銀翹解毒片高效液相色譜指紋圖譜研究*

吳 琦，賈銀芝，2，劉益慶△，陳 紅

（1. 連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 連云港 222006；2. 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院連云港檢驗(yàn)室，江蘇 連云港 222006）

銀翹解毒片源自清代吳鞠通《溫病條辨》中的銀翹散［1］，由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、淡竹葉、甘草9 味中藥材組方，有疏風(fēng)解表、清熱解毒功效，主要用于治療風(fēng)熱感冒，癥見(jiàn)發(fā)熱頭痛、咳嗽口干、咽喉疼痛。2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》以綠原酸和連翹苷為含量測(cè)定指標(biāo)控制其質(zhì)量［2］。目前對(duì)銀翹解毒片質(zhì)量控制的研究，主要是利用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定綠原酸［3-4］、連翹苷［5］、連翹酯苷A［3，6-7］、牛蒡苷［3，5］、木犀草苷［3］、甘草酸［8］等的含量，也有研究采用毛細(xì)管電泳［9］（CE）法和HPLC［10-11］串聯(lián)紫外檢測(cè)器（UV）或二極管陣列檢測(cè)器（PDA）法建立銀翹解毒片的指紋圖譜。中藥指紋圖譜能整體反映中藥材或中藥制劑所含化學(xué)成分的種類(lèi)和數(shù)量，因此，研究指紋圖譜對(duì)于制劑的質(zhì)量控制十分必要。但UV 具有一定局限性，如處方中桔梗的主要成分桔梗皂苷D 不能被其檢出，故需要一種通用型檢測(cè)器作為補(bǔ)充。本研究中采用HPLC 與PDA 或蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC - ELSD）聯(lián)合（HPLC - PDA 或HPLC - ELSD）技術(shù)建立了銀翹解毒片的指紋圖譜，為制劑的質(zhì)量控制提供了新的方法和策略。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

E2695 型高效液相色譜儀、包括2998 型PDA 檢測(cè)器、2424 型ELSD 檢測(cè)器（美國(guó)Waters 公司）；BP211D 型電子天平（德國(guó)Sartorius 公司，精度為0.01 mg）；AE -100型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.1 mg）；IQ 7000 型純水機(jī)（美國(guó)Milli-Q 公司）；F-100SD 型超聲波清洗器（深圳福洋科技集團(tuán)有限公司）。

1.2 試藥

銀翹解毒片（15批，11家企業(yè)生產(chǎn)，樣品信息見(jiàn)表1）；綠原酸（批號(hào)為110753-202018，含量96.1%），甘草苷（批號(hào)為111610-201908，含量95.0%），連翹酯苷A（批號(hào)為111810-202108，含量96.2%），木犀草苷（批號(hào)為111720-202111，含量96.6%），橙皮苷（批號(hào)為110721-202019，含量95.3%），連翹苷（批號(hào)為110821- 202117，含量94.9%），牛蒡苷（批號(hào)為110819 - 201812，含量95.0%），桔梗皂苷D（批號(hào)為111851 - 201708，含量97.9%），甘草酸銨（批號(hào)為110731 - 202122，含量94.4%）對(duì)照品，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

表1 15批樣品信息Tab.1 Information of 15 batches of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）- 水（B），梯度洗脫（0～5 min時(shí)8%A，5～25 min時(shí)8%A →17%A，25～34 min時(shí)17%A →18%A，34～57 min 時(shí)18%A →30%A，57～65 min 時(shí)30%A →38%A，65～72 min 時(shí)38%A，72～74 min時(shí)38%A →100%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL；PDA 檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；ELSD條件：漂移管溫度為75 ℃，氣體壓力為25 psi。

2.2 溶液制備

取綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A、木犀草苷、橙皮苷、連翹苷、牛蒡苷、桔梗皂苷D、甘草酸銨的對(duì)照品各約10 mg，精密稱(chēng)定，分別置20 mL容量瓶中，加甲醇15 mL，超聲（功率600 W，頻率40 kHz，下同）處理30 min，放冷至室溫，用甲醇定容，搖勻，即得單一對(duì)照品溶液。

