基于MAPK/NF-κB 通路探究藏紅花素對幼年小鼠肺炎模型的治療作用及分子機制*

董麗君，周波，楊翠玲，李志遠，張永峰

（1．濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，濰坊 261053；2．安丘市人民醫(yī)院影像科，安丘 262199；3．安丘市人民醫(yī)院兒科，安丘 262199；4．山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，濟南 250355；5．濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒科，濰坊 261035）

肺炎是一種常見的下呼吸道疾病，主要由病毒感染、細菌或真菌病原體引起，在世界范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和病死率[1]。肺炎廣泛發(fā)病于兒童中，主要是由于兒童免疫力低下和呼吸道解剖結構的缺陷，其高發(fā)病率和復發(fā)率可引起各種嚴重并發(fā)癥和預后不良，嚴重影響兒童發(fā)育和生命健康[2]。因此，確定兒童肺炎的潛在發(fā)病機制，開發(fā)新的治療策略來抑制肺炎的進展非常重要。革蘭氏陰性菌中的脂多糖（LPS）是一種有效的炎癥內(nèi)毒素，可導致各種器官如肺部炎癥性疾病的發(fā)生，LPS 通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/核因子-κB（NF-κB）通路來促進和擴增炎癥介質的表達，而過度的炎癥浸潤導致肺炎進一步加重[3]。研究發(fā)現(xiàn)，通過下調(diào)NF-κB/MAPK 通路可減弱急性肺炎體外模型的炎癥反應[4]。藏紅花素（CRO）具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗細胞凋亡和心臟保護等多種生物活性，CRO對肺纖維化大鼠模型中的肺部炎癥和肺血管功能障礙有減輕作用[5]。CRO 還能通過抑制p38 MAPK/NF-κB 信號通路發(fā)揮對膿毒癥誘導的肝、腎和肺損傷的保護作用[6]。而CRO 能否通過調(diào)節(jié)MAPK/NFκB 信號通路發(fā)揮幼年肺炎小鼠的保護作用，尚不清楚。本研究通過構建幼年小鼠肺炎模型，探究CRO的治療作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF 級C57BL/6 小鼠80 只，購自武漢貝賽模式生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2022－0029，3～4 周齡，適應性喂養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度 22 ℃左右，濕度 55%，12 h 光暗循環(huán)，不禁水食。本研究通過動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器 CRO（純度≥98%）、白細胞介素（IL）-1β 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）；LPS、髓過氧化物酶（MPO）（北京索萊寶公司）；地塞米松（DEX，福州海王福藥制藥有限公司）；MAPK 激活劑（Anisomycin，美國MedChemExpress 公司）；ELISA 試劑盒：腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6（上海酶聯(lián)生物公司）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（上海翌圣生物公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、吉姆薩染色試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；二抗辣根酶標記山羊抗兔（美國Abcam 公司）；一抗p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、核因子κB 抑制蛋白α（IκBα）和β-actin 抗體（賽默飛世爾科技公司）。全自動酶標儀（奧地利TECAN 公司）；顯微鏡（日本尼康公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠分組、建模和藥物干預 將小鼠隨機分為對照組、模型組、DEX（陽性對照）組、CRO 低劑量組、CRO 中劑量組、CRO 高劑量組、Anisomycin 組（CRO 高劑量+MAPK 激活劑Anisomycin），每組10 只。其中 DEX 組小鼠以2 mg/kg 灌胃[7]，CRO 低、中、高劑量組分別以25、50、100 mg/kg 灌胃[8]、Anisomycin組在CRO 100 mg/kg 基礎上加Anisomycin 2 mg/kg灌胃[9]，對照組和模型組灌胃相同劑量生理鹽水，每天1 次，連續(xù)給藥1 周。除對照組外，其余小鼠最后1 次藥物干預1 h 后，參照文獻[10]采用腹腔注射LPS（5 mg/kg）構建肺炎模型，對照組注射相同劑量生理鹽水。24 h 后小鼠出現(xiàn)呼吸頻率增快、精神萎靡、活動減少等癥狀表明模型構建成功，對造模不成功或出現(xiàn)死亡的各組小鼠共10 只及時補充。

