在线播放app | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 色综合站精品国产| 欧美3d第一页| 亚洲在线自拍视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美精品国产亚洲| 中出人妻视频一区二区| 波野结衣二区三区在线| 国产精品久久久久久精品电影| 免费观看的影片在线观看| 久久人妻av系列| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美黄色片欧美黄色片| 熟女人妻精品中文字幕| 国产毛片a区久久久久| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲精品粉嫩美女一区| 日本黄色片子视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 在线免费观看的www视频| 亚洲,欧美精品.| 国产成人福利小说| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 一区二区三区激情视频| 国产男靠女视频免费网站| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 97热精品久久久久久| 国产精品久久久久久久久免 | 国产免费男女视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久精品91蜜桃| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产三级在线视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产不卡一卡二| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 麻豆国产97在线/欧美| 午夜亚洲福利在线播放| 午夜福利在线观看吧| 亚洲成人久久爱视频| 日韩欧美在线二视频| 亚洲无线观看免费| 宅男免费午夜| 国产美女午夜福利| 免费看光身美女| 免费电影在线观看免费观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产色爽女视频免费观看| 国产乱人视频| 制服丝袜大香蕉在线| 最新在线观看一区二区三区| 九九在线视频观看精品| 久久久久久国产a免费观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美色视频一区免费| 国产午夜精品论理片| 美女免费视频网站| 国产成人影院久久av| 麻豆一二三区av精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播| or卡值多少钱| 国产高清三级在线| 波多野结衣高清无吗| 夜夜爽天天搞| 免费人成在线观看视频色| 日本免费一区二区三区高清不卡| 午夜老司机福利剧场| 天堂网av新在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 两个人视频免费观看高清| 直男gayav资源| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 99在线视频只有这里精品首页| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲真实伦在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 99国产综合亚洲精品| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲欧美日韩东京热| 十八禁网站免费在线| 51国产日韩欧美| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日韩中字成人| 1024手机看黄色片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲av电影在线进入| 俺也久久电影网| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | av在线天堂中文字幕| 校园春色视频在线观看| 最好的美女福利视频网| 最近中文字幕高清免费大全6 | 国产av一区在线观看免费| 99视频精品全部免费 在线| 国产av不卡久久| 色视频www国产| 日本黄色视频三级网站网址| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产色爽女视频免费观看| 男人舔奶头视频| 69人妻影院| 窝窝影院91人妻| 少妇人妻一区二区三区视频| av女优亚洲男人天堂| 午夜视频国产福利| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲精品456在线播放app | 久久这里只有精品中国| 国产人妻一区二区三区在| 国产亚洲精品av在线| 亚洲av美国av| 亚洲精品456在线播放app | 欧美黄色片欧美黄色片| 美女 人体艺术 gogo| 熟女电影av网| 超碰av人人做人人爽久久| 成人亚洲精品av一区二区| ponron亚洲| 91久久精品国产一区二区成人| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 91av网一区二区| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲av二区三区四区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产野战对白在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 成年版毛片免费区| 亚洲最大成人av| 国产在线精品亚洲第一网站| 午夜两性在线视频| 亚洲激情在线av| 天天一区二区日本电影三级| 成人国产一区最新在线观看| 深夜精品福利| 一边摸一边抽搐一进一小说| 久久人妻av系列| 欧美一区二区精品小视频在线| 午夜a级毛片| 五月玫瑰六月丁香| 久久精品国产清高在天天线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 嫩草影视91久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 一夜夜www| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 搞女人的毛片| av天堂在线播放| 国产黄色小视频在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产爱豆传媒在线观看| 久久久久久久午夜电影| 51国产日韩欧美| a级一级毛片免费在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 日本免费a在线| 少妇人妻精品综合一区二区 | 99久久99久久久精品蜜桃| 国产三级在线视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 熟女电影av网| 亚洲内射少妇av| 99久国产av精品| 国产精品久久久久久久电影| 有码 亚洲区| 性欧美人与动物交配| 婷婷精品国产亚洲av| 宅男免费午夜| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产视频一区二区在线看| 99在线人妻在线中文字幕| 99久久精品国产亚洲精品| 免费看光身美女| 男人舔女人下体高潮全视频| 熟女人妻精品中文字幕| 国产熟女xx| 欧美bdsm另类| 国产中年淑女户外野战色| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 成人特级av手机在线观看| 亚洲avbb在线观看| 久久香蕉精品热| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲av不卡在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久久久久久久中文| 男人舔奶头视频| 综合色av麻豆| 日本三级黄在线观看| 九九在线视频观看精品| 国产欧美日韩一区二区三| 久久亚洲真实| 国产精品永久免费网站| 在线a可以看的网站| 国产黄a三级三级三级人| 精品欧美国产一区二区三| 观看免费一级毛片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 精品人妻视频免费看| 久久午夜亚洲精品久久| 国产精品电影一区二区三区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产成人福利小说| 性色avwww在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 婷婷六月久久综合丁香| 国模一区二区三区四区视频| 免费人成在线观看视频色| 大型黄色视频在线免费观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 成年版毛片免费区| 精品久久久久久,| 免费大片18禁| 一本精品99久久精品77| 一级黄色大片毛片| 免费电影在线观看免费观看| 简卡轻食公司| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产欧美日韩精品亚洲av| 成人av在线播放网站| 18+在线观看网站| 婷婷色综合大香蕉| 日本 欧美在线| 99热6这里只有精品| 国产精品亚洲av一区麻豆| 成年版毛片免费区| 五月伊人婷婷丁香| 一个人免费在线观看电影| 