取樣品10 片，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷至室溫，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)S7）適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，以32 號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果HPLC - ELSD 圖譜各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.29%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均小于2.21%（n=6）；HPLC-PDA 圖譜各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.38%（n= 6），相對(duì)峰面積的RSD均小于2.37%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)S7）適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以32 號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，HPLC-ELSD圖譜各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.31%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均小于2.34%（n=6）；HPLC - PDA 圖譜各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.44%（n= 6），相對(duì)峰面積的RSD均小于2.59%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)S7）適量，按2.2 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以32號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，HPLC-ELSD圖譜各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.56%（n= 6），相對(duì)峰面積的RSD均小于2.52%（n=6）；HPLC-PDA 圖譜各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.64%（n= 6），相對(duì)峰面積的RSD均小于2.75%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜建立

HPLC - PDA 指紋圖譜的建立：取15 批樣品適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將各批樣品色譜峰分別進(jìn)行積分，導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版），以編號(hào)S7 樣品的色譜圖作為參照?qǐng)D譜，剪切溶劑峰，選擇中位數(shù)法，時(shí)間窗設(shè)為0.2 min，采用多點(diǎn)校正法建立疊加指紋圖譜（見(jiàn)圖1），生成對(duì)照指紋圖譜（見(jiàn)圖2），根據(jù)匹配結(jié)果共標(biāo)定35 個(gè)共有峰。各共有峰保留時(shí)間的RSD為0.03%～0.68%，峰面積的RSD為19.62%～87.12%，表明共有峰的出峰時(shí)間較穩(wěn)定，但不同批次樣品成分含量波動(dòng)較大。15 批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度結(jié)果見(jiàn)表2。僅1 批樣品（S13）的相似度小于0.9，表明不同廠家不同批次銀翹解毒片的相似性較好。

圖1 15批銀翹解毒片的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC - PDA superimposed fingerprint of 15 batches of Yinqiao Jiedu Tablets

圖2 銀翹解毒片的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器對(duì)照指紋圖譜Fig.2 HPLC - PDA reference fingerprint of Yinqiao Jiedu Tablets

表2 15批銀翹解毒片樣品的相似度Tab.2 Similarity of 15 batches of Yinqiao Jiedu Tablets

HPLC - ELSD 指紋圖譜的建立：按上述方法建立HPLC-ELSD 疊加指紋圖譜（見(jiàn)圖3），生成對(duì)照指紋圖譜（見(jiàn)圖4）。共標(biāo)定26 個(gè)共有峰，其中除36 號(hào)峰外均可與HPLC - PDA 指紋圖譜中的共有峰對(duì)應(yīng)。15 批樣品中，各共有峰保留時(shí)間的RSD為0.04%～0.37%，峰面積的RSD為38.30%～88.81%，表明共有峰的出峰時(shí)間較穩(wěn)定，但不同批次樣品的成分含量波動(dòng)較大。15 批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度結(jié)果見(jiàn)表2。僅2 批（S9 及S13）樣品的相似度小于0.9，表明不同廠家不同批次銀翹解毒片的相似性較好。

圖4 銀翹解毒片的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)照指紋圖譜Fig.4 HPLC - ELSD reference fingerprint of Yinqiao Jiedu Tablets

2.5 共有峰的定性分析

取2.2項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液及供試品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，比對(duì)指認(rèn)色譜峰。HPLCPDA 色譜圖中鑒定出9 號(hào)峰為綠原酸，17 號(hào)峰為甘草苷，20 號(hào)峰為連翹酯苷A，21 號(hào)峰為木犀草苷，26 號(hào)峰為橙皮苷，30 號(hào)峰為連翹苷，32 號(hào)峰為牛蒡苷，35 號(hào)峰為甘草酸銨，詳見(jiàn)圖5。HPLC - ELSD 色譜圖中鑒定出36號(hào)峰為桔梗皂苷D，詳見(jiàn)圖6。

