當歸紅芪超濾物通過抑制心臟CILP1過表達對放射性心肌纖維化的干預效應＊

趙曉彬，蔣虎剛，王新強，韓金晏，陳玉林，李應東，2，3，趙信科

（1. 甘肅中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院 蘭州 730000；2. 甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 蘭州 730000；3. 甘肅省中醫(yī)藥防治慢性疾病重點實驗室 蘭州 730000）

心肌纖維化是多種心血管疾病末期常見的病理表現(xiàn)，成纖維細胞積累增加和細胞外基質(zhì)產(chǎn)生和降解失衡是其主要的特征，而心肌纖維化是各種心臟病進展的一個重要因素[1-2]。軟骨中間層蛋白1（Cartilage intermediate layer protein 1，CILP1）是一種由軟骨細胞分泌的基質(zhì)蛋白，與常見的肌肉骨骼類疾病相關(guān)。既往有研究發(fā)現(xiàn)[3]，CILP1在心衰患者及心衰模型小鼠的心臟中均有表達，并且可以調(diào)控主動脈縮窄術(shù)后小鼠的心肌纖維化，研究發(fā)現(xiàn)[4]，CILP1 可能是病理性心臟重構(gòu)的生物標志物，并可通過促進肌成纖維細胞增殖和心肌纖維化加重病理性心臟重構(gòu)，而在CILP1 敲除后的模型小鼠中發(fā)現(xiàn)，其心臟中炎癥因子表達減少，肌成纖維細胞減少，微血管存活率提高[5]。TGF-β1/Smad3 信號通路是調(diào)節(jié)心肌纖維化的經(jīng)典通路，TGFβ1可調(diào)控心肌細胞分泌多種細胞外基質(zhì)、下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9 等的表達從而促進心肌纖維化的發(fā)生[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，心臟組織中IL-1β、TNF-α 等炎癥因子是TGF-β1/Smad3 信號通路的上游信號，可直接參與TGF-β1/Smad3 信號通路的激活[8]。本研究推測，心肌細胞CILP1 過表達可通過誘導炎癥反應激活TGF-β1/Smad3信號通路是放射性心肌纖維化的潛在機制。本課題組前期研究證實[9-10]，當歸紅芪超濾物（Radix Angelica Sinensis and Radix Hedysari ultrafiltration，RAS-RH）能夠明顯減輕輻射誘導的心肌炎癥反應、抑制心肌細胞凋亡、減少心肌膠原纖維沉積等，從而有效抑制放射性心肌纖維化的發(fā)生，而RAS-RH 是否通過下調(diào)心臟中CILP1的表達延緩心肌纖維化的發(fā)生尚不明確。本研究旨在明確CILP1過表達在心肌纖維化發(fā)生中的調(diào)控作用及RAS-RH 對輻射后心臟中CILP1過表達干預作用，為心肌纖維化的防治提供新的思路。

1 材料

1.1 實驗動物

健康Wistar 雄性大鼠40 只，8 周齡，SPF 級，體質(zhì)量200±20 g，購于甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心（動物許可證：SYXK(甘)2021-0006）。實驗倫理號：2018-033。

1.2 藥物

RAS-RH，當歸和紅芪飲片購自甘肅中天藥業(yè)有限責任公司，經(jīng)由甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥師鑒定后，將當歸和紅芪按1:5 比例混合，加5 倍體積水煎煮1 h，濾渣，收取煎煮液后，將濾渣再次煎煮。將兩次收集的煎煮液再次煎煮濃縮，制成約1 g·mL-1藥物濃度，送甘肅膜科學技術(shù)研究所采用截留分子量為100 kDa 超濾膜濾過（技術(shù)參數(shù)為壓力0.5 kPa·m-3，流量100 L·h-1·m-2，溫度25℃），并將超濾液制成干燥粉末。本研究所用RAS-RH，由本課題組前期制備所得，生產(chǎn)批號：20190619。

鹽酸貝那普利，生產(chǎn)批號：20181114，規(guī)格：5 mg/片，由深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 實驗儀器和試劑

