UPLC-Q-TOF/MS 結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討山豆根抗肝癌的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制*

王曉雯，張?jiān)拢船?，舒樂新，劉艷普，魏金霞，程文播，蔡挺

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617；2.山東廣通寶醫(yī)藥有限公司，青州 262500；3.天津市醫(yī)用質(zhì)譜精準(zhǔn)診斷企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)譜應(yīng)用中心，天津 300399；4.中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院，寧波 315010）

原發(fā)性肝癌在臨床上屬于常見惡性腫瘤，是中國第2 位腫瘤致死病因[1]。肝癌患者缺乏特異性篩選方法且早期癥狀缺乏典型性，大多數(shù)患者在診斷時(shí)已經(jīng)處于晚期狀態(tài)，處于肝癌晚期的患者5 年內(nèi)的生存率下降到2%[2-3]。近幾十年，治療肝癌已采用局部消融術(shù)和經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)等非根治性治療，以及靶向治療及免疫治療等[4]，但是還存在著遠(yuǎn)期療效與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的局限性。因此，探索有效的肝癌治療方法和藥物仍是目前首要的問題。近年來，中醫(yī)藥由于具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的優(yōu)勢(shì)，被廣泛認(rèn)可用于肝癌治療，可以減少疾病的復(fù)發(fā)[5]。肝癌的病因，綜合各醫(yī)家的中醫(yī)理論，主要包括正氣虧虛、肝脾失調(diào)、癌毒、脾虛等[6]。不同病因引起的肝癌采用不同的治療方法，正氣虧虛導(dǎo)致的肝癌應(yīng)該扶正祛邪，用活血化瘀、疏肝行氣、補(bǔ)腎益精等中藥；癌毒類導(dǎo)致的肝癌應(yīng)用清熱 解毒、化瘀軟堅(jiān)等中藥；脾虛導(dǎo)致的肝癌應(yīng)該益氣健脾，用清熱利濕、疏肝理氣等中藥[7]。山豆根為豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根和根莖，具有清熱解毒，消腫利咽的功效。目前藥理研究報(bào)道，山豆根不僅有抗炎、保肝等作用，還有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)心血管系統(tǒng)等藥理作用。其中許多研究表明，山豆根具有很好的抗肝癌作用，研究發(fā)現(xiàn)山豆根提取物能夠抑制人肝母細(xì)胞瘤HepG2 細(xì)胞、人肝癌Hep3B 細(xì)胞的增殖，山豆根生物堿能產(chǎn)生明確的體內(nèi)抗肝腫瘤藥理作用[8-12]。然而，目前山豆根抗肝癌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚不十分明確。

超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)與傳統(tǒng)的高效液相相比，具有小顆粒高性能微粒固定相、超高壓輸液泵，其具有分析速度快、質(zhì)量精度高、靈敏度高和分辨率高等特點(diǎn)[13]。UNIFI 1.8 軟件配有天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫，該庫中有6 000 多種組分，與UPLC-Q-TOF/MS 配合使用，代替了傳統(tǒng)的人工提峰、計(jì)算分子式及分析碎片斷裂情況的模式，有利于更高效率地識(shí)別中藥中的復(fù)雜化學(xué)成分及其化學(xué)結(jié)構(gòu)，為研究中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持[14-16]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)模型建立藥物、靶點(diǎn)與疾病間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，是多數(shù)據(jù)、多學(xué)科融合的產(chǎn)物，表明了中藥的多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，適合運(yùn)用于探索中藥藥理作用的作用靶點(diǎn)以及作用機(jī)制[17-19]。

因此，本研究利用UPLC-Q-TOF/MS 結(jié)合UNIFI 1.8 軟件快速鑒定山豆根的化學(xué)成分，通過應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)篩選出山豆根抗肝癌的活性成分及核心靶點(diǎn)，以及細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相關(guān)成分的抗肝癌作用，從分析化學(xué)成分和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度進(jìn)而探究山豆根抗肝癌作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分分析部分

