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    橄欖苦苷通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路緩解小鼠妊娠糖尿?。?/h1>
    2023-12-28 03:29:40陳俊芳陳愛(ài)香
    關(guān)鍵詞:橄欖氧化應(yīng)激葡萄糖

    陳俊芳,王 霞,姚 霞,李 靜,陳愛(ài)香

    (1. 長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院 長(zhǎng)治 046000;2. 長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院 長(zhǎng)治 046000)

    妊娠期糖尿?。℅DM)表現(xiàn)為妊娠期不同程度的高血糖,GDM的發(fā)病率很高,是迄今為止導(dǎo)致新生兒和孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一[1]。GDM 的病因尚未完全闡明,以往的研究表明,胎盤(pán)分泌的激素如胎盤(pán)催乳素(HPL)、雌激素和黃體酮等對(duì)胰島素的拮抗作用是導(dǎo)致GDM發(fā)病的主要原因[2]。在治療糖尿病時(shí),胰島素主要用于降低血糖,但胰島素的劑量因人而異,除了胰島素抵抗外,還影響了其在減少母嬰并發(fā)癥方面的效果[3]。因此,尋找新的具有降低血糖和對(duì)抗胰島素抵抗能力的藥物,是臨床上治療GDM亟需解決的問(wèn)題。

    橄欖苦苷(Oleuropein,Ole)是一種類(lèi)環(huán)烯醚萜,是橄欖葉、種子、果肉和未成熟橄欖果皮中最主要的酚類(lèi)成分,因其抗炎、抗氧化、抗腫瘤以及心臟和神經(jīng)保護(hù)作用而被廣泛應(yīng)用于臨床[4-5]。胎盤(pán)炎癥和氧化應(yīng)激與GDM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),兩者在塑造胎兒環(huán)境中起著至關(guān)重要的作用[6]。在正常妊娠中炎癥受到高度調(diào)節(jié),這對(duì)于維持良好的胎兒發(fā)育環(huán)境至關(guān)重要。研究表明GDM 與胎盤(pán)營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和活性失調(diào)有關(guān),這可能源于胎盤(pán)、母親和胎兒的炎癥狀態(tài)改變。先前的研究已經(jīng)證明橄欖苦苷在不同的糖尿病動(dòng)物模型中的功效,例如四氧嘧啶[7]誘導(dǎo)的和肥胖[8]誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型,使橄欖苦苷成為GDM臨床治療的潛在藥物。

    腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是能量代謝的關(guān)鍵酶,可調(diào)節(jié)脂肪組織、肝臟和骨骼肌中葡萄糖和脂質(zhì)的攝取、儲(chǔ)存和利用[9]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抑制AMPK 信號(hào)傳導(dǎo)與胰島素抵抗、炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)[10-11]。AMPK還參與調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα),它們是脂肪生成的中心調(diào)節(jié)劑[12]。因此,激活A(yù)MPK的藥物可能會(huì)逆轉(zhuǎn)肥胖相關(guān)代謝疾病的影響,例如2型糖尿病和胰島素抵抗[13]。先前的研究還指出AMPK 抑制和葡萄糖攝取減少之間的聯(lián)系,這是導(dǎo)致高血糖的一個(gè)重要因素[14]。因此,AMPK激活劑已成為研發(fā)糖尿病和肥胖癥等代謝疾病治療劑的重點(diǎn)。鑒于AMPK在GDM中的重要作用以及橄欖苦苷在激活A(yù)MPK信號(hào)傳導(dǎo)中的潛力,有必要對(duì)橄欖苦苷緩解GDM的作用進(jìn)行全面評(píng)估。

    在本研究中,旨在研究橄欖苦苷在GDM小鼠模型中的治療作用。在有或沒(méi)有橄欖苦苷治療的GDM 小鼠中比較了GDM癥狀,包括增加的血糖水平、體質(zhì)量、血漿胰島素水平和肝糖原含量。通過(guò)測(cè)量肝臟氧化應(yīng)激標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)氧化應(yīng)激水平,通過(guò)檢測(cè)血清和骨骼肌中IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 的水平來(lái)評(píng)估炎癥水平。還研究了AMPK 信號(hào)通路與橄欖苦苷治療之間的聯(lián)系,以探索橄欖苦苷緩解GDM 癥狀的機(jī)制。該研究的結(jié)果可以深入了解橄欖苦苷緩解GDM癥狀的功效,并為其臨床轉(zhuǎn)化鋪平道路。

