基于STAT3-CASP4/5 通路誘導(dǎo)銀屑病細(xì)胞焦亡基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及潛在藥物預(yù)測(cè)

王家悅，陳朝霞，王 燕，趙京霞，底婷婷，胡雪晴，曲保全，李 萍

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，銀屑病中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市中醫(yī)藥研究所，北京 100010

銀屑病是一種常見的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚[1]。目前普遍認(rèn)為，銀屑病的發(fā)病是由表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocyte，KC）與免疫細(xì)胞互作異常引起的自身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致皮膚受累。近年來，研究發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶-11（cysteine aspartatespecific proteinase-11，Caspase-11，CASP-11）促進(jìn)了與細(xì)胞焦亡相關(guān)的銀屑病的發(fā)展。對(duì)缺乏CASP-11 的小鼠進(jìn)行組織學(xué)和基因表達(dá)研究表明，CASP-11 的表達(dá)可以通過促進(jìn)KC 增殖、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和新血管生成來增強(qiáng)咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病癥狀，以支持該過程中異常增殖的KC 的代謝需求[2]。又有研究證實(shí)，CASP-11 可激活銀屑病小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞中的炎癥小體，焦孔素 D（gasdermin-D，GSDMD）作為炎性CASP 的共同底物蛋白被切割釋放其N 端結(jié)構(gòu)域，破壞細(xì)胞膜的功能，導(dǎo)致膜上孔隙形成，致使促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 的成熟和分泌并啟動(dòng)細(xì)胞焦亡[3]。雖然這些證據(jù)表明，細(xì)胞焦亡過程是銀屑病發(fā)病的途徑之一，它們之間的聯(lián)系是通過抑制CASP 驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞焦亡干預(yù)誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的病理癥狀來建立的，但是調(diào)控CASP基因表達(dá)進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞焦亡過程轉(zhuǎn)錄機(jī)制尚不清晰。因此，本研究采用基于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的方法來識(shí)別與銀屑病病理過程中細(xì)胞焦亡相關(guān)的基因進(jìn)而揭示在銀屑病的病理學(xué)中CASP 誘發(fā)細(xì)胞焦亡上游調(diào)控機(jī)制。

在銀屑病的西醫(yī)治療方法中，環(huán)孢素 A（cyclosporine A，CysA）作為一種高選擇性免疫抑制劑用于控制嚴(yán)重的斑塊型、膿皰型銀屑病，效果明顯[4]。最近的研究表明，CysA 可以通過抑制線粒體滲透性過渡孔的開放來減少細(xì)胞焦亡的發(fā)生，提示CysA 可能通過調(diào)控異常的細(xì)胞焦亡過程來治療銀屑病[5]。此外，中藥治療銀屑病的療效確切，經(jīng)臨床實(shí)踐及動(dòng)物研究證明，中藥在抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、抑制KC 異常的增殖分化過程等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[6-8]，并有研究表明中藥還可干預(yù)細(xì)胞焦亡的進(jìn)程[9-10]。本研究通過分析銀屑病病患的基因表達(dá)數(shù)據(jù)構(gòu)建CASP基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過整合臨床知識(shí)和生物醫(yī)療數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)在銀屑病發(fā)病過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡基因表達(dá)的中西藥物（研究流程見圖1），為銀屑病的治療提供新的研究方向。

圖1 STAT3-CASP4/5 通路誘導(dǎo)銀屑病細(xì)胞焦亡基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及潛在藥物預(yù)測(cè)的研究流程Fig. 1 Research process of constructing regulatory network for psoriatic cell pyroptosis gene induced by STAT3-CASP4/5 pathway and potential drug prediction

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

利用NCBI 的基因表達(dá)Omnibus 數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）獲得銀屑病患者皮損區(qū)和非皮損區(qū)樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)（GSE109248）。使用GEOquery 包（2.66.0 版本）從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載 17 例銀屑病樣本（GSM2935867～GSM2935883）和14 例健康皮膚對(duì)照組樣本（GSM2935853～GSM2935866），樣本分布信息見圖2-a，樣本標(biāo)準(zhǔn)化情況見圖2-b。此外，通過檢索細(xì)胞焦亡相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[11-14]，收集前期研究已鑒定出的52 個(gè)細(xì)胞焦亡相關(guān)基因。