1.1.1 藥材、試劑和儀器 山豆根飲片（安國藥材市場(chǎng)，批號(hào)：2020G10111），經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院李天祥教授鑒定為豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根和根莖；色譜級(jí)甲醇、乙醇（賽默飛世爾科技有限公司）；超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Xevo G2 Q-TOF 質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；ACQUITY UPLC 型二元泵和樣品管理器（美國Waters 公司）；色譜柱[美國Waters 公司ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）]；SB-120DT 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；H1750R 離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法 稱取山豆根飲片50 g，用4 倍量的95%乙醇溶劑加熱回流提取3 次，濾渣用4 倍量的75%乙醇溶劑加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，在4 ℃以12 000 r/min，離心 15 min（離心機(jī)半徑為8.5 cm），取上清液，旋蒸揮發(fā)至干[20-21]。取山豆根浸膏50 mg，置于50 mL 的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲30 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，待進(jìn)樣。色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%甲酸水（B）；梯度 洗脫（0～1 min，10% A；1～21 min，10% A～100% A；21～22 min，100% A）。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。質(zhì)譜條件：系統(tǒng)采用電噴霧離子源正、負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)，掃描范圍m/z 100～1 500，錐孔電壓40 V，毛細(xì)管電壓3 000 V，離子源溫度 120 ℃，脫溶劑氣體流速800 L/h，錐孔反吹氣50 L/h[22]。

運(yùn)用UPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)采集數(shù)據(jù)后，采用UNIFI1.8 軟件自動(dòng)識(shí)別化學(xué)成分。首先查閱文獻(xiàn)[23]，補(bǔ)充原有的山豆根化合物數(shù)據(jù)庫；建立山豆根正負(fù)離子模式下的分析方法；再將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI1.8 軟件中，進(jìn)行分析，UNIFI1.8 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)篩查、鑒定；之后將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾篩選，設(shè)定質(zhì)量誤差為±10×10-6；最后結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)各化合物的保留時(shí)間，以及碎片離子理論質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間和分子式，對(duì)各化合物進(jìn)行人工識(shí)別和鑒定。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法[24-25]

1.2.1 山豆根化學(xué)成分作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選 鑒定所得到的化學(xué)成分在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載相應(yīng)的2D 結(jié)構(gòu)圖，未查到的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)通過查閱文獻(xiàn)用ChemDraw作圖保存為SDF 結(jié)構(gòu)，將結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PharmMapper 數(shù)據(jù)庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，并借助UniProt（https：//www.uniprot.org/）將靶點(diǎn)蛋白名稱轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的基因名（Gene Symbol），篩選并刪除重復(fù)靶點(diǎn)。

1.2.2 肝癌疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）及DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https：//go.drugbank.com/）以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞檢索，合并2 個(gè)數(shù)據(jù)庫的結(jié)果，并借助UniProt（https：//www.uniprot.org/）將靶點(diǎn)蛋白名稱轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的官方基因名（Gene Symbol），篩選并刪除重復(fù)靶點(diǎn)，得到肝癌治療靶點(diǎn)。

1.2.3 韋恩圖、蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)及活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用韋恩作圖平臺(tái)繪制出肝癌疾病和山豆根化學(xué)成分靶點(diǎn)的韋恩圖，并通過String（https：//www.stringdb.org/）數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI 分析網(wǎng)絡(luò)。用Cytoscape3.7.2 篩選出度值排名前5 位的靶點(diǎn)為山豆根抗肝癌的核心 靶點(diǎn)。繼續(xù)用Cytoscape3.7.2 構(gòu)建化學(xué)成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，其中度值排名前6 位的化學(xué)成分即為核心活性成分。

1.2.4 生物信息分析 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），進(jìn)行基因本體分析（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集通路分析，并通過微生信平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）對(duì)其為生物過程（BP），細(xì)胞組件（CC），分子功能（MF）各自顯著性前10 位的結(jié)果以及KEGG顯著性前20 位的條目進(jìn)行可視化，以柱狀圖和富集氣泡圖進(jìn)行展示。最后在Cytoscape 3.7.2 軟件中構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證 利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）下載山豆根主要活性成分的mol 2 格式的分子結(jié)構(gòu)。利用RCSB PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值前5 位的靶點(diǎn)蛋白的PDB 格式的3D 晶體結(jié)構(gòu)。通過運(yùn)行Autodock Vina 進(jìn)行分子對(duì)接。采用PyMOL軟件將分子對(duì)接結(jié)果可視化。