Eppendorf 移液槍、Multiskan FC 酶標儀（美國Thermo 公司），精密電子天平（OHAUS 公司），高速冷凍離心機（美國Sigma 公司），Titan 電鏡（日本奧林巴斯），X-ray 輻射儀（美國Faxitron 公司），JB-P5 型組織包埋機（俊杰電子有限公司），RM2016 型病理切片機（上海萊卡儀器有限公司），KD-P 型組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；載玻片及蓋玻片均購于江蘇世泰實驗器材有限公司，BX43+sc50 顯微拍照系統(tǒng)（奧林巴斯有限公司）。

蘇木素染液、伊紅染液購自北京益利精細化學品有限公司，批號分別為：20210078，20210175；N 端B 型利鈉肽（NT-pro BNP)ELISA試劑盒，武漢菲恩生物科技有限公司，生產(chǎn)批號ER0906；肌鈣蛋白Ⅰ（CTnⅠ）、肌鈣蛋白T（CTnT）ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)批號分別為：56439781、39564178）；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）抗體（美國Immunoway 公司，貨號分別為YM3378、YM6365）；軟骨中間層蛋白1（CILP1）抗體、Smad3 抗體（Abcam 公司，貨號分別為：ab17293、ab40791）；Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）抗體、Ⅲ型膠原（Col-Ⅲ）抗體（美國Affinity 公司，貨號分別為AF7075，AF0189）；GAPDH 抗體，美國ImmunoWay 公司，批號：Lot：B1787。

2 方法

2.1 分組與造模

將SPF 級8周齡40只Wistar雄性大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為正常組、模型組、鹽酸貝那普利組、RAS-RH 組、鹽酸貝那普利+RAS-RH 組，每組8 只，除正常組外，模型組、鹽酸貝那普利組、RAS-RH 組、鹽酸貝那普利+RAS-RH 組大鼠參照國內(nèi)外實驗研究造模[11]，造模以1%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，麻醉后定位大鼠心臟，置于X-ray 輻射儀下，使用6 MV 高能X 射線，以2 cm×2 cm 為輻射視野、1.5 cm 為照射深度，源皮距100 mm，前后對穿照射，吸收劑量率300 cGy·min-1射線照射心臟，其余部位由鉛板遮擋。大鼠心臟接受18 Gy 劑量的照射相當于通常用于患者分次照射2 Gy×30 次的效果[12]，輻照結(jié)束后將大鼠分籠放置，等待蘇醒，待大鼠蘇醒后，對各組大鼠行灌胃處理。

2.2 藥物干預

本課題組前期研究表明RAS-RH 以0.6 g·kg-1[13]干預療效確切，因此以該劑量進行后續(xù)研究。正常組與模型組給予生理鹽水溶液灌胃，鹽酸貝那普利組給予鹽酸貝那普利1.0 mg·kg-1；RAS-RH 組給予RASRH 0.6 g·kg-1；鹽酸貝那普利+RAS-RH 組給予鹽酸貝那普利1.0 mg·kg-1與RAS-RH 0.6 g·kg-1，并用生理鹽水配制藥物，配制好后每組按同等體積生理鹽水灌胃，干預4 周，干預期間各組大鼠均給予SPF 級大鼠維持飼料飼養(yǎng)。

2.3 ELISA 檢測各組大鼠血清中NT-proBNP、CTnⅠ、CTnT的含量

實驗結(jié)束后將各組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉進行麻醉，腹主動脈采血后，低溫離心，分離血清，-80℃冰箱保存，使用Elisa 試劑盒檢測大鼠血清中NT-ProBNP、CTnⅠ、CTnT 的含量水平，實驗步驟嚴格按照說明書進行。

2.4 HE染色觀察各組大鼠心肌組織病理學變化

采血后處死大鼠，取大鼠心肌組織固定在4%多聚甲醛中，石蠟包埋后制備5 μm 石蠟切片，烤片后進行脫蠟至水，進行心肌組織HE 染色，鏡下評價心肌組織形態(tài)學改變。

2.5 Masson染色評價各組大鼠心肌膠原沉積情況

大鼠心肌組織固定在4%多聚甲醛中，石蠟包埋切片，脫水，蘇木素染色5-10 min，酸性乙醇分化10 s、蒸餾水漂洗、酸性麗春紅品紅染色5-10 min 后，水溶液分化3-5 min，苯胺藍染色2 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明3 次，封片。應用Image-Pro 6.0 圖像分析軟件系統(tǒng)分析大鼠心肌組織的膠原容積分數(shù)（Collagen volume fraction，CVF），CVF=視野內(nèi)心肌膠原面積/視野總面積，最后取平均值。