圖2 銀屑病皮損區(qū)和正常區(qū)皮膚組織樣本分布Fig. 2 Distribution of skin tissue samples from psoriasis lesions and normal areas

1.2 方法

1.2.1 銀屑病差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）的分析和篩選 使用R 語言（4.2.2 版本）在Ubantu 平臺(tái)（22.04 版本）上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用Limma 包（3.54.2 版本）分析GSE109248 數(shù)據(jù)集中銀屑病患者皮損區(qū)和非皮損區(qū)組織樣本之間的差異表達(dá)基因（銀屑病DEGs），篩選條件為P≤0.01。使用 DrawVennDiagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be）工具繪制韋恩圖鑒定比較銀屑病DEGs 和52 個(gè)細(xì)胞凋亡DEGs 相關(guān)基因的交集。

1.2.2 細(xì)胞焦亡銀屑病DEGs 基因本體（gene ontology，GO）富集分析 使用WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit（WebGestalt 2019）[15]對(duì)銀屑病和細(xì)胞焦亡相關(guān)基因進(jìn)行富集分析，篩選條件為P≤0.01，鑒定相關(guān)生物過程及對(duì)應(yīng)拓?fù)潢P(guān)系。

1.2.3 構(gòu)建轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò) 基于Python（3.8.16 版本）在Ubantu 平臺(tái)（22.04 版本）上預(yù)測(cè)銀屑病DEGs的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。使用基于隨機(jī)樹基因相關(guān)性算法GENIE3[16]預(yù)測(cè)銀屑病DEGs的上游轉(zhuǎn)錄因子，并提取相關(guān)性最高的0.5%調(diào)節(jié)關(guān)系。從預(yù)測(cè)的調(diào)節(jié)關(guān)系中，分別提取直接調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡和間接調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡的調(diào)節(jié)因子并使用Cytoscape 軟件（3.8.0 版本）繪制預(yù)測(cè)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4 化學(xué)藥篩選 使用Coremine 綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（https://coremine.com/medical/）和DGIdb 綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.DGIdb.org）[17]預(yù)測(cè)作用在核心基因（Hub）轉(zhuǎn)錄因子的批準(zhǔn)的藥物分子，數(shù)據(jù)庫(kù)包含NCBIEntrez、DrugBank、PharmGKB 等臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)及PubMed 發(fā)表的工作內(nèi)容。

1.2.5 中藥篩選 將細(xì)胞焦亡過程和銀屑病發(fā)病過程的交集基因及調(diào)節(jié)這些基因的轉(zhuǎn)錄因子提交至CTD綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（https://ctdbase.org/），查找能夠調(diào)控這些基因的化學(xué)成分，選取CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中文獻(xiàn)支持?jǐn)?shù)較高的化學(xué)成分，在COREMINE 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://coremine.com/medical/）中尋找包含對(duì)應(yīng)化學(xué)成分的中藥。參考《中國(guó)藥典》《中藥大辭典》《中華本草》《中藥學(xué)》等對(duì)這些中藥進(jìn)行性味歸經(jīng)和藥物分類的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病患者皮損區(qū)和非皮損區(qū)樣本的基因表達(dá)分析

根據(jù)篩選結(jié)果顯示，共有6408 個(gè)探針樣本表現(xiàn)出差異表達(dá)，且差異顯著（P值為0.01）。銀屑病DEGs 總計(jì)為5172 個(gè)。結(jié)果見圖3。

圖3 銀屑病DEGs 均值-差異圖Fig. 3 Mean-difference plot of psoriasi s DEGs

對(duì)銀屑病DEGs 進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)其涉及多個(gè)生物過程，具體見圖4。研究結(jié)果表明，在皮膚病變區(qū)域中，銀屑病DEGs 與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移等生物過程密切相關(guān)，這些過程異常狀態(tài)下涉及T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化和功能異常。這些異常的免疫細(xì)胞活動(dòng)往往伴隨著銀屑病的發(fā)生，并導(dǎo)致病變區(qū)域出現(xiàn)角化不良、表皮屏障功能紊亂、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和鱗屑形成等病理特征。因此，研究結(jié)果顯示銀屑病DEGs 的差異表達(dá)與銀屑病病程的發(fā)展密切相關(guān)。

