UPLC-Q-TOF-MS/MS 聯(lián)和GNPS 技術(shù)對(duì)山茱萸及其炮制品的化學(xué)成分差異研究

向 俊，范 倩，陳雪冰，徐 婷，汪玉梅，王 倩*，張翠仙*

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院, 廣東 廣州 510120

2. 廣東一方制藥有限公司, 廣東 佛山 528244

3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006

山茱萸CorniFructus為山茱萸科植物山茱萸CornusofficinalisSieb. et Zucc.的干燥成熟果肉，產(chǎn)于山西、陜西、甘肅、江蘇、浙江等省，在朝鮮、日本也有分布[1]。山茱萸首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“山茱萸味酸平，主心下邪氣、逐寒濕痹，去三蟲，久服輕身”[2]。山茱萸為我國傳統(tǒng)的名貴滋補(bǔ)中藥材[3-4]，性微溫，味酸澀，為收斂性強(qiáng)壯藥，有補(bǔ)肝益腎，收澀固脫之功效，用于治療腎臟虛寒，高血壓，頭暈耳鳴，月經(jīng)過多等疾病；其主要含有環(huán)烯醚萜類、鞣質(zhì)類、黃酮類、芳香酚酸類及三萜類等多種化學(xué)成分；現(xiàn)代研究表明山茱萸具有補(bǔ)肝益腎、降糖、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用?，F(xiàn)代《中藥炮制學(xué)》中將山茱萸的炮制方法歸于“蒸法”，常見方法有清蒸、酒蒸、鹽蒸等，目前臨床主要為酒萸肉，而廣東等地區(qū)為使藥更易入腎，臨床上常用鹽制品[5-7]。文獻(xiàn)調(diào)研表明山茱萸及其炮制品物質(zhì)基礎(chǔ)相對(duì)薄弱[4,8]。全球分子網(wǎng)絡(luò)（global natural product social molecular networking，GNPS）是基于質(zhì)譜技術(shù)建立的“可視性”分子網(wǎng)絡(luò)[9-11]。通過天然物的二級(jí)質(zhì)譜特征可將具有相似二級(jí)質(zhì)譜信息的分子聚在一起，形成分子籠。GNPS 中不同母離子、分子籠形狀、尺寸和Node 顏色意味著不同的化合物簇。同時(shí)由于強(qiáng)大質(zhì)譜庫的存在，可以快捷、可視、簡便的用于指導(dǎo)天然物分離，尤其是在結(jié)構(gòu)新穎化合物的發(fā)現(xiàn)中具有明顯優(yōu)勢。因此本研究首先采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 結(jié)合GNPS 分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)對(duì)山茱萸水提物進(jìn)行全成分分析，并采用多元統(tǒng)計(jì)方法對(duì)山茱萸及其炮制品的差異性成分進(jìn)行分析，以期從整體的角度探究山茱萸及其不同炮制品間差異成分，為山茱萸臨床合理利用提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Triple-TOFTM 5600+型三重四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（美國AB SCIEX 公司，配日本島津LC-30AD超高壓效液相色譜儀、日本 Shimadzu 公司SIL-30AC 自動(dòng)進(jìn)樣器）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；盧湘儀DD-5M 低速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；煎煮鍋（廣州文新電器有限公司）；Sartorius 賽多利斯十萬分之一天平（季爾國際貿(mào)易有限公司）。

1.2 試劑與試藥

除LC-MS 用甲醇和乙腈（均為色譜級(jí)，德國默克股份有限公司），甲酸（質(zhì)譜級(jí)，美國Fluka 公司）外其余試劑皆為分析純（購于天津市大茂化學(xué)試劑廠）。對(duì)照品馬錢苷（批號(hào)RP181112）、獐牙菜苷（批號(hào)RP180506）、莫諾苷（批號(hào)RP181024）、熊果酸（批號(hào) RP190115）、沒食子酸（批號(hào)RP190162）、蘆?。ㄅ?hào)RP190213）和槲皮素（批號(hào)RP190602）均購自于成都麥德生股份有限公司，各對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。

山茱萸（Cor，批號(hào)190401211、181103291、180200361）、鹽制山茱萸（Ycor，批號(hào)190504271、190201811、190401251）和酒萸肉（Jcor，批號(hào)180507117、180200971、190405171）均購自康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院黃海波副教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸C.officinalisSieb. et Zucc.的干燥成熟果肉。按《中國藥典》2020 年版和2011年版《廣東省中藥飲片炮制規(guī)范》檢驗(yàn)均合格，樣品保存在廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院海洋天然物實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 分別取山茱萸及其炮制品飲片各30.0 g，精密稱定。分別加入1 L 純凈水浸泡30 min，水煮2 h 制成水煎液，趁熱濾過，藥渣采用此方法再煎煮1 次后，合并2 次濾液，離心（4000 r/min、15 min），上清濾液濃縮至約300 mL后加3 倍95%乙醇沉糖，于4 ℃冰箱靜置24 h，離心（4000 r/min、15 min），上清液在50 ℃減壓濃縮至粘稠狀態(tài)，氮?dú)獯蹈蓛x吹干部分溶劑，得稠浸膏。取浸膏適量，用80%甲醇水配制成質(zhì)量濃度約為50 mg/mL 的樣品溶液，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取馬錢苷、獐牙菜苷、莫諾苷、熊果酸、沒食子酸、蘆丁和槲皮素對(duì)照品適量，加80%甲醇制成各成分均含0.02 mg/mL 的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2 分析條件

