白藜蘆醇調(diào)控SDF-1/CXCR4 通路對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的影響*

陳萌萌，邢春花

（1.哈爾濱市第四醫(yī)院口腔科，哈爾濱 150026；2.哈爾濱市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，哈爾濱 150026）

骨關(guān)節(jié)炎是一種進(jìn)行性退行性疾病，常導(dǎo)致軟骨和周圍組織惡化，引起關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙，顳下頜關(guān)節(jié)是受骨關(guān)節(jié)炎影響的最常見(jiàn)部位之一[1]。顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（TMJOA）的特征包括進(jìn)行性軟骨變性，軟骨下骨重塑異常和滑膜炎，并伴隨咀嚼困難、疼痛及頜面部畸形等癥狀[2]。軟骨細(xì)胞作為軟骨的常駐細(xì)胞，是維持軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵介質(zhì)，其細(xì)胞凋亡和功能損傷會(huì)破壞軟骨的穩(wěn)態(tài)，加速骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程[3]。因此，研究軟骨細(xì)胞的凋亡機(jī)制對(duì)TMJOA 的治療有重要意義?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）屬于α 趨化因子家族，是一種小分子量的趨化因子蛋白。CXC 趨化因子受體4（CXCR4）在多種組織和器官中廣泛表達(dá)，是SDF-1 的唯一特異性受體。當(dāng)SDF-1 與CXCR4 特異性結(jié)合時(shí)，可以發(fā)揮多種生物學(xué)功能[4]。最近有研究顯示，SDF-1/CXCR4 在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，阻斷SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路能夠抑制TMJOA 的成骨分化，減輕軟骨損傷[5-6]。白藜蘆醇（RES）是天然的多酚類物質(zhì)，是植物在脅迫下產(chǎn)生的一種植物抗毒素，具有抗癌、抗氧化、抗炎等特性。前期有研究發(fā)現(xiàn)RES 可以有效改善炎癥損傷防止骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展，減輕白細(xì)胞介素-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷，同時(shí)也可以通過(guò)下調(diào)TMJOA 中的環(huán)氧化物酶2（COX-2）/核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路，抑制軟骨細(xì)胞凋亡[7-8]。但有關(guān)細(xì)胞增殖和炎癥誘導(dǎo)COX-2 的機(jī)制還尚未得到證實(shí)。另一項(xiàng)研究顯示，COX-2 是SDF-1/CXCR4 軸下游信號(hào)通路的重要成員之一，SDF-1 能夠增強(qiáng)COX-2 的表達(dá)[9]。因此，本研究探討了RES是否能夠通過(guò)調(diào)控SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路來(lái)抑制TMJOA 大鼠的軟骨細(xì)胞凋亡，為RES 成為TMJOA 的治療策略提供更充分的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)Wistar 大鼠36 只，6 周齡，（160±20）g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0002。實(shí)驗(yàn)前將所有大鼠置于溫度 26 ℃，濕度 60%的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 白藜蘆醇（HPLC≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司）；AMD3100（貨號(hào)：HY-10046，美國(guó)MedChemExpress 公司）；重組SDF-1（貨號(hào)：ab9798，英國(guó)Abcam 公司）；蘇木精-伊紅（HE）染色液、改良番紅 O-固綠軟骨染色液（貨號(hào)：SY2022、SY1418，北京伊塔生物科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：FY600003-20T，弗元生物科技有限公司）；一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（NO）、細(xì)胞色素C（Cyt C）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：XYELISA0380、XY-SJH-2984、XY-SJH-3050，上海烜雅生物科技有限公司）；caspase-9、Bcl-2、Bax、SDF-1、CXCR4 兔單抗（貨號(hào)：ab32539、ab182858、ab32503、ab155090、ab124824，英國(guó)Abcam 公司）；山羊抗兔lgG（H+L）（貨號(hào)：AP31L014，和元李記生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 TMJOA 大鼠模型建立和分組處理 將所有大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、CXCR4 抑制劑組（AMD3100 組）、RES 低劑量組、RES 高劑量組、RES高劑量+重組SDF-1 組（RES 高+SDF-1 組），每組6 只。除對(duì)照組，其余組均通過(guò)在大鼠顳下頜關(guān)節(jié)上腔內(nèi)注射12.5 μL 膠原酶建立TMJOA 模型[8]。1 周后，AMD3100 組關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40 μL 濃度為1 μg/μL的CXCR4 抑制劑AMD3100[6]；RES 低、高劑量組關(guān)節(jié)腔內(nèi)分別注射80 μL 濃度為1.25、12.5 μg/μL 的RES[10]，RES 高+重組SDF-1 組先注射80 μL 濃度為12.5 μg/μL 的RES，再注射劑量為30 μg/kg 的重組SDF-1，對(duì)照組和模型組用相同方式注射等量的生理鹽水，每周注射3 次，持續(xù)4 周。