圖4 銀屑病DEGs 的有向無環(huán)圖Fig. 4 GO directed acyclic graph of psoriasis DEGs

2.2 銀屑病相關(guān)細(xì)胞焦亡基因的篩選及其富集分析

為進(jìn)一步探究細(xì)胞焦亡基因在銀屑病發(fā)病過程中的作用，比較2 個(gè)生物過程涉及的表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)了13 個(gè)共同的DEGs（圖5-a）。這些基因包括與細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶 5（cysteinasparate protease 5，CASP5）、CASP4、CASP3、CASP9和CASP8基因；與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)分泌途徑和蛋白質(zhì)分解途徑相關(guān)的帶電多囊體蛋白6（charged multivesicular body protein 6，CHMP6）、CHMP2A和CHMP7基因；與炎癥途徑相關(guān)的IL-1β基因；參與核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（nucleotide binding oligomerization domain containing，NOD）樣受體途徑的NOD1和PYD 和CARD 結(jié)構(gòu)域包含蛋白（PYD and CARD domain containing，PYCARD）基因；與B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族凋亡相關(guān)的Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）基因；以及編碼蛋白激酶A 家族的cAMP 依賴性蛋白激酶α催化亞基（protein kinase cAMP-activated catalytic subunit alpha ，PRKACA）基因，基因名稱如表1 所示。

圖5 銀屑病相關(guān)細(xì)胞焦亡基因的篩選及其富集分析Fig. 5 Screening and enrichment analysis of psoriasis related pyroptosis genes

表1 銀屑病與細(xì)胞焦亡共同差異表達(dá)基因Table 1 Differential expression genes of psoriasis and pyroptosis

進(jìn)一步對(duì)篩選出來的13 個(gè)共同的DEGs 進(jìn)行富集分析，GO 分析結(jié)果見圖5-b，GO 有向無環(huán)圖結(jié)構(gòu)見圖5-c。結(jié)果顯示，包括CASP4、CASP5、CASP8在內(nèi)的細(xì)胞焦亡基因在銀屑病中參與程序性細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)、蛋白酶活性的調(diào)節(jié)、內(nèi)肽酶活性的調(diào)節(jié)、IL-1β 的產(chǎn)生等過程。進(jìn)一步預(yù)測(cè)這些共同DEGs 的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制，以識(shí)別調(diào)控細(xì)胞焦亡生物過程和銀屑病病理過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而描繪2 個(gè)生物過程交互的可能基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.3 銀屑病與細(xì)胞焦亡共同DEGs 的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過基因相關(guān)性分析，篩選出54 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控7 個(gè)細(xì)胞焦亡和銀屑病共同DEGs（CHMP7、CASP8、CASP5、CHMP2A、CASP4、IL1B、BAX），共對(duì)應(yīng)64 個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系（圖6）。預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型并不完全聯(lián)通，而是劃分為CASP8調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖6-a）、CASP5/CASP4調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖6-b）、Bax調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖6-c）、IL1B調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖6-d）、CHMP2A調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖6-e）、CHMP7調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖6-f）6 個(gè)獨(dú)立的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這可能意味著這些基因的表達(dá)機(jī)制在銀屑病的發(fā)病過程中呈現(xiàn)出相互獨(dú)立的模式。

圖6 銀屑病-細(xì)胞焦亡基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型Fig. 6 Regulatory network model of psoriasis-pyroptosis gene