1.3.2 樣本采集 各組小鼠造模72 h 后，眼球取血，離心取上清液-80 ℃保存；麻醉處死小鼠，取5 只小鼠手術暴露氣管并插管，用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3 次，獲得肺泡灌洗液（BALF），離心取上清液-80 ℃保存；剩余5 只小鼠分離肺組織，取小鼠左肺測量濕/干（W/D）比，右肺上葉進行HE 染色，其余肺組織-80 ℃保存進行蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測。

1.3.3 肺W/D 比 取小鼠左肺，擦凈肺組織表面液體后稱質量以獲得濕質量，后將肺組織置于80 ℃的烘箱中 48 h 至質量穩(wěn)定，再次稱取獲得干質量，W/D比由濕質量與干質量之比計算。

1.3.4 HE 染色觀察肺部組織病理變化及病理損傷評分 取小鼠右上葉肺生理鹽水洗凈，4%多聚甲醛固定、石蠟包埋，制備肺切片（4 μm），脫蠟后HE染色，脫水封片在電子顯微鏡下觀察肺部組織病理學變化并拍照。并進行肺組織病理損傷評分，根據(jù)以下參數(shù)進行評分：1）有無出血。2）水腫程度。3）肺泡充血，中性粒細胞在空隙空間或血管壁聚集。4）肺泡壁厚度/透明膜形成。分別記為0～4 分，分數(shù)越高損傷程度越重。

1.3.5 MPO 活性檢測 取-80 ℃肺組織并準確稱質量，并將組織在反應緩沖液中均質化（質量/體積比=1∶19），然后按照MPO 試劑盒說明檢測肺組織的MPO 活性，測定450 nm 處吸光度變化。

1.3.6 BALF 中細胞計數(shù) 取-80 ℃保存的BALF，采用血細胞計數(shù)器和吉姆薩染色進行計數(shù)總細胞、中性粒細胞和白細胞。

1.3.7 血清和BALF 中炎癥因子 取-80 ℃保存的血清和BALF，按照ELISA 試劑盒說明書，檢測炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 的水平。

1.3.8 血清和BALF 中 MDA、SOD 水平 取-80 ℃保存的血清和BALF，按照試劑盒說明書，檢測炎性因子MDA、SOD 的水平。

1.3.9 Western Blot 檢測蛋白表達 取-80 ℃保存幼年小鼠肺組織，用RIPA 裂解，提取總蛋白，用BCA試劑盒進行濃度定量，按步驟將蛋白SDS-PAGE 電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃下加入一抗p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）過夜孵育，清洗，在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000），孵育2 h。用ECL 發(fā)光顯影，觀察拍照，各條帶灰度值用Image J 軟件處理分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 22．0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料統(tǒng)計描述用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗，P＜0．05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠W/D 比和MPO 活性變化 與對照組比較，模型組小鼠肺W/D 比、MPO 活性顯著升高（P＜0．05）；與模型組比較，DEX 組和CRO 低、中、高劑量組肺W/D 比、MPO 活性顯著下降（P＜0．05），DEX 組與CRO 高劑量組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；與CRO 高劑量組比較，Anisomycin 組肺W/D比、MPO 活性顯著升高（P＜0．05）。見表1。

表1 各組小鼠肺W/D 比和MPO 活性比較（±s）Tab.1 Comparison of lung W/D ratio and MPO activity in each group（±s）

表1 各組小鼠肺W/D 比和MPO 活性比較（±s）Tab.1 Comparison of lung W/D ratio and MPO activity in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與CRO 高劑量組比較，△P＜0．05。

?組別動物數(shù)肺W/D 比MPO（U/g）對照組52．58±0．261．28±0．15模型組55．71±0．82*5．82±0．91*DEX 組52．65±0．31#1．42±0．20#CRO 低劑量組54．26±0．57#4．31±0．36#CRO 中劑量組53．14±0．46#3．06±0．42#CRO 高劑量組52．68±0．35#1．40±0．21#Anisomycin 組55．02±0．71△5．68±0．73△

2.2 各組小鼠肺組織病理學變化及病理損傷評分 對照組小鼠肺結構完整，無炎癥、水腫、出血，未見炎性細胞浸潤；模型組小鼠出現(xiàn)肺組織損傷，肺泡壁有增厚融合，水腫破裂的肺泡充滿紅血球，肺間質有炎性細胞浸潤，病理損傷評分顯著升高（P＜0．05）；DEX 組和CRO 低、中、高劑量組小鼠肺組織病理損傷減輕，少量炎性細胞浸潤，DEX 組與CRO 高劑量組改善效果相似，病理損傷評分顯著下降（P＜0．05）；Anisomycin 組相比于CRO 高劑量組，肺部病理損傷加重，病理損傷評分顯著升高（P＜0．05）。見圖1 和表2。