1.2.2 細(xì)胞分離和培養(yǎng) 干預(yù)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取3 只大鼠用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉并處死，取顳下頜關(guān)節(jié)，用手術(shù)刀片輕輕刮取髁突軟骨組織層，然后將軟骨組織用無(wú)菌生理鹽水清洗，并剪成體積小于1 mm3的碎塊兒，用0.1%Ⅱ型膠原酶在37 ℃下消化5 h，然后吹打過(guò)濾后，2 000×g 離心 10 min，離心半徑10 cm，收集細(xì)胞用含有10%胎牛血清 DEME 培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h 后再次收集細(xì)胞立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 組織學(xué)染色觀察軟骨組織病理學(xué)變化 按照1.2.2 中的方法收集每組剩余大鼠的髁突軟骨組織，放入4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，然后進(jìn)行石蠟包埋并切片。接著按照常規(guī)步驟用二甲苯和梯度乙醇脫蠟水化，然后將組織切片分別放入HE 染色液和番紅 O-固綠染液中染色20 min，再次使用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后中性樹(shù)脂封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察髁突軟骨組織結(jié)構(gòu)形態(tài)和基質(zhì)蛋白多糖的變化，并參考文獻(xiàn)[11]中 Mankin 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)估軟骨組織損傷情況。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將1.2.2 中收集的軟骨細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，分別加入10 μL Annexin V-FITC 和10 μL 碘化丙啶（PI），室溫避光孵育15 min。用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞中 iNOS、NO、Cyt C 的水平將1.2.2 中收集的軟骨細(xì)胞，加入PBS 重懸后，4℃，2 000×g 離心 10 min，離心半徑10 cm，收集上清液。然后按照ELISA 試劑盒的操作步驟檢測(cè)軟骨細(xì)胞中 iNOS、NO、Cyt C 的含量。

1.2.6 蛋白免疫印跡分析（Western Blot）檢測(cè)軟骨細(xì)胞中 caspase-9、Bcl-2、Bax、SDF-1、CXCR4 蛋白表達(dá) 將1.2.2 中收集的軟骨細(xì)胞置于玻璃勻漿器中，加入蛋白裂解液勻漿，離心收集上清液，用BCA測(cè)定蛋白濃度。然后用10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶將PVDF 膜在4 ℃下封閉過(guò)夜，隨后加入一抗稀釋液（caspase-9、Bcl-2、Bax 比例1∶1 000，SDF-1 比例1∶10 000，CXCR4 比例1：100），室溫孵育2 h 后加入羊抗兔IgG 二抗稀釋液（1∶500）中，室溫孵育2 h，最后用ECL 顯影。以GAPDH 為內(nèi)參蛋白，用凝膠成像儀和Image J 軟件觀察并分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究數(shù)據(jù)均采用Graphpad prism8.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠軟骨組織的病理學(xué)變化 對(duì)照組髁突軟骨組織結(jié)構(gòu)層次清晰，軟骨細(xì)胞排列整齊，軟骨著色均勻，主要著色部位在軟骨淺層；與對(duì)照組比較，模型組軟骨組織層次紊亂，細(xì)胞數(shù)量減少，軟骨著色明顯減退，組織損傷評(píng)分增加（P＜0.05）；與模型組比較，AMD3100 組和RES 組軟骨組織結(jié)構(gòu)層次逐漸明顯，細(xì)胞數(shù)量增多，軟骨著色增加，組織損傷評(píng)分減少（P＜0．05）；與RES 高劑量組比較，RES高+SDF-1 組軟骨組織的病理變化與模型組相似，組織損傷評(píng)分增加（P＜0．05），見(jiàn)圖1 和表1。