2.2.1 色譜條件 ACE C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司），體積流量0.4 mL/min，PDA 全波長掃描，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量2 μL。以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%甲酸水為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0～5 min，5% A；5～15 min，5%～10% A；15～18 min，10% A；18～25 min，10%～15% A；25～30 min，15% A；30～38 min，15%～20% A；38～41 min，20%～25% A；41～42 min，25% A；42～50 min，25%～50% A；50～55 min，50%～70% A；55～60 min，70%～85% A；60～62 min，85%～90% A；62～65 min，90% A。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化源（ESI），采用正、負(fù)離子掃描模式（用亮氨酸腦啡肽作校正液，進(jìn)行實(shí)時(shí)校正）。離子噴霧電壓（ISVE）：＋5500/?5500 V；渦輪噴霧溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣壓力（GUR）：241.3 kPa；霧化氣（Gas1）：379.2 kPa；輔助氣（Gas2）：379.2 kPa；解簇電位（DP）：±100 V；碰撞能量（CE）：±30 eV；碰撞能散布（CES）：15 eV；離子釋放延遲（IRD）：67 V；離子釋放寬度（IRW）：25 V；IDA 設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps 的8 個(gè)最高峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍m/z100～1200。

2.3 化學(xué)數(shù)據(jù)庫分析

使用Peak ViewTM軟件（版本1.2，AB Sciex）對(duì)山茱萸中復(fù)雜化合物進(jìn)行定性鑒別。首先，通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)和化學(xué)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（CNKI、Chemspider、Web of Science、PubMeb 和SciFinder等），建立山茱萸化合物數(shù)據(jù)庫[4]，包括名稱、分子式和化學(xué)結(jié)構(gòu)文件。然后，將數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入到Peak ViewTM軟件的XIC Manager模塊對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行峰提取和匹配。提取的參數(shù)設(shè)置如下：XIC 強(qiáng)度（XIC intensity）＞50 counts，S/N＞10，同位素差異度（isotope ratio % difference）＜20，質(zhì)量誤差（mass error）＜1×10?5）。經(jīng)計(jì)算篩選后，軟件將各化合物的實(shí)測數(shù)據(jù)與軟件理論的數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，將匹配度大于75%且質(zhì)譜碎片裂解過程合理的結(jié)果作為山茱萸最終鑒定出來的化合物。

2.4 GNPS 網(wǎng)絡(luò)的建立

按“2.2”項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣，獲得正、負(fù)離子模式下山茱萸樣品及混合對(duì)照品溶液的UPLC-Q-TOF-MS/MS 二級(jí)質(zhì)譜文件，通過 MS Convert 軟件轉(zhuǎn)換后利用FileZilla FTP Client 連接器導(dǎo)入GNPS 平臺(tái)（http://gnps.ucsd.edu），分別建立正負(fù)離子模式下的山茱萸GNPS 網(wǎng)絡(luò)，并與混合對(duì)照品和譜庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配；數(shù)據(jù)分析在Cytoscape 3.6.1 軟件中進(jìn)行。

2.5 色譜峰提取、校正、歸一化

UPLC-Q-TOF-MS/MS 采集的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用Maker View 1.2 軟件（AB SCIEX 公司，美國）進(jìn)行分識(shí)別、匹配、分對(duì)齊、濾噪等預(yù)處理。具體步驟如下：將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Maker View 1.2 軟件后，首先進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，峰識(shí)別參數(shù)選擇；最小保留時(shí)間0.01 min，最大小保留時(shí)間115 min，最小質(zhì)荷比寬度5 scans，噪波閥值100。峰對(duì)齊參數(shù)設(shè)置：保留時(shí)間差0.2 min，質(zhì)荷比容差1×10?5。濾噪?yún)?shù)選擇：去除少于6 個(gè)樣本中出現(xiàn)的峰，最大峰數(shù)目8000 經(jīng)處理后可得到峰表，峰表主要顯示化合物的保留時(shí)間和m/z等信息，里面有大量缺失值，產(chǎn)生的主要原因：不存在該峰、峰存在但其檢驗(yàn)值過小以致于不能被正確識(shí)別、未在80%以上的同組樣本中出現(xiàn)，故需對(duì)其按“80%”原則剔除，再進(jìn)行峰面積的歸一化處理，即完成對(duì)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理。