1.3 噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞活性

1.3.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器 人肝癌細(xì)胞（HepG2，武漢普賽諾公司）；三葉豆紫檀苷、氧化苦參堿、苦參堿（成都埃法生物科技有限公司）；二甲基亞砜（賽默飛世爾科技有限公司）；胎牛血清、青鏈霉素混合液（Gibco 公司）；DMEM 培基（BI 公司）；磷酸緩沖液（1×，pH=7.2～7.4）（索萊寶生物科技有限公司）；AII 級(jí)生物安全柜（海爾公司）；倒置顯微鏡（Nikon TS2）；酶標(biāo)儀（BioTek 公司）。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2 細(xì)胞置于5% CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，在添加10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，以傳代后狀態(tài)較好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 細(xì)胞活性檢測(cè) 設(shè)置分組為10 組，包括空白組，三葉豆紫檀苷組（0.4、0.9、1.4 mmol/L），氧化苦參堿組（4.5、6、7.5 mmol/L），苦參堿組（4.8、6.4、8 mmol/L）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×104/孔的細(xì)胞懸液100 μL 接種于96 孔培養(yǎng)板中，每組6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，各濃度藥物以每孔100 μL 加入預(yù)先培養(yǎng)的細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，加入100 μL 的5%MTT 溶液于各孔中，于5% CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h。棄上清液，各孔中分別加入150 μL 的DMSO，低速轉(zhuǎn)動(dòng)10 s，使結(jié)晶全部溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm 的吸光度 OD 值，計(jì)算細(xì)胞存活率。公式如下：

細(xì)胞存活率%=OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白組×100%。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分分析部分 采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對(duì)山豆根提取物進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果分別得到正、負(fù)離子模式下的基峰圖（見圖1）。采用UNIFI 1.8 軟件進(jìn)行分析，以及與相關(guān)文獻(xiàn)比對(duì)共鑒定出23 個(gè)化合物。包括吡啶類生物堿9 個(gè)，異黃酮類化合物3 個(gè)，二氫黃酮類化合物4 個(gè)，二氫異黃酮類化合物2 個(gè)，黃酮醇類化合物1 個(gè)，苯并呋喃類化合物2 個(gè)，蒽醌類化合物1 個(gè)，木脂素類化合物1 個(gè)，并得到各化學(xué)成分的保留時(shí)間、m/z 值、碎片離子等。數(shù)據(jù)見開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）。

圖1 山豆根負(fù)離子模式（A）和正離子模式（B）的BPI 圖Fig.1 BPI diagram of Sophora tonkinensis in negative ion(A)and positive ion(B)mode

2.1.1 吡啶類生物堿類化合物

2.1.1.1 苦參堿類 從山豆根中共鑒定出苦參堿類5 個(gè)，包括5α-羥基萊曼堿、苦參堿、5α，14β-二羥基苦參堿、7，11-去氫苦參堿、氧化苦參堿。以化合物3為例，在正離子模式下，UNIFI 1.8 軟件預(yù)測(cè)化合物3 為5α-羥基萊曼堿，在一級(jí)質(zhì)譜中準(zhǔn)分子離子峰為m/z 263.177 0[M+H]+，產(chǎn)生的主要碎片離子信息有138.127 7[C9H16N]+、162.091 3[C10H12NO]+、176.107 0[C11H14NO]+、190.159 0[C13H20N]+、191.117 9[C11H15N2O]+、205.133 5[C12H17N2O]+、206.190 3[C14H24N]+，推測(cè)其為5α-羥基萊曼堿，得到質(zhì)譜圖及其裂解途徑（見圖2A）。預(yù)測(cè)所得化合物5也呈現(xiàn)碎片離子191.1179[C11H15N2O]+、206.190 3[C14H24N]+，且與相關(guān)文獻(xiàn)[26-30]進(jìn)行比較，推測(cè)化合物5 為苦參堿。

圖2 吡啶類生物堿類化合物質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.2 Mass spectrogram and fragmentation pathway of pyridine alkaloid

