生脈膠囊對5-氟尿嘧啶致小鼠化療性腸黏膜炎的保護(hù)作用研究*

李兆棟，陳銀瀟，李佳穎，于智先，徐喆，龔博煬，閻皓，彭雁飛，趙舒武

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津 301617；2.天津市人民醫(yī)院腫瘤診療中心腫瘤1 科，天津 300312；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，天津 301617）

化療性腸黏膜炎（CIM）是癌癥患者在接受化學(xué)藥物治療過程中，腸黏膜受到損傷，腸道屏障功能發(fā)生障礙所引起的主要的劑量限制性不良反應(yīng)，主要臨床表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、腹痛等[1]。5-氟尿嘧啶（5-FU）是最常用的化療藥物之一，用于多種癌癥的治療，但是其導(dǎo)致CIM 的幾率高達(dá)80%，并且這些不良反應(yīng)在治療后會(huì)持續(xù)很長時(shí)間[2-4]。CIM 也是癌癥患者被迫停止化療的一個(gè)重要原因，會(huì)導(dǎo)致患者的治療效果不理想，嚴(yán)重影響患者的生活和生存質(zhì)量[5]。目前臨床上并無預(yù)防或治療CIM 的有效手段，因此，探索和開發(fā)防治CIM 的藥物和策略，對提高癌癥患者的治療效果及改善生存質(zhì)量具有積極的意義。

越來越多的證據(jù)表明，中藥在減輕化療不良反應(yīng)，尤其是胃腸道反應(yīng)方面具有顯著療效[6]。生脈散首見于《醫(yī)學(xué)啟源》，是益氣養(yǎng)陰的著名古方，由人參、麥冬、五味子組成，臨床常用于多系統(tǒng)的氣陰兩虛證的治療?，F(xiàn)代藥理研究表明，生脈散具有保護(hù)胃腸道的作用[7]。臨床研究表明，生脈散加味與生脈注射液（成分同為紅參、麥冬和五味子）都能夠顯著改善化療導(dǎo)致的胃腸道反應(yīng)，緩解骨髓抑制，提高化療效果[8-10]。但生脈制劑對化療所致結(jié)腸黏膜損傷的保護(hù)作用和機(jī)制尚不明確，本研究采用5-FU 致小鼠CIM 模型，探討生脈膠囊對化療導(dǎo)致的結(jié)腸黏膜損傷的保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究相關(guān)機(jī)制及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20 只雄性Balb/c 小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量20～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，飼養(yǎng)環(huán)境：普通飼料，期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，溫度 22～26℃，濕度 40%～70%，光照12 h。本研究經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，批號(hào)：TCM-LAEC2022131。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 生脈膠囊藥物成分為紅參、麥冬、五味子，購買自正大青春寶藥業(yè)有限公司（國藥準(zhǔn)字Z33021036），用蒸餾水重懸至所需濃度后進(jìn)行灌胃。5-FU 購買自上海生工生物工程股份有限公司，批號(hào)H202BA0024。用0.1 mol/L 氫氧化鈉和依地酸二鈉溶至蒸餾水中配制成pH 值為8.5～8.9 的溶劑，將其與5-FU 干粉配置所需濃度進(jìn)行腹腔注射。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 二胺氧化酶（DAO）活性檢測試劑盒（北京盒子生工科技有限公司，批號(hào)為1012201071）；免疫組化試劑盒、ki67 抗體（均購于武漢三鷹有限公司，批號(hào)分別為30202104、27309-1-AP）；檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、增強(qiáng)型二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒、糖原PAS 染色試劑盒（均購于北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為20191128、20220614、20221104）；電子天平（上海天平儀器廠，JA1003）；石蠟切片機(jī)（Leica，RM2235）；電動(dòng)倒置研究型生物顯微鏡（奧林巴斯公司，Ⅸ81）；離心機(jī)（Thermo Scientific，Sorvall Legend Micro 17R）。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模與分組 20 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為3 組，正常組（CTRL）5 只、模型組（FU）7 只、生脈組（FU+SM）8 只。參考Zhang 等[11]造模方法制備小鼠化療性腸黏膜炎模型。除正常組外，其余兩組小鼠分別于第1～3 天和第6～8 天腹腔注射5-FU 溶液（25 mg/kg），每日1 次。以體質(zhì)量下降、腹瀉和組織病理學(xué)損傷程度作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 給藥方法 生脈組：以生脈膠囊懸液灌胃（350 mg/kg，參考說明書及《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》換算成小鼠給藥劑量），每日1 次，連續(xù)10 d；正常組和模型組灌胃等量蒸餾水，每日1 次，連續(xù)10 d。