研究發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞焦亡過程和銀屑病發(fā)病過程共同DEGs（圖6 中以橘黃色標(biāo)記）直接調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子（以紅色標(biāo)記）比間接調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子（以藍(lán)色標(biāo)記）具有更多的輸入調(diào)節(jié)和輸出調(diào)節(jié)關(guān)系，表明直接調(diào)節(jié)因子在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中可能具有重要的功能。更具體地，對(duì)于在細(xì)胞焦亡過程中發(fā)揮重要作用的CASP基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子維生素D 受體（vitamin D receptor，VDR）、鈣調(diào)蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子2（calmodulin binding transcription activator 2，CAMTA2）和鋅指E 盒結(jié)合同源盒蛋白2（zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2）可能直接調(diào)節(jié)CASP8的轉(zhuǎn)錄過程；轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、堿性亮氨酸拉鏈ATF 樣轉(zhuǎn)錄因子2（basic leucine zipper ATF-like transcription factor 2，BATF2）和催乳素調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（prolactin regulatory element binding，PREB）直接調(diào)節(jié)CASP4、CASP5的轉(zhuǎn)錄過程。根據(jù)以往研究，銀屑病的發(fā)病機(jī)制之一涉及通過抑制CASP 驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞焦亡來干預(yù)誘導(dǎo)銀屑病小鼠的病理癥狀[2-3]。尋找的上游轉(zhuǎn)錄因子可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡過程逆轉(zhuǎn)銀屑病癥狀的關(guān)鍵基因節(jié)點(diǎn)。此前本團(tuán)隊(duì)研究表明，在咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型的皮損中，pSTAT3 表達(dá)明顯上調(diào)。K5.STAT3C 轉(zhuǎn)基因小鼠也表現(xiàn)出典型的銀屑病樣皮損改變。通過STAT3 抑制劑或沉默干擾RNA阻斷STAT3 的激活，可以抑制模型的皮損發(fā)生。這些研究證明了STAT3 在銀屑病中的調(diào)節(jié)功能，并驗(yàn)證了本研究預(yù)測(cè)的包括STAT3 在內(nèi)的CASP基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可能被用于尋找逆轉(zhuǎn)銀屑病病癥的藥物分子。隨后將系統(tǒng)篩選作用于這些重要轉(zhuǎn)錄因子的藥物分子，旨在尋找可能逆轉(zhuǎn)異常細(xì)胞焦亡過程的治療銀屑病的方案。

2.4 藥物-基因相互作用

為進(jìn)一步探索尋找逆轉(zhuǎn)銀屑病病癥的藥物分子，在COREMINE 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索了作用于CASP基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（包括STAT3）的治療藥物。結(jié)果顯示，與STAT3 相互作用的藥物有151 個(gè)，與VDR 相互作用的有52 個(gè)，與ZEB2 相互作用的有31 個(gè)，與BATF2 相互作用的有11 個(gè)，與PREB 相互作用的有6 個(gè)，與CAMTA2 相互作用的有4 個(gè)（P＝0.01）。其中，CysA、MTX 和異維A 酸與VDR和STAT3 均有作用，表明這3 種藥物可能通過作用于包括VDR 和STAT3 在內(nèi)的多個(gè)基因靶點(diǎn)來逆轉(zhuǎn)銀屑病癥狀。這些藥物的銀屑病調(diào)節(jié)功能可以通過DGIdb 數(shù)據(jù)庫(kù)得到驗(yàn)證。

進(jìn)一步探索多靶向藥物分子是否作用于其他CASP 通路基因，發(fā)現(xiàn)這3 種藥物均調(diào)節(jié)CASP4和CASP8基因，而CysA 還作用于ZEB2 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。在銀屑病-細(xì)胞焦亡網(wǎng)絡(luò)藥物篩選結(jié)果中，CysA、MTX 和異維A 酸這3 種藥物已被廣泛應(yīng)用于治療銀屑病和其他自身免疫性疾病。研究結(jié)果表明，這3 種藥物可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡過程中的CASP 活性，在銀屑病的治療中發(fā)揮一定的作用。此外，本研究還進(jìn)一步探索可能作用于CASP 家族基因及其上游基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的中藥。

2.5 基于銀屑病-細(xì)胞焦亡基因網(wǎng)絡(luò)的中藥預(yù)測(cè)