圖1 各組幼年小鼠肺組織HE 染色圖（×200）Fig.1 HE staining of lung tissue in young mice of each group(×200)

表2 各組小鼠肺組織損傷病理評分（±s）Tab.2 Pathological score of lung tissue injury in mice of each group（±s）

表2 各組小鼠肺組織損傷病理評分（±s）Tab.2 Pathological score of lung tissue injury in mice of each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與CRO 高劑量組比較，△P＜0．05。

?

2.3 各組小鼠BALF 中細胞計數(shù) 與對照組比較，模型組小鼠總細胞、中性粒細胞和白細胞計數(shù)顯著升高（P＜0．05）；與模型組比較，DEX 組和CRO 低、中、高劑量組總細胞、中性粒細胞和白細胞計數(shù)顯著下降（P＜0．05），DEX 組與CRO 高劑量組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；與CRO 高劑量組比較，Anisomycin 組總細胞、中性粒細胞和白細胞計數(shù)顯著升高（P＜0．05）。見表3。

表3 各組小鼠BALF 中細胞計數(shù)（±s）Tab.3 Cell count in BALF of mice in each group（±s）

表3 各組小鼠BALF 中細胞計數(shù)（±s）Tab.3 Cell count in BALF of mice in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與CRO 高劑量組比較，△P＜0．05。

中性粒細胞（105/mL）對照組51．09±0．100．31±0．060．81±0．10模型組52．87±0．38* 1．04±0．11*1．69±0．21*DEX 組51．35±0．18#0．53±0．09#0．94±0．09#CRO 低劑量組51．91±0．22#0．86±0．10#1．14±0．13#CRO 中劑量組51．64±0．19#0．62±0．08#1．03±0．12#CRO 高劑量組51．26±0．15#0．51±0．07#0．89±0．08#Anisomycin 組52．36±0．27△ 0．91±0．10△ 1．34±0．15△組別動物數(shù)總細胞（105/mL）白細胞（105/mL）

2.4 各組小鼠血清和BALF 中炎癥因子比較 與對照組比較，模型組小鼠血清和BALF 中 IL-6、IL-1β和TNF-α 水平顯著升高（P＜0．05）；與模型組比較，DEX 組和CRO 低、中、高劑量組血清和BALF 中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平顯著下降（P＜0．05），DEX組與CRO 高劑量組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；與CRO 高劑量組比較，Anisomycin 組血清和BALF中 IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平顯著升高 （P＜0．05）。見表4。

表4 各組小鼠血清和BALF 中炎癥因子比較（±s）Tab.4 Comparison of inflammatory factors in serum and BALF of mice in each group（±s） pg/mL

表4 各組小鼠血清和BALF 中炎癥因子比較（±s）Tab.4 Comparison of inflammatory factors in serum and BALF of mice in each group（±s） pg/mL

注：與對照組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與CRO 高劑量組比較，△P＜0．05。

組別動物數(shù)血清BALF IL-6IL-1βTNF-αIL-6IL-1βTNF-α對照組519．42± 2．5119．73±2．4139．65±4．2721．25± 2．1423．18±3．0445．62± 5．09模型組581．57±10．16*63．82±7．35*87．30±9．31*98．41±10．61*78．36±8．53*117．39±12．03*DEX 組534．91± 3．17#26．19±3．62#43．17±4．57#43．28± 5．24#33．18±6．84#51．37± 5．46#CRO 低劑量組554．02± 6．83#42．58±5．23#63．57±6．39#74．38± 8．36#63．52±7．25#75．96± 8．03#CRO 中劑量組543．16± 5．60#38．06±4．75#55．28±5．42#51．52± 6．71#45．87±6．38#68．14± 7．52#CRO 高劑量組535．19± 3．81#27．05±3．16#42．05±5．14#40．81± 4．74#32．06±7．15#52．13± 5．24#Anisomycin 組565．10± 7．02△45．26±5．82△71．24±8．08△82．07±10．51△66．25±7．32△96．27±10．26△