2.3 觀察指標(biāo)與方法

2.3.1 小鼠體質(zhì)量和腹瀉情況觀察 每日給藥之前對各組小鼠體質(zhì)量進(jìn)行記錄，每兩日對小鼠腹瀉情況進(jìn)行一次評(píng)估，用干凈的濾紙收集每組小鼠1 h內(nèi)排出的糞便，以糞便周圍有明顯污跡定為稀便，每組稀便比例=稀便數(shù)/總糞便數(shù)。具體方法參考Yim 等[12]改進(jìn)的糞便收集方法，對每組小鼠稀便情況進(jìn)行比較分析。

2.3.2 樣本采集 小鼠末次給藥后禁食 12 h，不限飲水，摘取小鼠眼球收集血液，以4 000 r/min 離心10 min，離心半徑為8.3 cm，分離血清，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。頸椎脫臼處死小鼠，剖腹收集從盲腸到肛門處的結(jié)腸，觀察形態(tài)并測量長度，取近盲腸端2 cm 結(jié)腸，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗干凈后放入4%多聚甲醛固定，24 h 更換固定液1 次，固定48 h。

2.3.3 結(jié)腸的組織病理學(xué)觀察 將4%多聚甲醛中固定的結(jié)腸進(jìn)行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，石蠟包埋塊切片厚度為5 μm，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠結(jié)腸的組織病理改變。

2.3.4 血清中二胺氧化酶（DAO）活性的測定 血清中 DAO 的活性用DAO 活性檢測試劑盒進(jìn)行測定，所有操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

2.3.5 免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)腸黏膜中 ki67 的表達(dá) 取結(jié)腸石蠟切片，經(jīng)烤片、脫蠟；3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化氫酶；檸檬酸鈉溶液進(jìn)行抗原修復(fù)；5%山羊血清封閉；加入ki67 抗體（稀釋比1∶1 000）4 ℃孵育過夜；次日復(fù)溫，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min；DAB 顯色；蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照，棕色為陽性表達(dá)。采用Image-Pro Plus 圖像分析軟件分析平均OD 值。

2.3.6 PAS 染色法檢測結(jié)腸黏膜中杯狀細(xì)胞的數(shù)量 取結(jié)腸石蠟切片，脫蠟入蒸餾水，后續(xù)所有操作方法嚴(yán)格按照糖原PAS 染色試劑盒說明書步驟進(jìn)行，紅色或紫紅色為PAS 反應(yīng)陽性物質(zhì)。光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖，所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間采用單因素方差分析進(jìn)行比較，組間多重比較采用LSD 法，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 生脈膠囊改善5-FU 所致腸黏膜炎小鼠結(jié)腸縮短和腹瀉情況 與正常組小鼠比較，模型組小鼠體質(zhì)量從第3 天開始顯著下降，到第10 天一直呈持續(xù)下降的趨勢；稀便比例顯著升高。與模型組小鼠比較，生脈組小鼠體質(zhì)量下降情況有改善的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），稀便比例則顯著降低（見圖1A、表1）。與正常組小鼠比較，模型組小鼠結(jié)腸明顯縮短（P＜0.05），而生脈膠囊能夠顯著改善結(jié)腸縮短，增加小鼠結(jié)腸長度（P＜0.05）（見圖1B、1C）。表明生脈膠囊對于5-FU 所致腸黏膜炎小鼠結(jié)腸縮短、腹瀉嚴(yán)重的情況有明顯的改善作用。

表1 生脈膠囊對5-FU 所致腸黏膜炎小鼠腹瀉比例的影響Tab.1 Effect of Shengmai capsule on the proportion of diarrhea in mice with 5-FU induced intestinal mucositis%