為探索治療銀屑病的中醫(yī)藥解決方案，希望預(yù)測(cè)中藥及其化學(xué)成分通過干擾細(xì)胞焦亡與銀屑病的互作通路表達(dá)實(shí)現(xiàn)診療效果。為此，提交CASP 及其直接的上游轉(zhuǎn)錄因子至CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)，并檢索對(duì)這些基因具有調(diào)控作用的化學(xué)成分。選擇CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中文獻(xiàn)支持度高的化學(xué)成分，將這些化學(xué)成分提交至COREMINE 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索含有這些化學(xué)成分的中藥，選擇具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）的中藥。結(jié)果顯示，99 味中藥作用于CASP基因及其上游調(diào)節(jié)因子，其中61 味中藥作用于細(xì)胞焦亡與銀屑病重疊基因CASP4、CASP5、CASP8，66 味中藥作用于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 STAT3、VDR、ZEB2、CAMTA2、PREB 和BATF2（表2）。其中土茯苓、甘草、白花蛇舌草、白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓、赤芍、地黃、牡丹皮、防風(fēng)、茜草、黃芩、丹參、川芎、蒼術(shù)、菟絲子、桂枝17 味中藥在本課題組的臨床實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用[18]。這17 味中藥有11 味歸肝經(jīng)，8 味歸脾經(jīng)，意味著肝經(jīng)和脾經(jīng)在銀屑病和細(xì)胞焦亡過程中可能發(fā)揮重要作用。這與本課題組之前的研究結(jié)果相一致，研究發(fā)現(xiàn)通過咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠在肝郁狀態(tài)[19]或脾虛狀態(tài)[20]下皮損嚴(yán)重程度尤為顯著。這些發(fā)現(xiàn)不僅驗(yàn)證了基于基因網(wǎng)絡(luò)模型尋找到的中藥治療方案，也為中醫(yī)歸經(jīng)論治提供了新的思路?；诖?，對(duì)發(fā)現(xiàn)的99 味中藥進(jìn)行性味歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)，旨在進(jìn)一步探索經(jīng)絡(luò)和細(xì)胞焦亡調(diào)節(jié)的銀屑病發(fā)病過程的關(guān)系。

表2 作用于細(xì)胞焦亡與銀屑病重疊互作的直接調(diào)節(jié)因子Table 2 Direct regulator of overlapping interactions between pyroptosis and psoriasis

2.6 用藥頻次分析

為探索細(xì)胞焦亡調(diào)節(jié)的銀屑病發(fā)病過程中的經(jīng)絡(luò)特點(diǎn)，根據(jù)《中國(guó)藥典》《中藥大辭典》《中華本草》《中藥學(xué)》等藥典書籍對(duì)被篩選出的中藥進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)中藥功能以清熱藥（20 次）、補(bǔ)虛藥（16次）為主；藥味以苦（55 次）、辛（44 次）、甘（41次）為主；藥性以寒/微寒（38 次）、溫/微溫（32 次）、平（17 次）為主；歸經(jīng)以肝經(jīng)（48 次）、肺經(jīng)（43次）為主，較多涉及脾經(jīng)（38 次）、心經(jīng)（37 次）、胃經(jīng)（31 次），見圖7。用藥頻次結(jié)果與本課題組臨床用藥習(xí)慣一致，意味著肝經(jīng)用藥可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡影響銀屑病發(fā)病過程。同時(shí)，本研究結(jié)果也與近年來針對(duì)銀屑病作為心身疾病的屬性所提出的“從肝論治銀屑病”的理論相一致。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院皮膚科采用清肝涼血解毒方作為從肝經(jīng)論治銀屑病的基礎(chǔ)方，相關(guān)研究結(jié)果表明從肝經(jīng)論治銀屑病在治療過程中表現(xiàn)出良好的療效。此外，《素問·五臟生成篇》中提到“肺之合皮也，其榮毛也”的理論，說明肺在銀屑病治療中的重要地位。因此，歸經(jīng)屬肝、肺和脾經(jīng)的中藥可能通過影響細(xì)胞焦亡過程影響銀屑病病程。