2.1.1.2 金雀花堿類 從山豆根中共鑒定出金雀花堿類3 個(gè)，包括N-甲基金雀花堿、金雀花堿、N-己?；鹑富▔A。以化合物1 為例，在正離子模式下，UNIFI 1.8 軟件預(yù)測(cè)化合物1 為N-甲基金雀花堿，在一級(jí)質(zhì)譜中準(zhǔn)分子離子峰為m/z 205.135 3[M+H]+，產(chǎn)生的主要碎片離子信息有162.091 3[C10H12NO]+、191.117 9[C11H15N2O]+，與相關(guān)文獻(xiàn)[26-29]進(jìn)行比較，推測(cè)其為N-甲基金雀花堿，得到質(zhì)譜圖及其裂解途徑（見圖2B）。預(yù)測(cè)所得化合物2、11 均呈現(xiàn)碎片離子162.091 3[C10H12NO]+、191.117 9[C11H15N2O]+，推測(cè)化合物2、11 分別為金雀花堿、N-己?；鹑富▔A。

2.1.1.3 臭豆堿類 從山豆根中共鑒定出臭豆堿類1 個(gè)，為臭豆堿。在正離子模式下，UNIFI 1.8 軟件預(yù)測(cè)化合物4 為臭豆堿，在一級(jí)質(zhì)譜中準(zhǔn)分子離子峰為m/z 245.166 4[M+H]+，產(chǎn)生的主要碎片離子信息有189.102 2[C11H19N2]+，且與相關(guān)文獻(xiàn)[26-28]進(jìn)行比較，推測(cè)其為臭豆堿，得到質(zhì)譜圖及其裂解途徑（見圖2C）。

2.1.2 黃酮類化合物

2.1.2.1 異黃酮類 從山豆根中共鑒定出異黃酮類化合物3 個(gè)，分別為Sophoraflavone A、7，3'-二羥基-5'-甲氧基異黃酮、Wighteone。在正離子模式下，以化合物13 為例，UNIFI 1.8 軟件預(yù)測(cè)化合物13 為7，3'-二羥基-5'-甲氧基異黃酮，在一級(jí)質(zhì)譜中準(zhǔn)分子離子峰為m/z 285.077 1[M+H]+，產(chǎn)生的主要碎片離子信息有134.036 2[C8H6O2]+、137.023 3[C7H5O3]+、147.044 1 [C9H7O2]+、175.039 0 [C10H7O3]+、267.065 2[C16H11O4]+、270.052 3[C15H10O5]+，推測(cè)其為7，3'-二羥基-5'-甲氧基異黃酮，得到質(zhì)譜圖及其裂解途徑（見圖3A）。在負(fù)離子模式下，以化合物20 為例，預(yù)測(cè)化合物20 為Wighteone，在一級(jí)質(zhì)譜中準(zhǔn)分子離子峰為m/z 337.105 2[M-H]-，產(chǎn)生的主要碎片離子信息有269.045 5[C15H9O5]-、323.128 8[C20H19O4]-，推測(cè)其為Wighteone，得到質(zhì)譜圖及其裂解途徑（見圖3B）。

2.1.2.2 二氫黃酮類和二氫異黃酮類 從山豆根中共鑒定出二氫黃酮類化合物4 個(gè)，分別為苦參醇E、考薩莫A、6，8-二異戊烯基柚皮素、山豆根黃酮K，二氫異黃酮類2 個(gè)，為三葉豆紫檀苷、Sophotokin。以化合物18 為例，在負(fù)離子模式下，UNIFI 1.8 軟件預(yù)測(cè)化合物18 為考薩莫A，在一級(jí)質(zhì)譜中準(zhǔn)分子離子峰為m/z 525.248 2[M-H]-，產(chǎn)生的主要碎片離子信息有279.160 1 [C16H23O4]-、363.217 7 [C21H31O5]-、385.129 3[C21H21O7]-、399.217 7[C24H31O5]-、425.197 0[C25H29O6]-、467.171 1[C26H27O8]-，推測(cè)其為考薩莫A，得到質(zhì)譜圖及其裂解途徑（見圖3C）。依據(jù)UNIFI 1.8 軟件預(yù)測(cè)化合物17 為苦參醇E，化合物19 為6，8-二異戊烯基柚皮素。