圖1 HE 和番紅O-固綠染色檢測(cè)各組大鼠軟骨組織損傷情況（×100）Fig.1 HE and saffron O-fast green staining were used to detect the damage of cartilage tissue in rats in each group(×100)

表1 各組大鼠軟骨組織的損傷評(píng)分比較（±s）Tab.1 Damage score of cartilage tissue in rats in each group（±s） 分

表1 各組大鼠軟骨組織的損傷評(píng)分比較（±s）Tab.1 Damage score of cartilage tissue in rats in each group（±s） 分

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與AMD3100 組比較，△P＜0．05；與RES 高劑量組比較，▲P＜0．05。

?組別動(dòng)物數(shù)Mankin 評(píng)分對(duì)照組63．21±0．79模型組612．46±1．63*AMD3100 組66．48±1．08#RES 低劑量組69．14±1．37#△RES 高劑量組66．32±0．93#RES 高+SDF-1 組611．74±1．48△▲

2.2 各組大鼠軟骨細(xì)胞的凋亡情況比較 與對(duì)照組比較，模型組軟骨細(xì)胞凋亡率增加（P＜0．05）；與模型組比較，AMD3100 組和RES 組軟骨細(xì)胞凋亡率降低（P＜0．05）；與RES 高劑量組比較，RES 高+SDF-1組軟骨細(xì)胞凋亡率增加（P＜0．05），見(jiàn)圖2 和表2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡Fig.2 Detection of chondrocyte apoptosis in each group of rats by flow cytometry

表2 各組大鼠軟骨細(xì)胞的凋亡率比較（±s）Tab.2 Apoptosis rate of rat chondrocytes in each group（±s） %

表2 各組大鼠軟骨細(xì)胞的凋亡率比較（±s）Tab.2 Apoptosis rate of rat chondrocytes in each group（±s） %

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與AMD3100 組比較，△P＜0．05；與RES 高劑量組比較，▲P＜0．05。

?組別動(dòng)物數(shù)細(xì)胞凋亡率對(duì)照組32．57±0．12模型組378．69±2．47*AMD3100 組323．97±1．12#RES 低劑量組356．42±1．53#△RES 高劑量組322．17±1．03#RES 高+SDF-1 組375．52±2．38△▲

2.3 各組大鼠軟骨細(xì)胞中 iNOS、NO、Cyt C 的水平比較 與對(duì)照組比較，模型組軟骨細(xì)胞中 iNOS、NO、Cyt C 含量升高（P＜0．05）；與模型組比較，AMD3100組和RES 組軟骨細(xì)胞中 iNOS、NO、Cyt C 含量降低（P＜0．05）；與RES 高劑量組比較，RES 高+SDF-1 組軟骨細(xì)胞中 iNOS、NO、Cyt C 含量升高（P＜0．05），見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠軟骨細(xì)胞中iNOS、NO、Cyt C 水平比較（±s）Tab.3 Levels of iNOS，NO and Cyt C in chondrocytes of rats in each group（±s） pg/mL

表3 各組大鼠軟骨細(xì)胞中iNOS、NO、Cyt C 水平比較（±s）Tab.3 Levels of iNOS，NO and Cyt C in chondrocytes of rats in each group（±s） pg/mL

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與AMD3100 組比較，△P＜0．05；與RES 高劑量組比較，▲P＜0．05。