圖7 用藥頻次分析Fig. 7 Analysis of medication frequency

3 討論

抑制CASP 驅(qū)動(dòng)的角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖是細(xì)胞焦亡過程調(diào)節(jié)銀屑病發(fā)病的機(jī)制之一，但是對(duì)于發(fā)病過程中的CASP基因表達(dá)的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)研究尚且缺乏。通過對(duì)銀屑病皮損組織和對(duì)照組織進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)包括CASP4、CASP5、CASP8、Bax、IL1B、CHMP2A以及CHMP7在內(nèi)的13 個(gè)基因參與細(xì)胞焦亡調(diào)節(jié)的銀屑病發(fā)病過程，其中一些基因已被現(xiàn)有研究證實(shí)與細(xì)胞焦亡及銀屑病相關(guān)。臨床研究表明，細(xì)胞焦亡的特征是KC 產(chǎn)生IL-1β[21]，其在皮膚組織中的表達(dá)升高導(dǎo)致銀屑病患者皮損區(qū)域膿皰和水腫現(xiàn)象增多[22-23]，并且在咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)也能觀察到IL-1βmRNA 表達(dá)增強(qiáng)[24]。銀屑病慢性期表皮CASP8的表達(dá)下調(diào)可介導(dǎo)p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/核因子-κB（nuclear factor kappa B subunit，NF-κB）/aspase-1/IL-1α 信號(hào)通路，導(dǎo)致S100 鈣結(jié)合蛋白A7（S100 calcium binding protein A7，S100A7）和IL-1α 分泌增加；銀屑病急性期CASP8表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致銀屑病患者皮膚中抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）的持續(xù)釋放增加，有助于防御皮膚感染[25]。CASP4、CASP5聯(lián)合CASP11、細(xì)菌脂多糖形成非經(jīng)典炎癥小體復(fù)合物，參與細(xì)胞膜破裂和裂解以及炎性因子如IL-18 和IL-1β 的釋放過程，導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生和發(fā)展[26]。此外，細(xì)胞焦亡相關(guān)的Bax基因高表達(dá)可抵抗銀屑病皮損組織KC 凋亡[27]，從而減輕銀屑病的癥狀。這些研究驗(yàn)證了細(xì)胞焦亡可通過基因表達(dá)異常、多種細(xì)胞因子失衡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常方面調(diào)控銀屑病的發(fā)病進(jìn)程。

基于計(jì)算重構(gòu)的細(xì)胞焦亡過程和銀屑病發(fā)生過程共同基因的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，探索了可能的靶點(diǎn)基因。發(fā)現(xiàn)包括STAT3、VDR、KLF3、RREB1、ATF6B、ZEB2 和KLF15 等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子通過調(diào)控細(xì)胞焦亡過程影響銀屑病的發(fā)生和發(fā)展。其中已有研究證實(shí)，STAT3 轉(zhuǎn)錄因子通過多個(gè)通路參與銀屑病。具體而言，KC 增殖和激活過程中分泌的C-X-C 模體趨化因子配體（C-X-C motif chemokine ligand 1/2，CXCL1/2）和IL-8 對(duì)樹突狀細(xì)胞、T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性產(chǎn)生刺激作用，并調(diào)節(jié) IL-6、IL-8、IL-21、CCL20、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等細(xì)胞因子的表達(dá)。本研究預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，STAT3 可能作為上游轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)CASP4基因的表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞焦亡過程參與銀屑病病程。此前的研究發(fā)現(xiàn)，CASP4和CSAP5共同參與非經(jīng)典炎癥小體復(fù)合物的形成，通過激活GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡過程最終導(dǎo)致炎性因子的釋放，促進(jìn)KC 增殖和角化異常[13]。本研究不僅預(yù)測(cè)了STAT3參與了GSDMD 相關(guān)信號(hào)通路，還發(fā)現(xiàn)BATF2 和PREB 以及STAT3 3 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)節(jié)CASP4和CSAP5，這意味著這些轉(zhuǎn)錄因子可能共同參與調(diào)控GSDMD的上游基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究預(yù)測(cè)了一個(gè)嶄新的機(jī)制，即STAT3 通過調(diào)節(jié)CASP4和CSAP5下游通路參與調(diào)控KC 的增殖和角化過程。另外，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子VDR 通過降低細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。VDR 激動(dòng)劑可以顯著減輕銀屑病的癥狀和促進(jìn)皮膚愈合，VDR 水平越低，銀屑病的面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI 評(píng)分）越高。研究發(fā)現(xiàn)，在銀屑病中VDR 可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)CASP8的表達(dá)，從而可能調(diào)節(jié)STAT3-GSDMEC-CASP8 通路，進(jìn)而影響角質(zhì)形成細(xì)胞的分化和增殖。利用COREMINE 綜合數(shù)據(jù)庫(kù)篩選了以STAT3-CASP 通路為中心的化學(xué)藥和中藥的相關(guān)信息，發(fā)現(xiàn)CysA、MTX 以及異維A 酸可以作用于包括STAT3、VDR 和ZEB2 在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，以及包括CASP4和CASP8在內(nèi)的Caspase 基因家族（圖8）。