2.6 免疫組化檢測各組大鼠心肌組中α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白的表達水平

大鼠心肌組織固定在4%多聚甲醛中，石蠟包埋后制備5 μm 切片，切片經(jīng)二甲苯脫蠟至水，EDTA 修復抗原及山羊血清封閉處理后，分別滴加抗大鼠Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA 抗體過夜，次日，充分洗片后滴加HRP-標記二抗，室溫孵育30 min，洗片后DAB 顯色，采用蘇木素復染，封片，電子顯微鏡觀察并拍照，采用Image J-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件分析陽性信號A值，以A值代表目的蛋白表達水平。

2.7 Western blot法檢測各組大鼠心肌組織中TGF-β1、smad3、CILP1蛋白表達

將大鼠心肌組織置于勻漿管中剪碎、研磨、離心，收集上清液保存?zhèn)溆?，用BCA 蛋白定量試劑盒定量，上樣緩沖液配平，95℃金屬浴混合液體15 min，再次短暫離心，-20℃分裝備用；SDS-PAGE 電泳分離，灌膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗TGF-β1、smad3、CILP1、GAPDH（1:1000）4℃孵育過夜，清洗，二抗HRP（1:3000）室溫孵育30 min，洗膜3 次，每次15 min，發(fā)光并采圖保存。使用Image J 測定目的條帶與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示所測蛋白的表達水平。

2.8 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)運用SPSS 24.0軟件進行分析，對計量資料進行正態(tài)性檢驗，若符合正態(tài)分布，則采用均值±標準差（±s）表示，若兩組間比較滿足正態(tài)分布及方差齊性用t檢驗，不滿足正態(tài)分布及方差齊性用秩和檢驗，多組間比較用單因素方差分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清中NT-proBNP、CTnI、CTnT的表達

與正常組比較，模型組大鼠血清中的NTproBNP、CTnI、CTnT 水平升高（P<0.05）；與模型組相比，鹽酸貝那普利組、RAS-RH 組、鹽酸貝那普利+RAS-RH 組中的NT-proBNP、CTnI、CTnT 的表達水平降低，鹽酸貝那普利+RAS-RH 組具有顯著意義（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清NT-proBNP、CTnI、CTnT的表達情況（n=8）

3.2 HE染色結(jié)果

HE 染色可見，正常組心肌組織結(jié)構(gòu)完整，心肌排列整齊，纖維及斷面排列整齊；模型組肌纖維排列紊亂，心肌組織可見炎性細胞浸潤，有出血、心肌纖維形態(tài)改變、纖維化程度較重，鹽酸貝那普利組、RAS-RH組、鹽酸貝那普利+RAS-RH 組相對于模型組有所改善，且鹽酸貝那普利+RAS-RH 組恢復程度優(yōu)于鹽酸貝那普利組、RAS-RH 組。RAS-RH 組部分纖維排列紊亂間隙較大，見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學評價（40×）

3.3 Masson染色結(jié)果

Masson 染色可見，正常組大鼠紅色心肌組織排列整齊，間質(zhì)內(nèi)少見藍染膠原纖維組織；與正常組相比，模型組大鼠心肌組織中藍染膠原纖維組織明顯增加，心肌排列紊亂，膠原沉積增加，CVF 顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，鹽酸貝那普利組、RAS-RH 組可見少量藍染膠原纖維、膠原沉積顯著減少，CVF 顯著降低（P<0.01），而鹽酸貝那普利+RAS-RH組肌纖維間隙較正常組稍寬，CVF 較模型組明顯減少（P<0.01）。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織膠原纖維評價結(jié)果（40×）

3.4 各組大鼠心肌組織中α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達水平變化

與正常組比較，模型組大鼠心肌組織中α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達升高（P<0.05）。與模型組比較，鹽酸貝那普利組、RAS-RH 組與鹽酸貝那普利+RAS-RH 組α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達明顯降低，鹽酸貝那普利+RAS-RH 組具有顯著意義（P<0.05），見圖3、4。