    1 材料和方法

    1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

    6-8 周齡的C57BL/KsJ Lepdb/+(db/+)和C57BL/KsJ+/+(WT)小鼠購(gòu)自Jackson Laboratories。喂食高脂肪飲食(17%脂肪、47%碳水化合物和29%蛋白質(zhì),Harlan Teklad)。將小鼠安置在溫度為22±2℃的無(wú)菌環(huán)境中,保持12 h 光照和12 h 黑暗循環(huán),自由獲取食物和水。10-12 周齡的雌性小鼠在單獨(dú)的籠子中交配,交配后的第2 天表示為妊娠天(GD0)。妊娠小鼠隨機(jī)分組如下:正常妊娠對(duì)照組(WT小鼠),GDM組C57BL/KsJ Lepdb/+(db/+),GDM+橄欖苦苷組(10 mg·kg-1·d-1,腹腔注射),正常妊娠對(duì)照組和GDM 組腹腔注射等量生理鹽水。在GD15 進(jìn)行腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(GTT)和腹腔胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(ITT)測(cè)定,并檢測(cè)炎癥因子水平和血清葡萄糖含量。

    1.2 腹腔內(nèi)葡萄糖和胰島素耐量試驗(yàn)

    GTT 和ITT 在GD15 進(jìn)行。對(duì)于GTT,在禁食6 h后以2.0 g·kg-1的劑量腹腔注射葡萄糖,使用ACCUCHEK 血糖儀(Roche Diagnostics,Switzerland)測(cè)量基線和葡萄糖注射后(注射后30、60、90 和120 min)的血糖水平。對(duì)于ITT,在禁食6 h 后以0.75 U·kg-1的劑量腹腔注射胰島素,并在基線和胰島素注射后(注射后30、60、90和120 min)測(cè)量血糖水平。

    1.3 肝糖原含量的測(cè)量

    根據(jù)制造商(BioVision,San Francisco,LA)的方案使用商業(yè)試劑盒處理肝組織,將肝裂解物與分析試劑混合后,使用酶標(biāo)儀(Spectra Max 384,USA)測(cè)量肝糖原在340 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

    1.4 血清葡萄糖和胰島素測(cè)量

    分別于GD0、9、18 使用血糖儀測(cè)量葡萄糖水平,并用超靈敏小鼠胰島素ELISA 試劑盒(ALP CO Diagnostics,Salem,NH)分析血漿胰島素水平。

    1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

    在GD18,根據(jù)制造商的方案,使用ELISA 試劑盒測(cè)量小鼠血清IL-1β(MLB00C,R&D Systems)、IL-6(SM6000B,R&D Systems)、TNF-α(SMTA00B,R&D Systems)和MCP-1(MJE00B,R&D Systems)的水平。

    1.6 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)

    使用TRIzol 試劑(Thermo Fisher)提取細(xì)胞總RNA,根據(jù)制造商的方案,使用cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa Bio,China)將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)(TaKaRa Bio,China)進(jìn)行操作,以GAPDH 做為內(nèi)參,每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物如下:IL-6 正向5’-TGTGCTTTCTGGAGGGTCTACT-3’,反向5’-TGCCTCATCACCAACCATA AG-3’;IL-1β 正向5’-AGTAGCAGCGGTGGAAGT-3’,反向5’-CTTCC TGTATGTGCACTGGCGGTCCT-3’;TNF-α正向5’-GT CAGAAGACAAGATCACCGGA-3’,反向5’-AGGTGC ATTGATCACACCGA-3’;MCP-1正向5’-GGGTATTA GGGTTGGAATTTAATGT-3’,反向5’-CTTCCTTCTAA TTATTTCCATTTCTCTCA-3’;GAPDH正向5’-CTGG GCTACACTGAGCACC-3’,反向5’-AAGTGGTCGTTG AGGGCAATG-3’。qPCR 的反應(yīng)條件設(shè)置為:95℃預(yù)變性5 min,然后進(jìn)行39 個(gè)循環(huán)的95℃下變性30 s,60℃下退火30 s,72℃下延伸60 s。采用相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt的方法處理數(shù)據(jù)。