2.6 主成分分析和多元統(tǒng)計(jì)分析

利用SIMCA-P 14.0 軟件對(duì)原始峰表數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)過Parato 變換后，首先采用主成分分析（principal component analysis，PCA）對(duì)山茱萸組、酒茱萸組、鹽制山茱萸組構(gòu)建PCA 模型，通過初步觀察各樣品的聚集情況，直觀地表達(dá)山茱萸及其不同炮制品之間的化學(xué)組成分差異；隨后選擇偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）進(jìn)行有監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析，進(jìn)一步通過S-plot、PLS-DA 模型中變量的變量權(quán)重值（VIP值，即反應(yīng)離子貢獻(xiàn)度）大于1.5 為臨界值尋找山茱萸與其不同炮制品的潛在差異化學(xué)成分。

3 結(jié)果與分析

按“2.2”項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣，獲得UPLC-QTOF-MS/MS 正、負(fù)離子模式下山茱萸樣品TIC 圖（圖1）。通過與對(duì)照品比對(duì)、數(shù)據(jù)庫匹配分析、相關(guān)參考文獻(xiàn)，對(duì)山茱萸主要成分進(jìn)行快速表征，共鑒定或推斷117 種成分（表1）：44 個(gè)環(huán)烯醚萜類成分（24 個(gè)環(huán)戊烷環(huán)烯醚萜類、12 個(gè)裂環(huán)型環(huán)烯醚萜類、8 個(gè)環(huán)烯醚萜二聚體）、2 個(gè)三萜類成分、22 個(gè)鞣質(zhì)類成分、19 個(gè)黃酮及其苷類成分、21 個(gè)芳香酸類成分和9 個(gè)其他類成分。其中12 個(gè)為山茱萸中首次鑒定到的化合物（9 個(gè)為潛在新成分）。

圖1 山茱萸水提物UPLC-Q-TOF-MS/MS 正 (A)、負(fù) (B) 總離子流圖Fig. 1 Positive (A), negative (B) total ion flow chromatograms of water extract of Corni Fructus by UPLC-Q-TOF-MS/MS

表1 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 和GNPS 鑒定的山茱萸中成分離子信息Table 1 Characterization of component ion information of Corni Fructus by UPLC-Q-TOF-MS/MS and GNPS

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

3.1 利用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)對(duì)山茱萸化學(xué)成分的分析

3.1.1 環(huán)烯醚萜類化合物 此類物質(zhì)是山茱萸茱萸中含量最高的成分類群，為其主要活性成分。結(jié)構(gòu)類型涉及環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜（代表結(jié)構(gòu)馬錢苷）、裂環(huán)環(huán)烯醚萜（代表結(jié)構(gòu)莫諾苷）和環(huán)烯醚萜二聚體（代表結(jié)構(gòu)cornuside O）3 類，其大部分與糖相連形成環(huán)烯醚萜苷[4]。通過質(zhì)譜分析，在山茱萸水提物中共鑒別37 個(gè)已知的環(huán)烯醚萜類（表1）：17 種環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜、12 種裂環(huán)環(huán)烯醚萜及8 種環(huán)烯醚萜二聚體。此類成分在正離子模式下響應(yīng)較好。在正離子模式檢測下，峰61 給出了m/z391.160 1 [M＋H]+的分子離子峰，二級(jí)質(zhì)譜圖（圖2）中可觀察到碎片離子m/z373.146 8 [M＋H－H2O]+、359.132 0 [M＋H－CH3OH]+、341.122 7 [M＋H－CH3OH－H2O]+、229.106 7 [M＋H－Glc]+、211.095 9 [M＋H－Glc－H2O]+、197.080 9 [M＋H－Glc－CH3OH]+、179.069 6[M＋H－Glc－CH3OH－H2O]+和151.074 8 [M＋H－Glc－CH3OH－CO]+，其保留時(shí)間和裂解方式均與馬錢苷對(duì)照品一致，且質(zhì)譜裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[25]，推測峰61 為馬錢苷。同樣根據(jù)馬錢苷裂解規(guī)律及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的對(duì)比[15,25]，系列該類型的化合物被鑒定（19、23、24、26、27、31、52、39、40、46、51、67、69、71、75），見表1。

圖2 馬錢苷的二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律圖Fig. 2 MS2 spectrum and proposed fragmentation pathways of loganin