圖8 STAT3-CASP4/5 通路誘導(dǎo)銀屑病細(xì)胞焦亡基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) (由BioRender 網(wǎng)站繪制)Fig. 8 Induction of psoriasis cell apoptosis gene regulatory network through STAT3-CASP4/5 pathway (created with BioRender.com)

為探索治療銀屑病的中醫(yī)藥解決方案，本研究使用CTD 和COREMONE 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得99 味以STAT3-CASP 通路為潛在靶點(diǎn)的中藥。其中清熱藥物的應(yīng)用最為廣泛，涉及清熱解毒藥和清熱涼血藥，這體現(xiàn)了銀屑病的主要病機(jī)是以“毒”為首要致病因素，而“血分有熱”是其核心病理機(jī)制。此外，99 味預(yù)測(cè)藥物中有17 味中藥在臨床上被應(yīng)用于治療銀屑病，且主要?dú)w于肝、脾經(jīng)。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)預(yù)測(cè)藥物的中藥性味和歸經(jīng)，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的中藥藥性以寒、溫、平為主，藥味多為苦、辛、甘，歸經(jīng)多屬于肝經(jīng)和肺經(jīng)。盡管寒與溫、苦與甘看似是相對(duì)的屬性，但在治療銀屑病時(shí)并不矛盾。這是因?yàn)殂y屑病的病機(jī)主要是血熱，而苦味藥物具有清熱瀉火、涼血解毒的功效，因此臨床上常用苦寒藥物，如黃連、黃芩等。然而，由于銀屑病病程長(zhǎng)久，為了避免久服苦寒藥物對(duì)中焦陽氣的傷害，通常會(huì)配合甘溫之品以制衡，如甘草、白術(shù)等。因此，盡管寒與溫、苦與甘看似是相對(duì)的，但當(dāng)它們?cè)谂湮閼?yīng)用時(shí)，能夠協(xié)同作用，相互制約，共同發(fā)揮治療作用。將中醫(yī)傳統(tǒng)的宏觀整體辨證理論，包括識(shí)證、選方和遣藥，與基于基因和蛋白質(zhì)的微觀辨證相結(jié)合，使中醫(yī)辨治更加精準(zhǔn)化。這種結(jié)合為中醫(yī)藥的“守正創(chuàng)新“提供了新的途徑。

4 結(jié)論

本研究探討了參與細(xì)胞焦亡的基因在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的共同調(diào)控作用，構(gòu)建了細(xì)胞焦亡在銀屑病中差異表達(dá)的基因所涉及的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，以及與網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)存在相互作用的潛在中藥治療藥物。本研究為后續(xù)研究細(xì)胞焦亡基因在銀屑病發(fā)病過程中發(fā)揮的作用提供了嶄新的分析解決方案，但就目前的研究現(xiàn)狀來看，細(xì)胞焦亡基因的表達(dá)情況及機(jī)制仍未完全闡明，細(xì)胞焦亡基因在銀屑病發(fā)病過程中的作用仍需要進(jìn)一步探索，中醫(yī)藥能否直接調(diào)控細(xì)胞焦亡通路，仍需要進(jìn)一步進(jìn)行大規(guī)模的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和臨床觀察。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突