圖3 各組大鼠心肌組織α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達檢測結(jié)果（20×）

圖4 各組大鼠心肌組織中α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達的結(jié)果

3.5 各組大鼠心臟組織TGF-β1、smad3、CILP1 蛋白表達結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠心肌組織TGF-β1、smad3、CILP1 蛋白表達顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，鹽酸貝那普利組、RAS-RH組與鹽酸貝那普利+RAS-RH 組TGF-β1、smad3、CILP1 蛋白表達明顯降低，鹽酸貝那普利+RAS-RH 組具有顯著意義（P<0.01）。見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織中TGF-β1、smad3、CILP1蛋白表達檢測結(jié)果

4 討論

心肌纖維化是受損的正常心肌組織被纖維化組織替代，使心肌組織喪失其正常的結(jié)構(gòu)與功能，引起心肌重塑的重要病理過程[14]。其機制主要與心肌細胞外基質(zhì)中的膠原過度沉積導致間質(zhì)增生、炎性細胞浸潤、肌纖維排列紊亂、斷裂有關(guān)[15]。膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的主要成分，當發(fā)生心肌纖維化時，會伴隨膠原纖維網(wǎng)的形成，致使心肌收縮功能發(fā)生障礙，從而影響心功能，而隨著心肌纖維化的發(fā)生與發(fā)展，最終可能會導致心力衰竭、各種心律失常等心臟疾病的發(fā)生[16-17]。近年來西醫(yī)在抗心肌纖維化的治療主要以RASS 抑制劑、他汀類、鈣通道阻滯劑為主，但在臨床應用中具有局限性。研究表明，中醫(yī)具有改善患者心功能及提高生存率等諸多優(yōu)勢，因此探索中醫(yī)藥防治心肌纖維化的作用機制，對防治心肌纖維化有著重要的現(xiàn)實意義。

祖國醫(yī)學將心肌纖維化歸屬“胸痹”、“心悸”等范疇?！氨咎摌藢崱睘槠浠静C特點，本虛以氣血虧虛為主，標實以血脈瘀阻為主，治療以“益氣補血活血”為治則。氣為血之帥，血為氣之母，氣虛則氣化失司、無力推動血液運行，故血瘀內(nèi)阻；血虛，則臟腑失于濡養(yǎng)，臟腑功能紊亂，氣之生成不足，故正氣虧虛，無力驅(qū)邪外出，久病入絡(luò)則脈絡(luò)瘀阻。RAS-RH 是本課題組依據(jù)當歸補血湯比例將當歸、紅芪配伍制備而成，前期研究亦發(fā)現(xiàn)[18-19]，其可通過抑制炎癥反應、抗氧化應激、抑制細胞凋亡等多種機制對放射性心臟病大鼠模型心臟損傷具有改善作用。

當心臟受到多種病理因素刺激時會生成大量的Col-Ⅰ、Col-Ⅲ膠原蛋白，而膠原蛋白作為細胞外基質(zhì)主要成分，其過度沉積會導致間質(zhì)增生，炎性細胞浸潤，心肌纖維排列紊亂、斷裂，導致間質(zhì)纖維化，從而引起心臟功能障礙。本研究通過HE染色與Masson染色觀察心肌組織形態(tài)學改變發(fā)現(xiàn)與正常相大鼠比較，心肌組織可見大量的炎性細胞浸潤，心肌間質(zhì)可見大量藍色纖維化組織，有出血、心肌細胞排列紊亂，尤其是血管周圍明顯。而經(jīng)過RAS-RH 干預后，大鼠心肌纖維組織明顯減少，排列紊亂改善。而通過免疫組化觀察顯示，與正常組相比，模型組大鼠心肌組織中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表達增加，并大片分布于細胞外基質(zhì)，且形態(tài)不規(guī)則，而經(jīng)RAS-RH 干預后，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表達明顯減少，排列也較為整齊。另外，通過檢測大鼠血清中心肌細胞損傷標志物NT-proBNP、CTnI、CTnT 的含量發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠血清內(nèi)心肌細胞損傷標志物NT-proBNP、CTnI、CTnT 明顯升高，而經(jīng)RAS-RH 干預，RAS-RH 組大鼠大鼠血清內(nèi)心肌細胞損傷標志物NT-proBNP、CTnI、CTnT 明顯降低，以上結(jié)果提示RAS-RH 可通過“益氣養(yǎng)血”的作用來改善輻射引起的心臟結(jié)構(gòu)功能結(jié)構(gòu)紊亂。