2.5 各組小鼠血清和BALF 中 MDA、SOD 水平比較 與對照組比較，模型組小鼠血清和BALF 中 MDA水平顯著升高，SOD 水平顯著下降（P＜0．05）；與模型組比較，DEX 組和CRO 低、中、高劑量組血清和BALF中 MDA 水平顯著下降，SOD 水平顯著升高（P＜0．05），DEX 組與CRO 高劑量組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；與CRO 高劑量組比較，Anisomycin 組血清和BALF 中 MDA 水平顯著升高，SOD 水平顯著下降（P＜0．05）。見表5。

表5 各組小鼠血清和BALF 中MDA、SOD 比較（±s）Tab.5 Comparison of MDA and SOD in serum and BALF of mice in each group（±s）

表5 各組小鼠血清和BALF 中MDA、SOD 比較（±s）Tab.5 Comparison of MDA and SOD in serum and BALF of mice in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與CRO 高劑量組比較，△P＜0．05。

SOD（U/mL）對照組513．52±2．47 53．29±6．01 18．43±2．71 59．23±5．31模型組561．38±6．84* 21．57±3．64* 63．18±6．49* 23．47±3．15*DEX 組526．38±3．71# 48．36±6．29# 25．17±3．08# 50．39±6．14#CRO 低劑量組549．06±4．91# 30．52±4．37# 46．39±5．17# 38．47±4．61#CRO 中劑量組538．25±3．92# 41．08±6．03# 36．59±4．27# 45．36±5．71#CRO 高劑量組527．58±3．06# 49．53±6．38# 24．68±3．25# 51．08±6．35#Anisomycin 組551．86±6．93△25．72±3．14△50．63±6．84△25．72±3．14△組別動物數(shù)血清BALF MDA（nmol/mL）SOD（U/mL）MDA（nmol/mL）

2.6 各組小鼠MAPK/NF-κB 通路蛋白表達比較 與對照組比較，模型組小鼠p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα 顯著升高（P＜0．05）；與模型組比較，DEX 組和CRO 低、中、高劑量組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NFκB p65、p-IκBα/IκBα 顯著下降（P＜0．05），DEX 組與CRO 高劑量組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；與CRO高劑量組比較，Anisomycin 組p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα 顯著升高（P＜0．05）。見圖2 和表6。

圖2 各組小鼠肺組織蛋白表達結果Fig.2 Protein expression in lung tissue of mice in each group

表6 各組小鼠MAPK/NF-κB 通路蛋白表達比較（±s）Tab.6 Comparison of MAPK/NF-κB pathway protein expression of mice in each group（±s）

表6 各組小鼠MAPK/NF-κB 通路蛋白表達比較（±s）Tab.6 Comparison of MAPK/NF-κB pathway protein expression of mice in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與CRO 高劑量組比較，△P＜0．05。

p-IκBα/IκBα對照組50．45±0．070．53±0．080．48±0．05模型組50．96±0．12*0．98±0．09*0．94±0．10*DEX 組50．49±0．07#0．62±0．06#0．55±0．06#CRO 低劑量組50．73±0．08#0．80±0．08#0．82±0．09#CRO 中劑量組50．65±0．07#0．68±0．08#0．70±0．08#CRO 高劑量組50．47±0．05#0．58±0．06#0．53±0．06#Anisomycin 組50．78±0．08△0．90±0．09△ 0．85±0．09△組別動物數(shù)p-p38 MAPK/p38 MAPK p-NF-κB p65/NF-κB p65

3 討論

由于兒童的氣道纖毛和免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，呼吸道經(jīng)常暴露在碳顆粒、病毒和其他刺激物中，很容易引起肺炎等呼吸道疾病，嚴重影響患兒的生長發(fā)育，造成沉重的經(jīng)濟和社會負擔[2]。LPS 與許多肺部炎癥性疾病的發(fā)展有關，可刺激呼吸系統(tǒng)的免疫功能，引起急、慢性炎癥反應，導致肺損傷、肺氣腫、氣道重塑等病理改變，影響兒童肺發(fā)育[11]。以往的研究主要是針對中老年呼吸系統(tǒng)疾病，而關于兒科呼吸系統(tǒng)疾病研究相對較少。本研究通過LPS 法構建幼年小鼠肺炎模型，選用3～4 周齡小鼠，其免疫功能和組織修復功能弱，肺部發(fā)育與人類的童年早期相似，為探究兒童肺炎的機制及臨床應用奠定基礎。本研究結果顯示，模型組小鼠出現(xiàn)肺組織損傷，肺泡水腫出血，大量炎性細胞浸潤，肺W/D比和病理損傷評分顯著升高，表明肺炎小鼠模型構建成功。模型組小鼠BALF 中總細胞、中性粒細胞和白細胞計數(shù)顯著升高，且血清和BALF 中 TNF-α、IL-lβ、IL-6、MDA 水平顯著升高，SOD 水平顯著降低，表明LPS 誘導炎癥因子和氧化應激反應，多種炎癥因子又通過激活中性粒細胞和巨噬細胞活化，進一步導致肺部炎癥發(fā)生。