    1.7 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)

    從肝組織中提取蛋白質(zhì)樣品,用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)(碧云天,上海)蛋白質(zhì)濃度。進(jìn)行SDSPAGE電泳,將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜,使用5%的脫脂奶粉封閉1 h。TBST洗膜3次,加入相應(yīng)的一抗:AMPK(ab32047,1∶1000,Abcam),p-AMPK(ab92701,1∶1000,Abcam),HDAC4(ab235583,1∶1000,Abcam),p-HDAC4(ab39408,1∶1000,Abcam),G6Pase(ab93857,1∶1000,Abcam),β-actin(ab8226,1∶1000,Abcam),在4℃孵育過(guò)夜。TBST 洗膜后,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,孵育1 h。ECL 底物化學(xué)發(fā)光顯色后用Image J軟件進(jìn)行條帶分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,兩組之間的比較通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),然后進(jìn)行Tukey 事后檢驗(yàn),P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 橄欖苦苷可以改善GDM小鼠的糖尿病癥狀

    首先,評(píng)估橄欖苦苷對(duì)整個(gè)妊娠期GDM小鼠體質(zhì)量和血糖水平的影響。如圖1A 所示,3 組小鼠在懷孕期間體質(zhì)量均有所增加。GD18,橄欖苦苷治療的GDM 小鼠的體質(zhì)量明顯低于GDM 組小鼠,表明橄欖苦苷治療阻止了GDM 小鼠體質(zhì)量的增加。相應(yīng)地,GDM 小鼠從GD0 到GD18 的體質(zhì)量增加顯著高于正常組小鼠(圖1B)。正常妊娠小鼠的血清葡萄糖水平在GD0、9 和18 保持穩(wěn)定。與正常組小鼠相比,GDM小鼠在GD0、9和18的血糖水平顯著升高,橄欖苦苷治療顯著降低了GDM 小鼠GD9、18的血糖水平(圖1C)。數(shù)據(jù)表明橄欖苦苷改善了GDM小鼠的糖尿病癥狀。

    圖1 橄欖苦苷對(duì)GDM小鼠的糖尿病癥狀的影響(n=5)

    2.2 橄欖苦苷可以改善GDM 小鼠的葡萄糖和胰島素耐受性

    檢測(cè)橄欖苦苷對(duì)GDM 小鼠葡萄糖和胰島素耐受性的影響。在葡萄糖注射前,與正常組小鼠相比,GDM 小鼠的血糖水平顯著升高,橄欖苦苷治療組小鼠血糖水平較GDM 組顯著下降。注射葡萄糖后,3 小鼠血糖均升高。在葡萄糖注射后的所有4 時(shí)間點(diǎn)(30、60、90 和120 min),GDM 組小鼠的血糖水平均顯著高于正常組小鼠,并且橄欖苦苷顯著降低了GDM小鼠的血糖水平(圖2A)。相應(yīng)地,GDM 小鼠的葡萄糖曲線下面積(AUC)明顯大于正常組小鼠,橄欖苦苷治療組小鼠的AUC 顯著小于GDM 組小鼠。因此,數(shù)據(jù)表明橄欖苦苷改善了GDM 小鼠的葡萄糖耐量。如圖2B所示,注射胰島素導(dǎo)致所有小鼠的血糖水平降低。GDM組小鼠在注射胰島素后30、60、90和120 min的血糖水平顯著高于正常組小鼠,橄欖苦苷治療在所有4時(shí)間點(diǎn)都顯著降低了GDM小鼠的血糖水平。相應(yīng)地,橄欖苦苷治療組小鼠的AUC 顯著低于GDM 小鼠。表明橄欖苦苷改善了GDM小鼠的葡萄糖和胰島素耐受性。

    圖2 橄欖苦苷對(duì)GDM小鼠的葡萄糖和胰島素耐受性的影響(n=5)