組別對(duì)照組模型組AMD3100 組RES 低劑量組RES 高劑量組RES 高+SDF-1 組動(dòng)物數(shù)333333 iNOSNOCyt C 18．67±2．2529．54±2．6954．92±3．36 65．39±3．42*94．61±3．72*127．79±4．86*30．14±2．39#43．42±2．53#70．67±3．47#46．82±3．16#△ 72．18±3．25#△91．41±4．52#△28．37±2．34#41．89±2．64#69．86±3．81#62．26±3．40△▲ 90．16±3．63△▲ 123．94±4．45△▲

2.4 各組大鼠軟骨細(xì)胞中 caspase-9、Bcl-2、Bax、SDF-1、CXCR4 蛋白的表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組軟骨細(xì)胞中 caspase-9、Bax、SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0．05）；與模型組比較，AMD3100 組和RES 組軟骨細(xì)胞中 caspase-9、Bax、SDF-1、CXCR4 蛋白表達(dá)降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)升高（P＜0．05）；與RES 高劑量組比較，RES 高+SDF-1組軟骨細(xì)胞中 caspase-9、Bax、SDF-1、CXCR4 蛋白表達(dá)升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0．05），見(jiàn)圖3 和表4。

圖3 各組大鼠軟骨細(xì)胞中caspase-9、Bcl-2、Bax、SDF-1、CXCR4 蛋白表達(dá)條帶Fig.3 Expression bands of caspase-9，Bcl-2，Bax，SDF-1 and CXCR4 in rat chondrocytes of each group

表4 各組大鼠軟骨細(xì)胞中caspase-9、Bcl-2、Bax、SDF-1、CXCR4 蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab.4 Relative expressions of caspase-9，Bcl-2，Bax，SDF-1 and CXCR4 proteins in rat chondrocytes in each group（±s）

表4 各組大鼠軟骨細(xì)胞中caspase-9、Bcl-2、Bax、SDF-1、CXCR4 蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab.4 Relative expressions of caspase-9，Bcl-2，Bax，SDF-1 and CXCR4 proteins in rat chondrocytes in each group（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05；與AMD3100 組比較，△P＜0．05；與RES 高劑量組比較，▲P＜0．05。

組別動(dòng)物數(shù)caspase-9/GAPDHBcl-2/GAPDHBax/GAPDHSDF-1/GAPDHCXCR4/GAPDH對(duì)照組30．81±0．061．03±0．060．92±0．070．90±0．060．95±0．08模型組31．89±0．13*0．32±0．02*2．10±0．14*1．97±0．14*2．15±0．16*AMD3100 組31．23±0．07#0．85±0．06#1．31±0．07#1．28±0．08#1．37±0．07#RES 低劑量組31．51±0．10#△0．57±0．04#△1．68±0．12#△1．62±0．12#△1．71±0．14#△RES 高劑量組31．21±0．07#0．86±0．07#1．29±0．06#1．27±0．07#1．36±0．08#RES 高+SDF-1 組31．87±0．12△▲0．34±0．02△▲2．08±0．15△▲1．96±0．15△▲2．13±0．15△▲

3 討論

TMJOA 是一種影響顳下頜關(guān)節(jié)最常見(jiàn)的慢性退行性關(guān)節(jié)炎疾病，主要特征是軟骨細(xì)胞死亡、ECM 降解和軟骨下骨重塑。顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨變性與TMJOA 的發(fā)展密切相關(guān)。軟骨逐漸變性是由軟骨細(xì)胞調(diào)節(jié)不當(dāng)以及組織破壞與生成之間的不平衡引起的，髁突軟骨細(xì)胞作為顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨中唯一的細(xì)胞類型，在軟骨變性過(guò)程中起著決定性作用[12-13]。研究顯示軟骨細(xì)胞更新的增加引發(fā)了髁突軟骨的退化，細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡加速了關(guān)節(jié)軟骨的破壞。軟骨細(xì)胞的異常死亡不僅會(huì)減少軟骨細(xì)胞的數(shù)量，還會(huì)引發(fā)軟骨的退化和軟骨下骨的破壞[14]。因此，抑制軟骨細(xì)胞凋亡是保護(hù)軟骨組織免受損傷的重要途徑。本研究首先通過(guò)HE 和番紅 O-固綠染色檢測(cè)TMJOA 髁突軟骨組織的損傷情況，結(jié)果顯示模型組軟骨組織結(jié)構(gòu)層次紊亂，細(xì)胞數(shù)量減少，軟骨著色明顯減退，損傷評(píng)分升高，揭示了TMJOA 大鼠模型建立成功。而RES 低、高劑量組軟骨組織結(jié)構(gòu)層次逐漸明顯，細(xì)胞數(shù)量增多，軟骨著色增加，損傷評(píng)分降低，揭示了RES 可以緩解大鼠的軟骨組織損傷。接著分離軟骨細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示模型組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，RES低、高劑量組細(xì)胞凋亡率低于模型組，揭示了RES可以抑制TMJOA 大鼠髁突軟骨細(xì)胞的凋亡，減輕關(guān)節(jié)軟骨的損傷。