2.1.2.3 黃酮醇類 從山豆根中共鑒定出黃酮醇類化合物1 個(gè)，為6，8-二異戊烯基山柰酚。化合物23在一級(jí)質(zhì)譜中準(zhǔn)分子離子峰為m/z 421.163 5[M-H]-，產(chǎn)生的主要碎片離子信息有311.128 9 [C19H19O4]-、350.116 0[C21H18O5]-、403.155 1[C25H23O5]-，推測(cè)其為6，8-二異戊烯基山柰酚，得到質(zhì)譜圖及其裂解途徑（見圖3D）。

綜上，黃酮類化合物在裂解電壓和碰撞氣體作用下，通常會(huì)發(fā)生逆-狄爾斯-阿爾德（RDA）反應(yīng)，C環(huán)發(fā)生1，3 鍵斷裂或者1，4 鍵斷裂，產(chǎn)生1，3A、1，3B、1，4A、1，4B 碎片離子；含有異戊烯基結(jié)構(gòu)的黃酮化合物通常會(huì)失去異戊烯基，而黃酮C 環(huán)的收縮會(huì)丟失CO、CO2，A 環(huán)或B 環(huán)有-OCH3的存在會(huì)丟失-CH3[31-33]。

2.1.3 其他類化合物

2.1.3.1 苯并呋喃類 從山豆根中共鑒定出苯并呋喃類2 個(gè)，為2-（2'，4'-dihydroxyphenyl）-5，6-methylenedioxybenxofuran、Shandougenine A。以化合物16 為例，在負(fù)離子模式下，UNIFI 1.8 軟件預(yù)測(cè)化合物16 為Shandougenine A，在一級(jí)質(zhì)譜中準(zhǔn)分子離子峰為m/z 537.082 3[M-H]-，產(chǎn)生的主要碎片離子信息有427.045 9[C24H11O8]-、509.087 8[C29H17O9]-，推測(cè)其為Shandougenine A，得到質(zhì)譜圖及其裂解途徑（見圖4A）。

圖4 其他類化合物質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.4 Mass spectrogram and fragmentation pathway of other compounds

2.1.3.2 蒽醌類 從山豆根中共鑒定出蒽醌類1 個(gè)，為大黃素甲醚。在正離子模式下，UNIFI 1.8 軟件預(yù)測(cè)化合物12 為大黃素甲醚，在一級(jí)質(zhì)譜中準(zhǔn)分子離子峰為m/z 285.077 3[M+H]+，產(chǎn)生的主要碎片離子信息有137.0233[C7H5O3]+、253.0495[C15H9O4]+、270.0522[C15H10O5]+，推測(cè)其為大黃素甲醚，得到質(zhì)譜圖及其裂解途徑（見圖4B）。

2.1.3.3 木脂素類 從山豆根中共鑒定出木脂素類1 個(gè)，為丁香脂素。在正離子模式下，UNIFI 1.8 軟件預(yù)測(cè)化合物14 為丁香脂素，在一級(jí)質(zhì)譜中準(zhǔn)分子離子峰為m/z 419.171 0[M+H]+，產(chǎn)生的主要碎片離子信息有205.085 9[C12H13O3]+、217.085 9[C13H13O3]+，推測(cè)其為丁香脂素。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究部分

2.2.1 山豆根化學(xué)成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn) 利用UPLC-Q-TOF/MS 結(jié)合UNIFI 1.8 軟件鑒定得到的23 種化學(xué)成分的405 個(gè)靶點(diǎn)與肝癌的303 個(gè)靶點(diǎn)取交集，構(gòu)建韋恩圖（見圖5A），結(jié)果得到33 個(gè)共同靶點(diǎn)。

圖5 山豆根抗肝癌潛在靶點(diǎn)（A）、PPI 網(wǎng)絡(luò)（B）和山豆根“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（C）Fig.5 Potential anti-hepatoma targets of Sophora tonkinensis(A)，PPI network(B)and components-targets network of Sophora tonkinensis(C)

2.2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 STRING 數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入33 個(gè)潛在靶點(diǎn)，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系信息，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2對(duì)蛋白網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析（見圖5B），度值前5 位的靶點(diǎn)為CCND1、AKT1、ERBB2、EGFR、ESR1，推測(cè)這些靶點(diǎn)可能是山豆根抗肝癌的核心靶點(diǎn)。