3.2 生脈膠囊減輕 5-FU 所致腸黏膜結(jié)構(gòu)和腸屏障損傷 光鏡下可見正常組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，組織排列整齊，杯狀細(xì)胞豐富，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)模糊，隱窩腺體缺損或消失，杯狀細(xì)胞減少，炎性細(xì)胞浸潤顯著；而生脈組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)較模型組顯著改善，隱窩腺體結(jié)構(gòu)明顯修復(fù)，可見增多的杯狀細(xì)胞，仍見明顯的炎細(xì)胞浸潤（見圖2A）。與正常組小鼠比較，模型組小鼠血清中 DAO 活性顯著升高（P＜0．01），而與模型組相比，生脈膠囊能夠顯著降低小鼠血清中的DAO活性（P＜0．01）（見圖2B）。表明生脈膠囊對5-FU 所致腸黏膜炎小鼠的結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)和腸屏障損傷具有明顯的改善作用。

圖2 生脈膠囊對5-FU 所致腸黏膜炎小鼠結(jié)腸病理形態(tài)及腸屏障損傷的影響Fig.2 Effect of Shengmai capsule on the pathological morphology and intestinal barrier damage of the colon in mice with 5-FU induced intestinal mucositis

3.3 生脈膠囊促進(jìn)5-FU 所致結(jié)腸黏膜損傷后的腸上皮細(xì)胞增殖及分化 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，模型組小鼠結(jié)腸中的ki67 陽性細(xì)胞數(shù)較正常組小鼠顯著升高 （P＜0．000 1），而與模型組小鼠比較，生脈組小鼠結(jié)腸中 ki67 陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增高（P＜0．000 1）（見圖3A、3B）。PAS 染色結(jié)果顯示，與正常組小鼠比較，模型組小鼠結(jié)腸黏膜上皮中的杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而與模型組小鼠比較，生脈組小鼠結(jié)腸黏膜上皮中杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯增多（見圖3C）。表明生脈膠囊能夠促進(jìn)5-FU 所致小鼠結(jié)腸黏膜損傷后的腸上皮細(xì)胞的增殖及分化。

圖3 生脈膠囊對5-FU 所致腸黏膜炎小鼠結(jié)腸黏膜中的細(xì)胞增殖及分化的影響Fig.3 Effect of Shengmai capsule on cell proliferation and differentiation in the colon mucosa of mice with 5-FU induced intestinal mucositis

4 討論

化療是臨床治療腫瘤的常用手段，但藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對正常組織和細(xì)胞造成損傷[11]。腸黏膜炎是化療患者最常見的不良反應(yīng)，其主要臨床癥狀表現(xiàn)為厭食、惡心、嘔吐、腹瀉和腹痛，還可能表現(xiàn)出感染性休克和多器官功能障礙等更嚴(yán)重的癥狀[1]。中醫(yī)認(rèn)為，化療藥物在影響腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)使人體的正氣損耗，氣血不足，陰陽失調(diào)，引起五臟六腑的損傷，其主要病位在脾腎，早期的主要表現(xiàn)為胃腸道的損害，又因化療藥物屬于陽邪，具有“熱”的特性，傷津耗氣，因此中醫(yī)治療化療導(dǎo)致的腸黏膜炎多以益氣生津?yàn)橹鱗13-15]。本研究所采用的生脈膠囊是在傳統(tǒng)名方“生脈散”基礎(chǔ)上應(yīng)用現(xiàn)代制劑技術(shù)制成的中成藥口服膠囊，藥物成分為紅參、麥冬、五味子，紅參作為主藥，發(fā)揮補(bǔ)氣、生津之效；麥冬作為輔藥，養(yǎng)陰生津，配伍紅參，共同發(fā)揮氣陰雙補(bǔ)之功效；五味子作為佐使藥，具有斂肺止汗、益氣生津的功效。三藥合用能起到養(yǎng)陰生津，益氣復(fù)脈之功效[7]。