CRO 已被證實能通過發(fā)揮抗氧化、抗炎等作用對肺部炎癥損傷起到保護作用，不僅可通過抑制炎癥信號通路來緩解LPS 誘導的急性呼吸窘迫綜合征和肺損傷[12]；還通過發(fā)揮對白細胞和淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)作用，降低卵清蛋白致敏小鼠肺部炎癥[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，CRO 干預后小鼠肺組織病理損傷減輕，少量炎性細胞浸潤，肺W/D 比和病理損傷評分、BALF 中總細胞、中性粒細胞和白細胞計數(shù)以及血清和BALF 中炎癥因子和MDA 水平顯著降低，SOD水平顯著升高，表明CRO 具有減輕小鼠肺炎的功效，主要是通過發(fā)揮抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)作用。本研究還選用DEX 作為陽性藥物，其對小鼠肺炎損傷的改善效果與CRO 高劑量組效果相似，說明CRO對LPS 誘導的肺炎具有很好的改善效果。

MAPK 作為介導基本生物學過程和細胞對外部應激的信號分子，可被各種炎癥和應激刺激激活來調(diào)節(jié)免疫應答，p38 MAPK 通路作為MAPK 信號傳導的紐帶，與炎癥密切相關，在TNF-α、IL-1β 和IL-6的產(chǎn)生中起重要作用[13]。且MAPK 是NF-κB的上游激活劑，p38 MAPK 在NF-κB 向細胞核的活化和遷移中起重要作用，可通過激活NF-κB 促進促炎介質的表達。正常情況下，NF-κB 以非活性狀態(tài)與IκB結合的狀態(tài)存在于細胞質中，LPS 刺激增加MAPK的磷酸化，導致NF-κB 活化并以p65 活性形式易位到細胞核中，增加促炎細胞因子表達和過度炎癥反應的發(fā)生[14]。Wang 等[15]研究發(fā)現(xiàn)抑制p38 MAPK 可緩解肺缺血再灌注損傷，可能是治療急性肺損傷的有效方法。Yu 等[16]也發(fā)現(xiàn)使用NF-κB 抑制劑可改善炎癥，進而預防LPS 誘導的急性腎損傷和肺損傷。還有研究表明，抑制MAPK/NF-κB 信號通路可以減少肺部炎癥和血管重塑，并減輕 LPS 誘導的急性肺損傷[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα表達顯著升高，表明LPS 刺激可能激活MAPK/NFκB 信號通路。而CRO 干預后p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα 表達降低，表明CRO 可能具有抑制MAPK/NF-κB 激活的作用。這與CRO 通過抑制p38 MAPK/NF-κB信號通路發(fā)揮對膿毒癥誘導的肝、腎和肺損傷的保護作用，以及抑制NF-κB 信號傳導來減輕心肌纖維化中的氧化應激、炎癥和細胞凋亡[6，18]結果相似，為進一步驗證CRO 對MAPK/NF-κB 信號通路的干預作用，本研究在CRO 高 劑量組的基礎上加上MAPK 激活劑Anisomycin，CRO 對LPS 誘導的肺炎小鼠的改善作用受到抑制，因此猜測CRO 的作用機制可能與抑制MAPK/NF-κB 信號通路的激活有關。

綜上，CRO 可能通過抑制MAPK/NF-κB 通路激活，減少炎癥反應和氧化應激，對LPS 誘導的肺炎小鼠肺部損傷有治療作用。本研究為改善幼年肺炎小鼠提供了新思路，但僅初步探討CRO 對幼年肺炎小鼠的治療作用，后續(xù)將進一步探討CRO 對成年小鼠的治療作用以及研究藥物與年齡的相關性。