豬病毒性腹瀉滅活疫苗對仔豬保護力研究

何玲，鐘采靈，王鳳國，梁桂益，麥凱杰，孫華，陳瑞愛，3，黃紅亮,3*

（1.廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司 廣東云浮 527400；2.廣東精捷檢驗檢測有限公司 廣東云浮 527400；3.廣東省獸用生物制品技術(shù)研究與應(yīng)用企業(yè)重點實驗室 廣東肇慶 526238）

自2011 年底，由豬流行性腹瀉病毒（porcine diarrhea virus，PEDV）GⅡ群引起的豬流行性腹瀉（PED）在我國河南暴發(fā)以來，PEDV GⅡ快速蔓延至全國各大小豬場，目前已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的三大傳染病（ASF、PRRS、PED）之一。該病主要危害新生仔豬，臨床表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水、消瘦、死亡，以7 日齡內(nèi)仔豬發(fā)病最為嚴重，發(fā)病率與死亡率可高達100%[1]。生長育肥豬感染后偶有發(fā)病，死亡率低[2]，但可能長期排毒，是豬場發(fā)病的病毒來源之一。對于PED 的防控，疫苗免疫是比較經(jīng)濟實惠的手段。

豬流行性腹瀉病毒屬冠狀病毒科（coronaviridae）冠狀病毒屬（coronavirus）[3]，核酸為線性單股正鏈RNA，基因組約為28 kb，病毒粒子大小約為90～195 nm。PEDV 基因組編碼的結(jié)構(gòu)蛋白包括纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）[4]。纖突蛋白（S）為主要的免疫原性蛋白，能誘導高水平的保護性抗體。

為了給客戶提供更加安全高效的產(chǎn)品，本研究小組堅持持續(xù)對豬病毒性腹瀉滅活疫苗產(chǎn)品進行改進升級。目前通過提升抗原含量、保存抗原完整免疫原性及優(yōu)化佐劑等，并評價其對仔豬的保護效力，結(jié)果表明其免疫效力顯著提升，表明大華農(nóng)公司將為客戶提供更加優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）疫苗：競品1 與競品2 是從市場購買的同類產(chǎn)品；止瀉威1、止瀉威2 由廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司提供。

2）細胞及主要試劑：Vero 細胞為本實驗室保存，DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清公司為Gibco 產(chǎn)品。

3）試劑盒：IgA 試劑盒為IDEXX 產(chǎn)品。

4）實驗動物：懷孕70 日齡一胎母豬（二元雜），從新興某種豬場購得。

5）攻毒毒株：MJ 毒株，P5 代，由廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1）試驗分組：試驗分組與免疫方案如表1。

2）攻毒方案：對止瀉威1、競品1、競品2 免疫組及對照組所產(chǎn)5～7 日齡哺乳仔豬進行攻毒，攻毒劑量為105.0TCID50/頭，攻毒方式為口服。

3）中和試驗：①生長良好的Vero 細胞用胰蛋白酶消化，用DMEM 生長液分散后，稀釋至5～8×105個/mL，最后將細胞加入96孔板中，0.1 mL/孔，96 孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)；②待96 孔板中Vero 細胞生長至致密，用DMEM 培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，200 μL/孔/次，最后加入含適量胰蛋白酶DMEM 培養(yǎng)液，100 μL/孔；③用DMEM2 倍系列稀釋血清或乳汁至210，分別取100 μL 與100 μL 病毒液（1 000 TCID50/mL）混合，置于37 ℃、5% CO2孵育1 h，每個稀釋度重復4 次；④去除步驟②中96 孔板中培養(yǎng)液，每孔加入200 μL 血清或乳汁稀釋液與病毒混合液，置于37 ℃、5% CO2孵育1 h 后，棄除，用DMEM 培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，200 μL/孔/次，最后加入含適量胰蛋白酶DMEM 培養(yǎng)液，200 μL/孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)5～7 d；⑤同時設(shè)病毒對照和陰性血清對照；⑥每日觀察細胞病變效應(yīng)（CPE）；⑦50%血清中和終點的計算：50% 細胞不產(chǎn)生細胞病變（CPE）的血清稀釋度。根據(jù)細胞病變程度，用Reed-Muench 法計算50%血清中和滴度。

4）抗體檢測：IgG 抗體與IgA 抗體檢測按照試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 抗體檢測結(jié)果

1）血清中和抗體：該批母豬為一胎母豬，免疫前抗體小部分母豬為陽性（見圖1 中免疫前中和抗體結(jié)果）。將母豬隨機分組進行2次免疫后，在二免后2 周，從誘導血清中和抗體水平（見圖2）來看，止瀉威誘導中和抗體高于400，最高達512，且離散度低（小于10%），顯著優(yōu)于同時對比的兩個競品。

圖1 母豬血清中和抗體水平

圖2 初乳中SIgA 抗體水平

2）初乳中SIgA 抗體：采集產(chǎn)仔當天的乳汁（初乳），用IDEXX試劑盒檢測其中的SIgA 抗體，從檢測結(jié)果（見圖2）可以看出，止瀉威誘導了高水平SIgA 抗體，顯著高于兩個競品。

3）初乳中和抗體：通過檢測初乳中和抗體（見圖3）發(fā)現(xiàn)，止瀉威免疫后誘導的中和抗體平均值達400 以上，最高可達512，顯著高于兩個競品。

圖3 初乳中和抗體水平

2.2 哺乳仔豬被動保護

在仔豬哺乳5～7 d，采用野毒MJ 株對其進行攻擊，每頭仔豬口服105TCID50。在攻毒后24～48 h，對照組、競品1 組、競品2 組仔豬均出現(xiàn)不同程度嘔吐、腹瀉，止瀉威組在攻毒后3～5 d 僅個別仔豬出現(xiàn)輕微腹瀉，各組仔豬腹瀉率、存活率及存活弱仔率見表2。綜合腹瀉發(fā)病率、存活率及存活弱仔率，止瀉威的保護效果顯著高于兩個競品。

表2 哺乳仔豬攻毒后發(fā)病統(tǒng)計表

3 討論與結(jié)論

目前市售的疫苗主要有豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗及豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗兩類疫苗，近幾年為PED 的防控做出了巨大的貢獻。但是活疫苗免疫后能不同程度地排毒，排毒時間不一，增加豬場環(huán)境中的病毒載量，且活疫苗免疫后，豬只帶毒時間長，雖然在配懷舍，不排毒，但進入產(chǎn)房后可能迅速排毒，導致初生仔豬感染發(fā)病[5]。采用傳統(tǒng)工藝制備的病毒性腹瀉滅活疫苗，抗原含量有限（108.0～9.0TCID50/mL），且常用的滅活劑能一定程度地破壞抗原表位，導致免疫原性降低（數(shù)據(jù)未發(fā)表），因此，病毒性腹瀉滅活疫苗的免疫效力仍有提升的空間。

本研究小組通過工藝改進有效提高了PEDV 有效抗原含量，達200 μg/mL，且篩選到能完整保留病毒結(jié)構(gòu)的滅活劑，以此制備的疫苗經(jīng)本研究評估驗證，無論從二免疫后2 周血清中和抗體、初乳中SIgA 抗體及初乳中和抗體三項指標評價，還是從哺乳5～7 d初生仔豬的攻毒保護（仔豬腹瀉率、存活率及存活弱仔率）評價，豬病毒性腹瀉滅活疫苗免疫效力顯著優(yōu)于競品疫苗，初生哺乳仔豬能獲得更優(yōu)于競品疫苗的被動保護?！?/p>