    2.3 橄欖苦苷抑制GDM小鼠的炎癥

    為評(píng)估橄欖苦苷對(duì)GDM小鼠炎癥的影響,首先監(jiān)測(cè)了血清中炎癥細(xì)胞因子的水平。與正常組小鼠相比,GDM 小鼠的血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 和MCP-1水平都顯著升高。與GDM組小鼠相比,橄欖苦苷治療組小鼠血清中這些炎癥因子的水平顯著降低(圖3A-3D)。在骨骼肌中也得到了相同的結(jié)果(圖3E)。表明橄欖苦苷可以抑制GDM小鼠的炎癥。

    圖3 橄欖苦苷對(duì)GDM小鼠炎癥的影響(n=5)

    2.4 橄欖苦苷促進(jìn)肝臟中AMPK活化

    為了研究橄欖苦苷治療GDM 的潛在機(jī)制,在GD18 時(shí)取小鼠肝臟組織,通過(guò)Western blot 檢測(cè)橄欖苦苷對(duì)AMPK 信號(hào)通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組小鼠相比,GDM 組小鼠的AMPK 活化受到抑制,而橄欖苦苷顯著恢復(fù)了p-AMPK 的表達(dá)。組蛋白去乙?;?(HDAC4)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)是糖代謝中的關(guān)鍵酶,發(fā)現(xiàn)在GDM 小鼠中,HDAC4 激活和G6Pase 表達(dá)水平上調(diào),而橄欖苦苷治療可以逆轉(zhuǎn)AMPK 相關(guān)蛋白的激活模式,降低G6Pase 的表達(dá),見(jiàn)圖4。表明橄欖苦苷對(duì)GDM 小鼠的治療作用可能是通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路介導(dǎo)的。

    圖4 橄欖苦苷對(duì)AMPK信號(hào)通路的影響(n=5)

    2.5 橄欖苦苷改善GD小鼠的生殖結(jié)果

    為了解橄欖苦苷對(duì)妊娠結(jié)局的影響,檢查了各組小鼠的產(chǎn)仔數(shù)和出生體質(zhì)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷顯著恢復(fù)了GDM 組小鼠增加的出生體質(zhì)量(圖5A)和減少的產(chǎn)仔數(shù)(圖5B),表明橄欖苦苷的抗炎和抗氧化作用轉(zhuǎn)化為GDM小鼠妊娠結(jié)局的改善。

    3 討論

    GDM 是妊娠期間由胰島素抵抗和胰腺β 細(xì)胞功能障礙引起的一種暫時(shí)性葡萄糖不耐受形式,是最常見(jiàn)的妊娠并發(fā)癥之一,與孕產(chǎn)婦和新生兒結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)的顯著增加有關(guān),GDM 女性的后代更有可能患上糖尿病和代謝綜合征[15]。目前治療GDM 的方案十分有限,胰島素是主要的治療方法,但會(huì)導(dǎo)致低血糖的發(fā)生,并且和不良的胎盤(pán)、胎兒和母體結(jié)局相關(guān)[16]。雖然二甲雙胍能有效治療GDM,但它可以穿過(guò)胎盤(pán),對(duì)胎兒的長(zhǎng)期影響未知[17]。因此,迫切需要尋找能有效治療GDM且副作用小的藥物。

    橄欖苦苷是橄欖果實(shí)、葉子、樹(shù)枝和油中最活躍的酚類(lèi)化合物之一,具有多種生物學(xué)功能。由于橄欖苦苷在臨床前和臨床研究中對(duì)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的有益作用,越來(lái)越多的研究集中在橄欖苦苷的抗糖尿病功能上[18]。在本研究中,使用GDM 小鼠模型評(píng)估橄欖苦苷對(duì)GDM癥狀(母體體質(zhì)量和血糖)、葡萄糖和胰島素耐量的治療作用。結(jié)果證明橄欖苦苷通過(guò)顯著降低體質(zhì)量和血糖水平來(lái)緩解GDM小鼠的癥狀,并且改善了葡萄糖和胰島素耐受性。此外,橄欖苦苷還通過(guò)降低出生體質(zhì)量和增加產(chǎn)仔數(shù)來(lái)改善GDM 小鼠的生殖結(jié)局。這些結(jié)果展現(xiàn)出了橄欖苦苷對(duì)GDM的保護(hù)作用,表明橄欖苦苷可能作為治療GDM的潛在藥物。