對(duì)于裂環(huán)環(huán)烯醚萜的結(jié)構(gòu)鑒定，在負(fù)離子模式檢測下，峰30 給出了m/z405.142 6 [M－H]?的準(zhǔn)分子離子峰，其主要的裂解是丟失側(cè)鏈的葡萄糖殘基、H2O 和CH3OH 分子。其次是結(jié)構(gòu)中不穩(wěn)定的半縮醛結(jié)構(gòu)開環(huán)回醛式，然后脫去1 分子CO。二級(jí)質(zhì)譜圖中，其主要的碎片離子有m/z373.115 2 [MH－CH3OH]?、243.086 3 [M－H－Glc]?、225.078 0[M＋H－Glc－H2O]?、193.051 0 [M－H－Glc－CH3OH－H2O]?、155.034 1 [M－H－Glc－CH3OH－2CO]?，其保留時(shí)間和裂解方式均與莫諾苷對(duì)照品一致，且質(zhì)譜裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[25]，確認(rèn)峰30 為莫諾苷，其裂解規(guī)律如圖3 所示。類似地，通過莫諾苷裂解規(guī)律及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的對(duì)比[25]，系列此類型化合物均被鑒定（22、28、32、34、37、41、54、59、65、99、97），見表1。環(huán)烯醚萜二聚體類化合物為環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜和裂環(huán)環(huán)烯醚萜通過單鍵連接在一起而形成的環(huán)烯醚萜類化合物。在負(fù)離子模式檢測下，峰104 在負(fù)離子模式檢測下給出了m/z823.228 9 [M＋HCOO]?的分子離子峰，二級(jí)質(zhì)譜圖可觀察到碎片離子m/z777.293 1 [M ＋HHCOOH]?、615.235 5 [M＋H－HCOOH－Glc]?、453.173 6 [M＋H－HCOOH－2Glc]?等，和它的4個(gè)同分異構(gòu)體不同的是它具有連續(xù)丟失2 個(gè)葡萄糖的特征性離子，通過對(duì)比參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[4,24]，推測峰104 為cornuside O。同系列化合物也均被確定（96、98、100、102、105、109 和110），見表1。

圖3 莫諾苷的二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律圖Fig. 3 MS2 spectrum and proposed fragmentation pathways of morroniside

3.1.2 黃酮類化合物 通過數(shù)據(jù)庫分析，在山茱萸提取物中共檢測到14 個(gè)黃酮類已知化合物。對(duì)于黃酮及其苷類化合物的裂解，先是失去連在環(huán)上的取代基如羥基、甲氧基、糖基；隨后是C 環(huán)的開裂或者重排。C 環(huán)的開裂一般產(chǎn)生A?和B?離子，C 環(huán)的重排涉及CO（m/z28）、HCO（m/z29）、CO2（m/z44）等的丟失。其中從中性丟失的小分子，可以推斷其連在環(huán)上的取代基。C 環(huán)的開裂產(chǎn)生的離子對(duì)于母核的推斷具有重要的意義。如峰107 在負(fù)離子模式檢測下顯示了m/z301.035 6 [M－H]?的準(zhǔn)分子離子峰，其主要的碎片離子有m/z273.041 4 [MH－CO]?、257.045 2 [M－H－CO2]?、229.050 9 [MH－CO2-CO]?、151.004 3、121.030 3，其中m/z151.004 3 是由RDA1,3A?裂解產(chǎn)生的碎片離子，m/z121.030 3 是由RDA1,3B?丟失1 分子CO 得到的碎片離子，其保留時(shí)間和二級(jí)裂解碎片均與槲皮素對(duì)照品一致，峰107 被鑒定為槲皮素。類似地，通過槲皮素和蘆丁的裂解規(guī)律及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的對(duì)比[18]，其他黃酮類化合物18、21、53、81、84、85、87、90、92、95、103、112 和114 均被鑒定（表1）。

3.1.3 鞣質(zhì)類化合物 在山茱萸水提物中共檢測到22 個(gè)鞣質(zhì)類化合物。對(duì)于沒食子酰鞣質(zhì)類的鑒定，其裂解規(guī)律為中性丟失沒食子?；╣alloyl，152）、丟失整個(gè)葡萄糖基（162）及糖環(huán)的交叉環(huán)切除裂解（C2H4O2，60；C3H6O3，90）。在負(fù)離子模式下，峰6 在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z361.076 9 [M－H]?，其主要二級(jí)信息有m/z343.067 5[M－H－H2O]?、325.054 9 [M－H－2H2O]?、m/z301.057 1 [M－H－60]?、271.044 7 [M－H－90]?、241.035 0 [M－H－120]?、211.023 1 [M－H－150]?、169.013 5、125.024 6，其二級(jí)碎片主要是由于糖鏈的斷裂或者丟失整個(gè)糖基產(chǎn)生的。m/z301.057 1、271.044 7、241.035 0、211.023 1 均是由于糖鏈不同位置處的斷裂，分別丟失中性碎片C2H4O2（m/z60）、C3H6O3（m/z90）、C4H8O4（m/z120）和C5H10O5（m/z150）產(chǎn)生。m/z169.013 5 和125.024 6 則是由母離子相繼丟失整個(gè)景天庚酮糖和CO2得到的。根據(jù)以上碎片離子信息及參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[26]，推測峰6為7-O-沒食子酰-D-景天庚酮糖。類似地，通過7-O-沒食子酰景天庚酮糖的裂解規(guī)律及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的對(duì)比[21,26]，同系列鞣質(zhì)類化合物4、9、13、14、20、33、36、38、44、47、49、62、68、83 均被鑒定；29、63、66、78 與48 均為特里馬素Ⅰ或其同分異構(gòu)體；同樣地化合物11、20 和50 也依次被鑒定（表1）。