2.2.3 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（見圖5C）。該網(wǎng)絡(luò)包含55 個(gè)節(jié)點(diǎn)和99 條邊，其中紅色部分代表22 個(gè)山豆根化學(xué)成分（鑒定所得成分中金雀花堿潛在靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)沒有共同靶點(diǎn)），藍(lán)色部分代表33 個(gè)共同靶點(diǎn)。其中 6，8-二異戊烯基山柰酚、Wighteone、大黃素甲醚、考薩莫A、三葉豆紫檀苷、Sophotokin 的度值較大，分別為11、11、10、8、8、7，因此，這些化合物可能是山豆根抗肝癌的關(guān)鍵成分。

2.2.4 富集分析 GO 功能富集分析顯示（見圖6），生物過程共獲得117 條注釋結(jié)果，主要涉及細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、蛋白質(zhì)磷酸化、MAPK 級(jí)聯(lián)、蛋白激酶B 信號(hào)的正向調(diào)節(jié)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控等；細(xì)胞成分共獲得15 條注釋結(jié)果，主要包括細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)、核、大分子復(fù)合物等方面；分子功能共獲得23 條注釋結(jié)果，主要涉及ATP 結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等方面。

圖6 GO 富集分析與KEGG 通路分析Fig.6 GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis

KEGG 通路富集分析共得到112 個(gè)條目，刪去不相關(guān)通路，選取前20 條富集通路，并運(yùn)用微生信平臺(tái)進(jìn)行可視化（見圖6）。結(jié)果顯示山豆根抗肝癌主要涉及癌癥的途徑、HIF-1 信號(hào)通路、AGERAGE 信號(hào)通路、PI3K/AKT 信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路等。以上結(jié)果說明山豆根可以通過調(diào)節(jié)協(xié)調(diào)多個(gè)生物過程及多個(gè)通路發(fā)揮抗肝癌的作用。

取顯著性前20 條的KEGG 通路構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)（見圖7），網(wǎng)絡(luò)共有75 個(gè)節(jié)點(diǎn)和362 條邊。其中紅色部分代表22 個(gè)山豆根化學(xué)成分，藍(lán)色部分代表33 個(gè)共同靶點(diǎn)，綠色部分代表20 條信號(hào)通路。說明山豆根抗肝癌的藥理過程涉及多成分、多靶點(diǎn)以及多途徑。

圖7 山豆根“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Components-targets-pathways network of Sophora tonkinensis

2.2.5 分子對(duì)接 選取成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中度值前6 位的活性成分6，8-二異戊烯基山柰酚、Wighteone、大黃素甲醚、考薩莫A、三葉豆紫檀苷、Sophotokin 與PPI 網(wǎng)絡(luò)中 度 值排名前5 位的核心 靶點(diǎn)CCND1（PDBID：2W96）、AKT1（PDBID：7NH5）、ERBB2（PDBID：3PP0）、EGFR（PDBID：7AEM）、ESR1（PDBID：5FQV）進(jìn)行對(duì)接，得到山豆根活性成分與靶點(diǎn)蛋白的最低結(jié)合能（見圖8A），通過pymol 軟件繪制分子對(duì)接（見圖8B）。結(jié)合能＜0 kcal/mol 表明配體化合物分子可以與受體靶點(diǎn)蛋白自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤-5．0 kcal/mol表明配體化合物分子與受體靶點(diǎn)蛋白具有良好的結(jié)合活性。由圖8A 可知，最低結(jié)合能均小于-5．0 kcal/mol，說明靶點(diǎn)蛋白和山豆根活性成分具有較好的親和力。由圖8B 可知，山豆根活性成分與靶點(diǎn)蛋白能通過氫鍵等分子間作用力結(jié)合。

2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性 根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果以及中國藥典中山豆根的指標(biāo)成分，選擇三葉豆紫檀苷、氧化苦參堿和苦參堿進(jìn)行細(xì)胞活性驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三葉豆紫檀苷不同濃度組處理細(xì)胞的存活率較空白組明顯降低，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，P＜0．01），氧化苦參堿、苦參堿不同濃度組處理細(xì)胞的存活率比空白組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，P＜0．01）（見圖9）。結(jié)果表明三葉豆紫檀苷、氧化苦參堿和苦參堿均有不同程度的抗肝癌作用。作用細(xì)胞相同時(shí)間下，三葉豆紫檀苷抑制HepG2 細(xì)胞增殖的作用大于氧化苦參堿、苦參堿，符合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果。