级片在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲成av人片免费观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品一区二区性色av| 日日干狠狠操夜夜爽| 人妻久久中文字幕网| 国产精品98久久久久久宅男小说| 露出奶头的视频| 亚洲av不卡在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲激情在线av| 天天躁日日操中文字幕| 免费观看精品视频网站| 99国产极品粉嫩在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 中文字幕久久专区| 一级a爱片免费观看的视频| 午夜福利视频1000在线观看| netflix在线观看网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 乱人视频在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久香蕉精品热| 我的女老师完整版在线观看| 一本一本综合久久| 人妻制服诱惑在线中文字幕| avwww免费| 免费观看的影片在线观看| 免费在线观看日本一区| www日本黄色视频网| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 国产成人a区在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产精品人妻久久久久久| 长腿黑丝高跟| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 丰满乱子伦码专区| 波多野结衣巨乳人妻| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产私拍福利视频在线观看| 免费人成在线观看视频色| 男女床上黄色一级片免费看| 看片在线看免费视频| 国产高清视频在线观看网站| 在线国产一区二区在线| 丰满乱子伦码专区| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品三级大全| 久久久久免费精品人妻一区二区| 免费大片18禁| 网址你懂的国产日韩在线| 日韩av在线大香蕉| 国产精品99久久久久久久久| 搡老妇女老女人老熟妇| 免费看光身美女| 一个人免费在线观看电影| 欧美+日韩+精品| 露出奶头的视频| 国产探花极品一区二区| 日日干狠狠操夜夜爽| 免费av不卡在线播放| 老鸭窝网址在线观看| 久久精品91蜜桃| 成人无遮挡网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 免费观看的影片在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲成人久久爱视频| 不卡一级毛片| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产三级中文精品| 极品教师在线视频| 精品久久久久久久久亚洲 | 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 国产亚洲av嫩草精品影院| 看黄色毛片网站| 深夜精品福利| 少妇的逼水好多| 淫秽高清视频在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 天天躁日日操中文字幕| 精品国产亚洲在线| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| avwww免费| 国产精品一区二区免费欧美| 五月玫瑰六月丁香| 少妇的逼水好多| 一个人免费在线观看的高清视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 免费搜索国产男女视频| 欧美日韩黄片免| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲在线自拍视频| 美女黄网站色视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 偷拍熟女少妇极品色| 国产黄片美女视频| 国产精品久久视频播放| 成人毛片a级毛片在线播放| 熟女人妻精品中文字幕| 丁香欧美五月| 色av中文字幕| 天堂动漫精品| a级一级毛片免费在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 欧美一区二区亚洲| 国产欧美日韩精品一区二区| 嫩草影院精品99| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲精华国产精华精| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 制服丝袜大香蕉在线| 真人做人爱边吃奶动态| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲av二区三区四区| 国产淫片久久久久久久久 | 深爱激情五月婷婷| 搞女人的毛片| 两个人视频免费观看高清| h日本视频在线播放| 1024手机看黄色片| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产欧美日韩一区二区三| 国产伦精品一区二区三区四那| 舔av片在线| 国产精品1区2区在线观看.| 嫁个100分男人电影在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产私拍福利视频在线观看| 99热精品在线国产| 两个人视频免费观看高清| 国产精品98久久久久久宅男小说| 桃红色精品国产亚洲av| 1000部很黄的大片| 色综合欧美亚洲国产小说| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精品电影一区二区三区| 九九热线精品视视频播放| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 一区二区三区高清视频在线| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲美女黄片视频| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲激情在线av| 日韩大尺度精品在线看网址| 舔av片在线| 国产老妇女一区| 男人的好看免费观看在线视频| 91久久精品电影网| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲av.av天堂| 看黄色毛片网站| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 亚洲人成网站高清观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 赤兔流量卡办理| 亚洲精品粉嫩美女一区| 怎么达到女性高潮| 有码 亚洲区| 看十八女毛片水多多多| 欧美成人一区二区免费高清观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 如何舔出高潮| 丰满人妻一区二区三区视频av| 韩国av一区二区三区四区| 久久久久久久精品吃奶| 91字幕亚洲| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产av不卡久久| 免费人成在线观看视频色| 91久久精品国产一区二区成人| 国语自产精品视频在线第100页| bbb黄色大片| 又粗又爽又猛毛片免费看| 午夜福利成人在线免费观看| 高清日韩中文字幕在线| 中文字幕熟女人妻在线| 在线观看66精品国产| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲综合色惰| 亚洲成av人片在线播放无| 欧美成狂野欧美在线观看| 窝窝影院91人妻| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲国产精品合色在线| 久久亚洲真实| 一个人看的www免费观看视频| 欧美黑人巨大hd| 国产一级毛片七仙女欲春2| xxxwww97欧美| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲第一电影网av| 免费大片18禁| 亚洲,欧美,日韩| 1024手机看黄色片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 怎么达到女性高潮| 男女视频在线观看网站免费| 悠悠久久av| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲18禁久久av| 白带黄色成豆腐渣| 免费在线观看亚洲国产| 久久99热这里只有精品18| 色5月婷婷丁香| 日韩欧美精品免费久久 | 日韩 亚洲 欧美在线| 色综合亚洲欧美另类图片| av专区在线播放| 久久6这里有精品| 精品国产亚洲在线| 久久久国产成人精品二区| 在线免费观看的www视频| netflix在线观看网站| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国内精品美女久久久久久| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲色图av天堂| 色视频www国产| 91麻豆精品激情在线观看国产| 免费看光身美女| 亚洲av免费高清在线观看| 久久这里只有精品中国| 亚洲午夜理论影院| 成人无遮挡网站| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美黑人巨大hd| 两个人的视频大全免费| 亚洲第一电影网av|