3.1.4 芳香酚酸類化合物 此類化合物含有較多的酚羥基和羧基，裂解時(shí)易失去H2O、CO、CO2及HCOOH 等基團(tuán)。在山茱萸水提物中共檢測到22個(gè)有機(jī)酸類化合物。峰7 在正離子模式下出現(xiàn)m/z171.028 7 [M＋H]+的準(zhǔn)分子離子峰。其二級(jí)碎片主要有m/z153.017 0 [M＋H－H2O]+、135.009 4 [M＋H－2H2O]+、125.026 0 [M＋H－HCOOH]+、109.028 8[M＋H－H2O－CO2]+和107.013 4 [M＋H－2H2OCO]+，通過與對(duì)照品保留時(shí)間及二級(jí)碎片的比對(duì)，可確定峰7 為沒食子酸。類似地，通過沒食子酸的裂解規(guī)律及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的對(duì)比[20]，系列芳香酚酸類化合物1～3、5、12、15、16、25、35、42、56、58、60、64、74、80、82、86、89、93 和101 均被鑒定（表1）。

3.1.5 三萜類化合物 三萜類化合物是山茱萸的有效成分之一，在山茱萸樣品中共鑒定了2 個(gè)三萜化合物（116 和117），見表1。峰117 在正離子模式下顯示了m/z457.364 4 [M＋H]+的準(zhǔn)分子離子峰，主要的碎片離子有m/z439.357 8 [M＋HH2O]+、411.362 1 [M＋H－HCOOH]+和393.355 0[M＋H－HCOOH－H2O]+，其主要的裂解先是丟失側(cè)鏈的H2O 分子和HCOOH。然后是結(jié)構(gòu)當(dāng)中的C環(huán)容易進(jìn)行RDA 裂解，把母核分為A、B 環(huán)和C、D 環(huán)。而碎片離子m/z203.178 0 [M＋H－C14H22]+和191.179 6 [M＋H－Glc－C15H22]+是由RDA 裂解產(chǎn)生。其保留時(shí)間和裂解方式均與熊果酸對(duì)照品一致，且質(zhì)譜裂解方式與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，確認(rèn)峰117為熊果酸。

3.1.6 其他類化合物 其他類成分包括甾體類、生物堿類和糖類等。在山茱萸提取物中共檢測到9 個(gè)其他類化合物。在負(fù)離子模式下，峰8 的準(zhǔn)分子離子峰為m/z125.025 6 [M－H]?，經(jīng)軟件計(jì)算其分子式為C6H6O3，其主要的碎片離子為m/z107.016 4[M－H－H2O]?，通過參考文獻(xiàn)的比對(duì)[14]，推測峰8為5-羥甲基糠醛。峰111 準(zhǔn)分子離子峰為m/z597.217 4 [M ＋HCOO]?，對(duì)應(yīng)的分子式為C27H36O12，主要的碎片離子為m/z551.217 4、389.162 3、227.107 7。其中m/z551.217 4 是由母離子丟失HCOOH 產(chǎn)生的，m/z389.162 3、227.107 7則是由母離子相繼丟失2 分子葡萄糖殘基產(chǎn)生的。根據(jù)參考文獻(xiàn)報(bào)道[17]，推測峰111為cornucadinoside D。同樣地系列化合物還有91（異構(gòu)體）、106、108和113 也被鑒定。而79、115 則為生物堿。

3.2 通過GNPS 對(duì)山茱萸水提物中環(huán)烯醚萜和黃酮類化合物的鑒定

基于MS/MS 光譜的相似性，正、負(fù)離子模式下的山茱萸水煎煮液樣品和山茱萸混合標(biāo)準(zhǔn)品的可視化 GNPS 分子網(wǎng)絡(luò)分別被建立（正離子：https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task=523 dd234cc4e457cbe293ccc7570a655；負(fù)離子：https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task=63d7ee40b 7ae480a98ef4a9cbe4844fc）。在正離子模式下的GNPS 分子網(wǎng)絡(luò)里，分析了2 個(gè)主要的分子籠。通過分子籠Node 點(diǎn)信息、對(duì)照品及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，推測鑒定了12 個(gè)化合物：9 個(gè)為潛在的新化合物（結(jié)構(gòu)涉及7 個(gè)環(huán)烯醚萜類和2 個(gè)黃酮類）和3 個(gè)首次在山茱萸屬植物中鑒定的黃酮類成分（圖4），在負(fù)離子模式下山茱萸的GNPS 分子網(wǎng)絡(luò)里，暫未挖掘分析到新的化合物。主要對(duì)此12 個(gè)成分進(jìn)行描述。

圖4 山茱萸中12 個(gè)首次鑒定化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu) (*為9 個(gè)潛在新結(jié)構(gòu))Fig. 4 Chemical structure of 12 compounds firstly identified from Corni Fructus (* means potential new structures)