鈣在軟骨細(xì)胞凋亡中也存在非常重要的作用，細(xì)胞內(nèi)高濃度鈣可以激活誘導(dǎo)型iNOS，從而誘導(dǎo)NO抑制線粒體呼吸，并通過(guò)釋放Cyt C 和caspase-9導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡[15]。已知Bcl-2 超家族成員也是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，該超家族可分為促凋亡和抗凋亡成員，促凋亡成員如Bax 主要位于細(xì)胞質(zhì)中，抗凋亡成員如Bcl-2 本身主要定位于線粒體外膜[16]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組軟骨細(xì)胞中 iNOS、NO、Cyt C 含量及Bax 蛋白表達(dá)升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)降低；而RES 低、高劑量組iNOS、NO、Cyt C 含量及Bax 蛋白表達(dá)升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)升高。揭示了RES 可以抑制TMJOA 大鼠髁突軟骨細(xì)胞中的鈣濃度及促凋亡因子的表達(dá)，從而抑制軟骨細(xì)胞凋亡，減輕 TMJOA 的軟骨損傷。

SDF-1 是一種與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子，在鄰近關(guān)節(jié)軟骨的滑膜中被發(fā)現(xiàn)，來(lái)自滑膜的外源SDF-1可以與軟骨細(xì)胞膜上的G 蛋白偶聯(lián)受體CXCR4 結(jié)合，隨后進(jìn)入軟骨細(xì)胞并調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖、存活、分化和成熟[17-18]。有研究證明SDF-1 與CXCR4的結(jié)合通過(guò)誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白的分泌導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞基質(zhì)的降解，且SDF-1/CXCR4 可誘導(dǎo)過(guò)度功能矯形引起的TMJOA 成骨分化并導(dǎo)致軟骨降解[6]。已知CXCR4 的抑制劑AMD3100 已有效用于治療骨關(guān)節(jié)炎，也可以減輕碘乙酸鈉誘導(dǎo)的TMJOA的嚴(yán)重程度[19-20]。因此，本研究將AMD3100 作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果顯示，模型組軟骨細(xì)胞中 SDF-1 和CXCR4 的蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，RES 低、高劑量組細(xì)胞中 SDF-1 和CXCR4 的蛋白表達(dá)明顯低于模型組，AMD3100 組細(xì)胞凋亡率、凋亡相關(guān)因子mRNA 水平和SDF-1、CXCR4 蛋白表達(dá)與RES 高劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，揭示了RES 可以抑制SDF-1 與受體CXCR4 結(jié)合，其作用與AMD3100 作用一致。在RES 高劑量的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加入重組蛋白SDF-1，SDF-1 表達(dá)的升高逆轉(zhuǎn)了RES 對(duì)信號(hào)通路以及軟骨細(xì)胞凋亡的抑制作用。揭示了RES 可能是通過(guò)阻斷SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路來(lái)抑制TMJOA大鼠軟骨細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，RES 可以通過(guò)阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路抑制TMJOA 大鼠軟骨細(xì)胞的凋亡。本研究為尋找治療TMJOA 的潛在藥物提供了新思路和治療策略。但骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制比較復(fù)雜，因此RES 對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的凋亡機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。