圖9 三葉豆紫檀苷、氧化苦參堿、苦參堿對(duì)HepG2 細(xì)胞活力的影響Fig.9 Effects of Trifolirhizin，Oxymatrine，Matrine on the viability of HepG2 cells

3 討論

據(jù)報(bào)道，在中國每年新發(fā)肝癌病例和肝癌導(dǎo)致的死亡病例約占全球病例的50%[34]。目前主要的肝癌治療方法為手術(shù)切除腫瘤和進(jìn)行肝臟移植，然而卻存在肝源缺乏、手術(shù)困難、復(fù)發(fā)概率高、預(yù)后較差等問題[35]。因此，迫切需要繼續(xù)探索和制定科學(xué)有效的抗肝癌策略。隨著不斷深入中藥在腫瘤方面的研究，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥可以通過抑制腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移、改善腫瘤微環(huán)境、調(diào)控細(xì)胞凋亡與自噬等不同機(jī)制發(fā)揮治療作用[36]。山豆根具有清熱解毒，消腫利咽的功效，而造成肝癌的病理機(jī)制大多是因?yàn)榍橹疽钟?，氣機(jī)阻滯，血行不暢，導(dǎo)致氣滯血瘀而成；或者由于濕熱邪毒或蟲蠱、酒毒為害日久，瘀血毒結(jié)聚于肝臟所致[37]。許多研究表明山豆根具有很好的抗肝癌作用。山豆根生物堿通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）及磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）基因發(fā)揮明確的抗肝腫瘤作用[8]；山豆根提取物可以明顯抑制人肝癌細(xì)胞的增殖，降低線粒體的代謝活性[11]；山豆根提取物不僅能抑制人肝母細(xì)胞瘤HepG2 細(xì)胞、人肝癌Hep3B細(xì)胞的增殖，并且能使大部分HepG2 和Hep3B 細(xì)胞株產(chǎn)生凋亡[12]；山豆根顆粒與飲片被證實(shí)可以提高荷瘤小鼠血清中白細(xì)胞介素-2、干擾素-γ 及腫瘤壞死因子-α 等細(xì)胞因子含量，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)[9]；山豆根非生物堿成分也能顯著保護(hù)免疫性肝損傷[38]。但是，山豆根抗肝癌的藥效學(xué)及作用機(jī)制研究只涉及到山豆根提取物，對(duì)山豆根抗肝癌作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用靶點(diǎn)尚未闡明。

目前，山豆根的化學(xué)成分主要通過NMR、IR、UV、柱色譜、高效液相色譜（HPLC）、X 射線單晶衍射和圓二色譜（CD）進(jìn)行鑒定，分離過程復(fù)雜且耗時(shí)[39]。而中藥的化學(xué)成分多樣，全面了解化學(xué)成分的組成有助于闡明中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。近年來，UPLC-Q-TOF/MS 可以對(duì)復(fù)雜組分進(jìn)行高效、快速的分析，其提供了豐富的二級(jí)質(zhì)譜信息，可以實(shí)現(xiàn)中藥化學(xué)成分的快速分離和鑒定。采用UPLC-QTOF/MS 技術(shù)鑒定山豆根化學(xué)成分可以避免復(fù)雜、繁瑣耗時(shí)的分離純化工作，提高定性分析的效率和準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)對(duì)山豆根成分的鑒定，為山豆根的進(jìn)一步開發(fā)利用、質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。