在正離子模式下分子籠I 的相對(duì)分子質(zhì)量在m/z331.103～798.338，主要結(jié)構(gòu)類型為環(huán)烯醚萜類化合物（圖5-A）。其中節(jié)點(diǎn)408.187 [M＋NH4]+經(jīng)LC-MS 與對(duì)照品的保留時(shí)間及二級(jí)碎片信息鑒定馬錢苷。同時(shí)節(jié)點(diǎn)m/z377.144 [M＋H]+和m/z394.171 [M＋NH4]+為馬錢子酸（峰27），節(jié)點(diǎn)m/z507.171 [M＋H]+和m/z524.197 [M＋NH4]+為山茱萸新苷Ⅲ或山茱萸新苷Ⅳ（峰75）。以節(jié)點(diǎn)m/z493.155 和m/z426.197 的鑒定為例，節(jié)點(diǎn)m/z493.155 與m/z507.171 相關(guān)聯(lián)，且比m/z507.171 低14，推測其可能比m/z507.171 少1 個(gè)-CH2基團(tuán)。并且m/z493.155 節(jié)點(diǎn)二級(jí)質(zhì)譜圖中出現(xiàn)m/z493.268 6 [M＋H]+的準(zhǔn)分子離子峰，分子式為C20H28O14，其主要的二級(jí)碎片有m/z475.147 5 [M＋H－H2O]+、457.132 8 [M＋H－2H2O]+、439.124 9[M＋H－3H2O]+、359.135 1 [M＋H－C4H6O5]+、197.081 5 [M＋H－C4H6O5－Glc]+、179.070 1 [M＋H－C4H6O5－Glc－H2O]+（圖5-B），與m/z507.17 1的二級(jí)裂解相似，但由于未發(fā)現(xiàn)與脫去CH3OH 相關(guān)的 [M＋H－CH3OH]+、[M＋H－CH3OH－H2O]+、[M＋H－CH3OH－H2O－CO]+等碎片離子，說明其C-4 位連接“-COOH”取代基，而非“-COOCH3”取代基，推測節(jié)點(diǎn)m/z493.155 為CO-2（峰43），經(jīng)過SciFinder 查找驗(yàn)證，該化合物為山茱萸屬植物中潛在新化合物。節(jié)點(diǎn)m/z426.197 與m/z377.144（馬錢子酸）相關(guān)聯(lián)，表明它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上類似。節(jié)點(diǎn)m/z426.197 相對(duì)分子質(zhì)量和m/z377.144 相差32，而且節(jié)點(diǎn)m/z426.197 產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子峰為426.188 9 [M＋NH4]+，其二級(jí)碎片有m/z409.170 0[M＋NH4－NH3]+、247.118 0 [M＋NH4－NH3－Glc]+、229.107 4 [M＋NH4－NH3－Glc－H2O]+、211.096 8 [M＋NH4－NH3－Glc－2H2O]+、197.081 1[M＋NH4－NH3－Glc－H2O－CH3OH]+、169.086 0[M＋NH4－NH3－Glc－H2O－CH3OH－CO]+、151.075 9 [M＋NH4－NH3－Glc－2H2O－CH3OHCO]+、133.065 4 [M＋NH4－NH3－Glc－3H2OCH3OH－CO]+，二級(jí)碎片顯示有3 個(gè)中性水分子的丟失，及CH3OH 和CO 的相繼丟失，基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析及與之關(guān)聯(lián)的參考化合物m/z377.144（馬錢子酸），推測節(jié)點(diǎn)m/z426.197 化合物為CO-1（峰17），經(jīng)過SciFinder 查找驗(yàn)證，為山茱萸屬植物中潛在的新化合物。此外，其他一系列未知離子m/z522.18、475.215、523.165、489.16、433.169 也聚集在同一個(gè)分子籠內(nèi)，表明這些離子與馬錢苷具有相同的母核，同時(shí)結(jié)合它們的二級(jí)碎片，推斷分別為CO-3、CO-4、CO-5、CO-6、CO-11，經(jīng)過SciFinder查找驗(yàn)證，均為山茱萸屬植物中潛在的新化合物。

圖5 山茱萸的分子網(wǎng)絡(luò)圖和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 5 GNPS and MS2 spectrum of Corni Fructus