作為最常用的化療藥物之一，5-FU 也被用來誘導(dǎo)CIM 小鼠模型，其特征為腹瀉、體質(zhì)量減輕、腸黏膜完整性和腸隱窩被破壞等，并且其嚴(yán)重程度與5-FU 的劑量呈現(xiàn)正相關(guān)性[11，16]。在本研究中，與正常組比較，5-FU 誘導(dǎo)的CIM 模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低，腹瀉比例也顯著升高，結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)明顯被破壞，表明成功構(gòu)建CIM 模型。有研究[8-10]顯示，以生脈散為基礎(chǔ)的生脈類方能夠減少化療帶來的胃腸道反應(yīng)，改善患者生活質(zhì)量。一項(xiàng)臨床數(shù)據(jù)分析[17]表明，中醫(yī)在治療與化療性腸黏膜炎有著相同發(fā)病機(jī)制且同為化療患者常見的不良反應(yīng)化療性口腔黏膜炎時(shí)，使用最多的藥物就是麥冬等養(yǎng)陰生津之品。而五味子多糖也被證實(shí)能夠改善化療引起的腸道黏膜炎癥狀[18]。本研究結(jié)果還顯示，生脈膠囊能夠改善CIM 小鼠的腹瀉情況，增加結(jié)腸長度，減輕結(jié)腸的組織病理損傷，結(jié)合相關(guān)研究及數(shù)據(jù)分析，可以表明生脈膠囊對化療性腸黏膜炎具有保護(hù)作用。

腸道黏膜是抵御外界環(huán)境最重要的屏障之一，CIM 這類腸道炎癥可破壞腸屏障結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸屏障功能受損[19-21]。DAO 是存在于腸黏膜上皮細(xì)胞中的一種反映腸道機(jī)械屏障的完整性和受損傷程度的細(xì)胞內(nèi)酶，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的離子平衡、影響傳導(dǎo)通路、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)，對腸黏膜具有保護(hù)作用[22]。正常機(jī)體血清中 DAO 活性很低，當(dāng)腸黏膜受到損傷時(shí)，會(huì)導(dǎo)致血清中 DAO 活性增高，因此血清 DAO活性是反映腸黏膜損傷程度的理想指標(biāo)[22-24]。在5-FU 誘導(dǎo)的模型組小鼠中可以觀察到，結(jié)腸黏膜被破壞，血清中 DAO 活性顯著增加，而經(jīng)過生脈膠囊治療的小鼠其結(jié)腸黏膜損傷得到改善，血清中的DAO活性顯著降低，這表明生脈膠囊能夠在一定程度上減輕 5-FU 導(dǎo)致的腸道屏障損傷。

5-FU 等化療藥物引起的腸黏膜炎，損害胃腸道黏膜的過程可以概括為5 個(gè)階段，開始、初級(jí)損傷反應(yīng)、信號(hào)放大、潰瘍和愈合[25]。而最后1 個(gè)階段是通過上皮細(xì)胞的增殖和分化來實(shí)現(xiàn)腸屏障的重建和愈合[16，26]，促進(jìn)腸屏障的愈合也是治療CIM 這類腸道炎癥的關(guān)鍵[20]。由上皮細(xì)胞分化的杯狀細(xì)胞已經(jīng)被證明對維持結(jié)腸黏液屏障功能至關(guān)重要，它的缺失也是結(jié)腸炎的標(biāo)志[27]。表達(dá)在細(xì)胞核中的蛋白ki67 是使用最廣泛的增殖標(biāo)志物之一，本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠結(jié)腸ki67 表達(dá)高于正常組，表明5-FU 導(dǎo)致的結(jié)腸黏膜損傷激活了腸道修復(fù)，而與模型組相比，生脈膠囊組進(jìn)一步提高了ki67 的表達(dá)，另外，與模型組比較，生脈膠囊可明顯提高結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞的數(shù)量，表明生脈膠囊可能進(jìn)一步增強(qiáng)了5-FU 導(dǎo)致的結(jié)腸黏膜損傷后的修復(fù)能力。

綜上所述，生脈膠囊通過減輕結(jié)腸組織的損傷，促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖與分化來緩解小鼠腸道屏障損傷，加快損傷后腸黏膜的修復(fù)。證明生脈膠囊對5-FU 導(dǎo)致的結(jié)腸黏膜損傷具有較好的保護(hù)作用，但其機(jī)制尚不明確，還有待進(jìn)一步研究。