圖5 高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器色譜圖9.Chlorogenic acid 17.Liquiritin 20.Forsythoside A 21.Luteoloside 26.Hesperidin 30.Phillyrin 32.Arctiin 35.Glycyrrhizic acid ammonium saltA.Test solution B.Chlorogenic acid reference solution C.Liquiritin reference solution D.Forsythoside A reference solution E.Luteoloside reference solution F.Hesperidin reference solution G.Phillyrin reference solution H.Arctiin reference solution I.Glycyrrhizic acid ammonium salt reference solutionFig.5 HPLC - PAD chromatograms

圖6 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器色譜圖36.Platycodin DA.Test solution B.Reference solution of platycodin DFig.6 HPLC - ELSD chromatograms

3 討論

3.1 試驗(yàn)條件選擇

預(yù)試驗(yàn)中分別考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水3種流動(dòng)相，結(jié)果顯示，以乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，各成分分離效果較好。分別考察了溫度（30，35，40 ℃）和流速（0.8，1.0，1.2 mL / min）對(duì)色譜峰分離效果的影響，結(jié)果顯示，柱溫為30 ℃、流速為1.0 mL/min 時(shí)能使基線平穩(wěn)，且分離度和峰形達(dá)到較好效果。同時(shí)采用PDA 進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，兼顧各成分的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度和檢測(cè)靈敏度，在230 nm 波長(zhǎng)處色譜圖基線噪音較低，峰數(shù)目多，分離度較好，且基線穩(wěn)定，故選擇230 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。對(duì)ELSD 漂移管溫度（70，75，80 ℃）和氣體壓力（20，25，30 psi）進(jìn)行考察，最終確定漂移管溫度75 ℃、氣體壓力25 psi 為最優(yōu)ELSD參數(shù)。

3.2 檢測(cè)器選擇

PDA 適用于有紫外吸收的化學(xué)成分，對(duì)于無(wú)紫外吸收的成分檢測(cè)具有一定局限性。ELSD 是通用型檢測(cè)器，不依賴(lài)被測(cè)成分的光學(xué)特性，可檢測(cè)無(wú)紫外吸收或紫外吸收較弱的成分。銀翹解毒片處方中桔梗的指標(biāo)成分桔梗皂苷D 紫外吸收較弱，HPLC - ELSD 法較HPLC-UV法更適于桔梗皂苷D的含量測(cè)定［12］。2005年版《中國(guó)藥典（一部）》把2000年版及以前版本中列出的金銀花分列為金銀花和山銀花，在藥典收載變化后，部分廠家申請(qǐng)將處方中的金銀花變更為山銀花，但處方中含金銀花的制劑仍存在用山銀花投料現(xiàn)象［13-16］。山銀花含有金銀花所沒(méi)有的特征成分灰氈毛忍冬皂苷乙，該成分紫外吸收較弱，藥典規(guī)定山銀花中灰氈毛忍冬皂苷乙的測(cè)定采用HPLC-ELSD 法，故將PDA 和ELSD合用，建立更全面的指紋圖譜的同時(shí)也對(duì)金銀花投料的規(guī)范性進(jìn)行有效控制。

3.3 指紋圖譜分析

本研究中建立了銀翹解毒片的HPLC - PDA 和HPLC-ELSD 指紋圖譜，在PDA 和ELSD 下分別標(biāo)定了35 個(gè)和26 個(gè)共有峰，通過(guò)對(duì)照品比對(duì)法指認(rèn)了9 個(gè)共有峰。指紋圖譜相似度結(jié)果表明，11個(gè)廠家的15批銀翹解毒片樣品的相似性較好，但成分的含量存在顯著差異，說(shuō)明生產(chǎn)所用藥材質(zhì)量參差不齊，或者生產(chǎn)工藝轉(zhuǎn)移率不一致。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中所建立的HPLC-PDA-ELSD指紋圖譜，相較單一檢測(cè)法能更全面地反映制劑的指紋圖譜特征，該研究為銀翹解毒片的質(zhì)量控制提供了一定參考。