分子籠II 主要由黃酮及鞣質(zhì)類化合物構(gòu)成（圖5-C）。其中節(jié)點(diǎn)m/z611.16 經(jīng)LC-MS 與對(duì)照品的保留時(shí)間及二級(jí)碎片信息鑒定為蘆丁。以蘆丁作為參考物質(zhì)鑒定其他離子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。節(jié)點(diǎn)m/z597.144、479.081、611.124 均和節(jié)點(diǎn)m/z611.16（峰81 即蘆?。┫嚓P(guān)聯(lián)，具有相同的二級(jí)碎片離子m/z303，表明m/z597.144、479.081、611.124 這3 個(gè)化合物和m/z611.16（蘆?。┚哂邢嗤拈纹に剀赵?。其中節(jié)點(diǎn)m/z597.144 產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子峰為m/z597.143 9 [M＋H]+，其主要的二級(jí)碎片為m/z465.100 8 [M＋H－Ara]+、447.0868 [M＋H－Ara－H2O]+、303.049 4 [M＋H－Ara－Glc]+，可見m/z303.049 4 [M＋H－Ara－Glc]+是母離子相繼丟失阿拉伯糖和葡萄糖的產(chǎn)生的，因此結(jié)合關(guān)聯(lián)對(duì)照品m/z611.16（蘆?。┘岸?jí)碎片信息，節(jié)點(diǎn)m/z597.144被鑒定為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-α-L-阿拉伯糖（峰76 即CO-9），經(jīng)過SciFinder 查找驗(yàn)證，該化合物為山茱萸植物中首次鑒定到。同理，節(jié)點(diǎn)m/z479.081 的主要二級(jí)碎片m/z303.049 0 [M＋HGlu]+是由于母離子丟失1 分子葡萄糖醛酸（Glu，176）產(chǎn)生的。而節(jié)點(diǎn)m/z611.123 的分子離子峰為m/z611.122 9 [M＋H]+，分子式為C26H26O17，其主要二級(jí)碎片為m/z479.081 6 [M＋H－Ara]+、303.049 8[M＋H－Ara－Glu]+，對(duì)比m/z611.16（峰81 即蘆?。┘捌涠?jí)碎片信息，因此節(jié)點(diǎn)m/z479.081 和節(jié)點(diǎn)m/z611.124 分別鑒定為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸（峰87）和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸-α-L-阿拉伯糖（峰77 即CO-10），經(jīng)過SciFinder 查找驗(yàn)證，后者為山茱萸屬植物中潛在的新化合物。類似地，節(jié)點(diǎn)m/z627.154 和m/z611.16（蘆?。┮蚕嚓P(guān)聯(lián)，它產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子峰為627.151 8 [M＋H]+，其二級(jí)碎片為m/z481.095 0 [M＋H－Rha]+、319.044 1 [M＋H－Rha－Glc]+，它和m/z611.16（蘆丁）丟失相同的中性碎片片段 [－Rha－Glc]，但是具有不同的苷元母核，節(jié)點(diǎn)m/z627.154 的主要二級(jí)碎片離子為m/z319.044 1，表明其苷元為楊梅素，因此節(jié)點(diǎn)m/z627.154 被鑒定為楊梅素-3-O-β-D-葡萄糖-α-L-鼠李糖（峰73 即CO-8），經(jīng)過SciFinder查找驗(yàn)證，該化合物為山茱萸屬植物中潛在的新化合物。同理，節(jié)點(diǎn)m/z495.076、479.081、463.086相關(guān)聯(lián)，它們丟失相同的中性碎片片段葡萄糖醛酸，但具有不同的苷元母核。其中節(jié)點(diǎn)m/z479.081 前面已經(jīng)描述，為已知化合物槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸。節(jié)點(diǎn)m/z495.076 的二級(jí)質(zhì)譜圖中形成了m/z319.045 6 的基峰，表明其苷元為楊梅素；節(jié)點(diǎn)m/z463.086 的二級(jí)質(zhì)譜圖中形成了m/z287.054 4 的基峰表明其苷元為山柰酚，結(jié)合其二級(jí)碎片信息，節(jié)點(diǎn)m/z495.076、463.086 分別被鑒定為楊梅素-3-Oβ-D-葡萄糖醛酸（峰72 即CO-7）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸（峰94 即CO-12），經(jīng)過SciFinder 查找驗(yàn)證，兩者均為山茱萸屬植物中首次鑒定到。

3.3 山茱萸及其不同炮制品差異性分析結(jié)果

3.3.1 山茱萸及其不同炮制品之間差異化學(xué)成分的篩選與鑒定 根據(jù)“2.2”項(xiàng)下的檢測條件，對(duì)山茱萸及其不同炮制品的臨床水煎煮液的供試品溶液測樣分析。經(jīng)過預(yù)處理后的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行一系列的多元統(tǒng)計(jì)分析，采用正離子模式山茱萸及其炮制品樣本進(jìn)行PCA 模式識(shí)別，得到PCA 的得分圖（圖6-A）。利用PCA 模型生成得分散點(diǎn)圖可知，山茱萸、鹽制山茱萸和酒萸肉分別集中于2 個(gè)不同的區(qū)域，且在主成分t[1]方向有明顯區(qū)分，表明山茱萸炮制前后在化學(xué)成分種類及含量上差異明顯。

圖6 山茱萸及其炮制品的PCA (A) 和PLS-DA (B) 的得分圖及PLS-DA 的載荷圖 (C) 和VIP 圖 (D)Fig. 6 PCA score chart (A), PLS-DA score chart (B), PLS-DA loading plot (C), and VIP plot of PLS-DA (D) of Corni Fructus and its processed products