CILP1作為一種在關(guān)節(jié)軟骨中大量存在的細胞外基質(zhì)蛋白，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，心肌組織中存在大量的CILP1[20]，而心肌成纖維細胞是CILP1 的主要來源，與細胞外基質(zhì)重塑和TGFβ1 信號傳導密切相關(guān)[21]，并且在心肌病模型中升高，這提示CILP1 是心臟纖維化的敏感標志物，可作為治療心肌纖維化的新靶點。此外還有研究顯示[22]，CILP1 過表達可誘發(fā)大量的炎性細胞聚集、浸潤，而機體內(nèi)炎癥因子水平明顯升高與增加會進一步引發(fā)心肌細胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，X 線輻射后模型組大鼠心肌組織CILP1 蛋白表達明顯升高且心肌纖維形態(tài)改變、膠原沉積顯著增加，提示CILP1可能是調(diào)控心肌細胞損傷的關(guān)鍵靶點之一。TGF-β作為調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化等的重要細胞因子，介導心肌纖維化病理生理過程。而TGF-β1 為TGF-β超家族關(guān)鍵致纖維化細胞因子，其可刺激心肌成纖維細胞增殖，造成細胞外基質(zhì)和纖維過度沉積，從而推動心肌纖維化的形成和發(fā)展。此外，Smad3 作為TGF-β 信號通路的拮抗劑，其發(fā)生磷酸化后并易位入核后將會啟動TGF-β1 靶基因的轉(zhuǎn)錄，使TGF-β1/Smad 信號傳導通路被激活，從而誘導心肌成纖維細胞的增殖、膠原蛋白等細胞外基質(zhì)合成和過度沉積，誘發(fā)心肌纖維化的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，X 線輻射后心肌組織內(nèi)TGF-β1、Smad3、CILP1 表達明顯升高，而CILP1 可靶向調(diào)控TGFβ1 信號傳導參與心肌纖維化的調(diào)控，而給予RAS-RH 后TGF-β1、Smad3、CILP1 表達降低，提示RAS-RH 抑制心肌纖維化的作用可能與降低CILP1 高表達抑制炎癥反應誘導TGF-β1/Smad3信號通路激活有關(guān)。α-SMA 作為TGF-β1/Smad 信號通路的下游信號分子之一，TGF-β1/Smad3 信號通路激活可引起α-SMA 表達升高，而α-SMA 的表達升高，將會增加細胞外基質(zhì)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白合成。研究還發(fā)現(xiàn)，模型組中α-SMA 表達明顯增高，提示CILP1 還可能通過激活TGF-β1/Smad3 信號通路，誘導α-SMA 表達升高，而增加Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的合成。

本研究認為，X 線輻射誘導心肌細胞損傷的發(fā)生屬于中醫(yī)“氣虛血瘀”病機，而采用具有“益氣養(yǎng)血活血”功效的RAS-RH 干預后，心肌細胞損傷標志物NT-proBNP、CTnI、CTnT 的含量明顯降低，提示RASRH 可通過“益氣養(yǎng)血”的作用來改善輻射引起的心肌組織氣血失和，臟腑功能結(jié)構(gòu)紊亂。而X 線輻射后CILP1 高表達可通過介導炎癥反應激活TGF-β1/Smad3 信號通路進一步引發(fā)膠原沉積顯著增加、肌纖維排列紊亂、心肌纖維形態(tài)改變，而肌纖維排列紊亂、心肌纖維形態(tài)改變，膠原沉積顯著增加屬中醫(yī)“氣虛血瘀”范疇，氣虛推動乏力，無力驅(qū)邪外出，久病入絡(luò)則脈絡(luò)瘀阻，則導致心肌組織各種代謝活動減弱，而采用具有“益氣養(yǎng)血活血”功效的RAS-RH 干預后心肌組織中的CILP1、TGF-β1、Smad3 表達下調(diào)，同時心肌組織中膠原沉積明顯減輕，心肌纖維程度明前減輕，提示RAS-RH具有“益氣活血”作用。

綜上所述：RAS-RH 可通過抑制心臟CILP1 的表達對X 線輻射后大鼠心肌纖維化具有一定的改善作用，其中醫(yī)學內(nèi)在機制可能與RAS-RH 益氣補血活血的功效相關(guān)。