因此，本研究首先利用UPLC-Q-TOF/MS 結(jié)合UNIFI 軟件對(duì)山豆根成分進(jìn)行了快速鑒定，共鑒定出23 個(gè)化合物。包括吡啶類生物堿9 個(gè)，異黃酮類化合物3 個(gè)，二氫黃酮類化合物4 個(gè)，二氫異黃酮類化合物2 個(gè)，黃酮醇類化合物1 個(gè)，苯并呋喃類2 個(gè)，蒽醌類1 個(gè)，木脂素類1 個(gè)。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)行研究，獲得了包括三葉豆紫檀苷、氧化苦參堿、苦參堿在內(nèi)的23 個(gè)有效成分，并發(fā)現(xiàn)其主要作用于AKT1、ERBB2、CCND1、EGFR、ESR1 等33 個(gè)核心靶點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)HIF-1 信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、PI3K/AKT 信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路等多條通路發(fā)揮抗肝癌作用。細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)中不同濃度的三葉豆紫檀苷、氧化苦參堿、苦參堿均能抑制HepG2 細(xì)胞的增殖，說明三葉豆紫檀苷、氧化苦參堿、苦參堿具有不同程度的抗肝癌作用，且三葉豆紫檀苷的抗肝癌作用更顯著，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果一致，表明了山豆根的潛在活性成分具有抗肝癌作用。

研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿作用于以誘導(dǎo)糖酵解調(diào)節(jié)磷酸酶（TP53）、血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）及CCND1 等多靶點(diǎn)，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)同時(shí)驗(yàn)證了苦參堿通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、線粒體穩(wěn)態(tài)等多條通路，從而起到抑制肝癌的作用[40]；苦參堿和氧化苦參堿通過抑制蛋白激酶B（AKT）磷酸化，阻滯AKT/GSK3β/β-catenin 信號(hào)通路，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡；或阻滯PI3K/AKT 通路，上調(diào)PTEN 表達(dá)，從而使p21、p27、p53細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子表達(dá)上調(diào)，下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖[41]。而Wighteone 能抑制EGFR 信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖[42]；三葉豆紫檀苷能夠激活EGFR-MAPK 信號(hào)通路，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明三葉豆紫檀苷可能在癌癥治療中有治療應(yīng)用[43]。

此外，AKT1 作為一種蘇氨酸蛋白激酶，能夠激活PI3K/AKT 信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[44]。ERBB2 基因也稱HER2 基因，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡[45]。ERBB2 基因可能激活PI3K/AKT 信號(hào)通路，抑制肝癌HepG2 細(xì)胞的生長(zhǎng)。而PI3K/AKT 通路與各種人類惡性腫瘤生物過程有關(guān)，具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝、增殖及凋亡的作用，其中 AKT 還能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[46]。相關(guān)研究表明，CCND1 作為一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，而且能參與G1 期向S 期的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化。因此CCND1 可以調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、肝癌干細(xì)胞干性維持等[47]。抑制表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是原癌基因C-erbB-1的表達(dá)產(chǎn)物，EGFR 的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切關(guān)系[48]。ESR1 是一種類固醇受體，一旦突變，ESR1在原發(fā)性惡性腫瘤轉(zhuǎn)移中被激活，抑制ESR1 基因活化可用于抗癌；而在人類肝癌樣本中 ESR1 mRNA表達(dá)上調(diào)，下調(diào)ESR1 mRNA 表達(dá)對(duì)肝癌具有治療作用[49]。HIF 作為轉(zhuǎn)錄因子，不僅可以通過轉(zhuǎn)錄激活VEGF、下調(diào)ENT 中的E-鈣黏蛋白進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞[50]，而且HIF 是抑制病毒性肝炎的重要治療靶點(diǎn)，也可以被乙肝病毒（HBV）激活，是發(fā)生肝癌的主要原因之一。

綜上所述，本研究在對(duì)山豆根化學(xué)成分鑒定分析的基礎(chǔ)上，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)山豆根23 種化學(xué)成分的33 個(gè)潛在抗肝癌靶點(diǎn)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)山豆根可能通過HIF-1 信號(hào)通路、PI3K/AKT 信號(hào)通路等多條通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡來發(fā)揮抗肝癌作用，通過分子對(duì)接技術(shù)以及細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證，為進(jìn)一步明確山豆根抗肝癌的作用機(jī)制及臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)和研究方向。本研究存在一定的局限性，由于流動(dòng)相洗脫程序中有機(jī)相比例較高，響應(yīng)較好的峰大多為極性較低的成分，如脂肪酸等，因此未能鑒定出這部分峰代表的化合物。此外，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)的活性成分進(jìn)行了初步驗(yàn)證，后續(xù)研究中將進(jìn)一步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)推測(cè)的作用靶點(diǎn)，明確活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的關(guān)系，從而為山豆根抗肝癌的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供更加充分、完善的思路。