PCA 通過對(duì)樣本整體水平的評(píng)估，在一個(gè)低維空間內(nèi)用最少的成分?jǐn)?shù)量描述最大的變異量，既可反映數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)，又反映組內(nèi)和組間差異。而PLS-DA 是基于降維的多維向量分析方法，可預(yù)設(shè)分類，盡量去除未控制變量對(duì)數(shù)據(jù)分析的影響，二者相互補(bǔ)充。PLS-DA 得分圖顯示生山茱萸、酒萸肉和鹽制山茱萸能夠較好的分離，各自聚類（圖6-B～D）。同時(shí)模型參數(shù)顯示為R2X＝0.858，R2Y＝0.92，Q2＝0.763，說明模型的擬合準(zhǔn)確性及模型的內(nèi)部驗(yàn)證預(yù)測能力較好；采用200 次置換檢驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示R2和Q2回歸線與左邊縱軸相交（R2-intercept＝0.575；Q2-intercept＝?0.189），Q2在y軸上的截距小于0，說明模型沒有過擬合。PLS-DA 的VIP 得分圖見圖6-D。本研究選擇VIP值大于1.5 的變量作為差異變量。正離子模式下共篩選出226 個(gè)變量。通過精確質(zhì)量數(shù)測定與MS/MS分析，并與文獻(xiàn)報(bào)道相比較，及與對(duì)照品保留行為及質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，共鑒定出32 個(gè)差異性成分（表2），分別為14 個(gè)環(huán)烯醚萜類化合物、9 個(gè)芳香酚酸類化合物、2 個(gè)鞣質(zhì)類成分、3 個(gè)黃酮類化合物和4 個(gè)其他類成分。

表2 山茱萸及其炮制品的32 個(gè)化學(xué)標(biāo)記物 (VIP＞1.5)Table 2 32 chemical markers from Corni Fructus and its processed products (VIP > 1.5)

3.3.2 主要差異性成分在山茱萸及其不同炮制品的相對(duì)含量 在上述差異化合物中，經(jīng)過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，目前文獻(xiàn)報(bào)道[27-28]比較多的山茱萸藥效成分主要有莫諾苷、馬錢苷、7-O-沒食子酰-D-景天庚酮糖、5-羥甲基糠醛、獐牙菜苷、沒食子酸、咖啡酰酸單甲酯、逆沒食子酸。其中補(bǔ)肝益腎的主要活性成分為馬錢苷[27]、莫諾苷[28]、7-O-沒食子酰-D-景天庚酮糖[29]、5-羥甲基糠醛[30]和逆沒食子酸[31]。研究表明與中藥功能屬性密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)，作為反映中藥安全性和有效性的標(biāo)示性物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制更為合適。因此本研究通過不同樣品中差異成分在質(zhì)譜檢測中的響應(yīng)度（即強(qiáng)度）來初步計(jì)算衡量差異性成分的相對(duì)含量，著重分析與山茱萸功能屬性密切相關(guān)的差異性化合物在不同炮制品中的相對(duì)含量（圖7）。

圖7 山茱萸及其炮制品典型化學(xué)標(biāo)記物的相對(duì)含量Fig. 7 Relative contents of typically chemical markers of Corni Fructus and its processed products

可以看出，經(jīng)過炮制后，5-羥甲基糠醛、沒食子酸和逆沒食子酸的含量都顯著增加，其中5-羥甲基糠醛具有非常明顯的保肝益腎作用，逆沒食子酸具有抗糖尿病、保護(hù)肝腎功能的功效[31]，這可能跟山茱萸炮制后溫補(bǔ)肝腎的作用增強(qiáng)有關(guān)，臨床主要用于滋補(bǔ)方劑。經(jīng)炮制后7-O-沒食子酰-D-景天庚酮糖、莫諾苷、蘋果酸含量顯著降低，可能與炮制過程促進(jìn)它們分解有關(guān)。其中莫諾苷具有抗休克與固虛脫的作用，蘋果酸抗血栓作用，所以這成分的變化可能對(duì)其炮制后斂汗固脫作用減弱有關(guān)。對(duì)于獐牙菜苷和馬錢苷，酒制品含量相比于生品略微降低了，但鹽制品比生品略增加，可能是因?yàn)辂}制條件有助于提高它們的溶解度。由此可見，上述山茱萸主要差異性活性成分含量變化可能是炮制過程中不同山茱萸炮制品藥效改變的物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 討論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)結(jié)合GNPS 分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)系統(tǒng)地分析了山茱萸水煎液的化學(xué)成分，鑒定了117 個(gè)化合物，其中12 個(gè)首次從山茱萸中分析得到，進(jìn)一步明確了山茱萸臨床應(yīng)用的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)采用UPLC-Q-TOF/MS 結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)山茱萸、酒制山茱萸和鹽制山茱萸進(jìn)行差異物分析，篩選了32 個(gè)化學(xué)差異物。此研究不僅豐富了山茱萸化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，還初步明確了山茱萸炮制后藥效成分改變的物質(zhì)基礎(chǔ)，為后續(xù)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供詳實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突