    炎癥和氧化應(yīng)激與母體胰島素抵抗的增加有關(guān),是導(dǎo)致GDM 發(fā)病的兩個(gè)主要因素[19],研究發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷能夠恢復(fù)升高的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平。懷孕期間炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的失調(diào)可能是孕婦激素水平和能量代謝改變的結(jié)果[20],增加的激素產(chǎn)生可以促進(jìn)脂肪分解,進(jìn)而導(dǎo)致炎癥因子分泌、脂質(zhì)代謝和葡萄糖代謝異常以及胰島素抵抗,并且失調(diào)的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化也可能導(dǎo)致過(guò)度的氧化應(yīng)激,從而進(jìn)一步破壞胎兒發(fā)育環(huán)境[21]。TNF-α是炎癥反應(yīng)中最早的細(xì)胞因子之一,被認(rèn)為是胰島素抵抗的預(yù)測(cè)因子[22]。此外,TNF-α作為起始因子并激活I(lǐng)L-6的分泌,IL-6是炎癥反應(yīng)中重要的促炎因子,GDM 患者處于慢性炎癥狀態(tài),血清中IL-6和TNF-α等炎癥因子水平顯著高于正常妊娠[23]。在目前的研究中,證實(shí)GDM 小鼠的IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平顯著升高,橄欖苦苷治療后,GDM 小鼠肝臟中的氧化應(yīng)激水平,以及血清和骨骼肌中的炎癥水平都顯著降低。許多研究描述了TNF-α 在胰島素抵抗的病理生理學(xué)中的直接作用[24]。與先前的研究結(jié)果一致,證明骨骼肌中TNF-α 的產(chǎn)生增加導(dǎo)致GDM小鼠的胰島素敏感性降低,而橄欖苦苷抑制TNF-α 的產(chǎn)生并改善GDM 小鼠的胰島素敏感性??傊?,這些數(shù)據(jù)證實(shí)了橄欖苦苷的抗氧化和抗炎效力,以及在GDM小鼠中的治療作用。

    AMPK 是調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的關(guān)鍵代謝酶,運(yùn)動(dòng)和離體收縮可以激活A(yù)MPK 并刺激骨骼肌吸收葡萄糖,已有多項(xiàng)研究表明激活A(yù)MPK 通路可以增加胰島素敏感性,從而改善糖尿病癥狀[25-26]。為了探索橄欖苦苷治療GDM 的分子機(jī)制,重點(diǎn)研究了AMPK 信號(hào)通路。研究結(jié)果表明GDM 小鼠的AMPK 活化受損,這可能導(dǎo)致GDM 小鼠胰島素抵抗。橄欖苦苷治療增加了AMPK 活化,進(jìn)而導(dǎo)致葡萄糖攝取增加和胰島素抵抗降低,這也與前人的研究結(jié)果相符合[27]。以前的研究建立了兩種橄欖苦苷降血糖的可能作用機(jī)制:①改善葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素釋放;②增強(qiáng)外周葡萄糖攝取[28]。已經(jīng)觀察到橄欖苦苷可以加速細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取,從而導(dǎo)致血漿葡萄糖降低。AMPK信號(hào)傳導(dǎo)與葡萄糖的攝取相關(guān)[14],這也解釋了橄欖苦苷增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取的原因。AMPK 信號(hào)抑制也與胰島素抵抗、炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)。研究結(jié)果表明橄欖苦苷可以通過(guò)激活A(yù)MPK 信號(hào)通路改善GDM 小鼠癥狀,降低血糖和炎癥水平,并且改善小鼠妊娠結(jié)局,正如GDM 小鼠產(chǎn)仔數(shù)增加和出生體質(zhì)量降低所示。此外,還需要在細(xì)胞水平上研究橄欖苦苷對(duì)胰島的影響,以更深入地了解橄欖苦苷治療GDM的機(jī)制。

    總之,本研究報(bào)告了使用植物提取物橄欖苦苷治療GDM,結(jié)果表明橄欖苦苷可以緩解GDM 小鼠癥狀,恢復(fù)血清葡萄糖水平和胰島素敏感性,還能降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,改善妊娠結(jié)局,還證明橄欖苦苷可能通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路發(fā)揮其治療作用。

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