大腸桿菌過表達(dá)EutJ、EutG對慶大霉素的耐藥性分析

翁嘉儀 俞丹丹 張?jiān)５?高媛媛

翁嘉儀，俞丹丹，張?jiān)５?，?大腸桿菌過表達(dá)EutJ、EutG對慶大霉素的耐藥性分析[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2023，54（9）：69-74.

收稿日期：2023-07-20

作者簡介：翁嘉儀，女，1999年生，碩士研究生，主要從事細(xì)菌耐藥研究。

*通信作者：高媛媛，女，1979年生，博士，副教授，主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)理及防治技術(shù)研究（E-mail：541175559@qq.com）。

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2020J01175）。

摘? 要：為篩選新的耐藥關(guān)鍵基因并研究其耐藥機(jī)制以緩解細(xì)菌耐藥難題。通過構(gòu)建乙醇胺利用伴侶蛋白EutJ、醇脫氫酶EutG過表達(dá)菌株，對兩株菌進(jìn)行慶大霉素殺傷測試，以攜帶空質(zhì)粒對數(shù)期野生型大腸桿菌的殺傷效果作為對照，進(jìn)一步測定其最小抑菌濃度（MIC），并通過抑菌圈檢測抗生素?cái)z取等方法，對乙醇胺代謝與細(xì)菌耐受的關(guān)聯(lián)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：過表達(dá)EutJ、EutG后大腸桿菌能通過降低菌體內(nèi)抗生素濃度，以提高在慶大霉素殺傷條件下的存活率，證明eutJ、eutG基因可作為幫助細(xì)菌逃逸抗生素攻擊的潛在耐受相關(guān)基因。因此，乙醇胺代謝關(guān)鍵酶EutJ、EutG有望成為免疫佐劑或新型抗生素研發(fā)的作用靶標(biāo)。

關(guān)鍵詞：乙醇胺利用伴侶蛋白EutJ；醇脫氫酶EutG；慶大霉素；耐藥性

中圖分類號：Q 93??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??? 文章編號：0253-2301（2023）09-0069-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.09.011

Drug Resistance Analysis of the Overexpression of EutJ and EutG to Gentamicin

WENG Jia-yi， YU Dan-dan， ZHANG Yu-dan， GAO Yuan-yuan*

（Fujian University Key Laboratory of Cellular Stress Response and Metabolic Regulation/

College of Life Science， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350108， China）

Abstract： In order to screen the new drug-resistant key genes and study their drug resistance mechanisms to alleviate the problem of bacterial resistance， by constructing the overexpression strains of the ethanolamine-utilizing chaperone protein EutJ and the alcohol dehydrogenase EutG， the killing tests of gentamicin were performed on the two strains. Then， by taking the killing effect of the wild-type Escherichia coli carrying the empty plasmid in logarithmic phase as the control group， the minimum inhibitory concentration （MIC） was further determined， and the correlation between the ethanolamine metabolism and bacterial tolerance was studied through the detection of antibiotic uptake by inhibition zone. The results showed that after the overexpression of EutJ and EutG， Escherichia coli could reduce the concentrations of antibiotics in the bacteria to improve the survival rate under the condition of gentamicin killing， which proved that the genes of eutJ and eutG could be used as the potential tolerance-related genes to help the bacteria escape from the antibiotic attacks. Therefore， the key enzymes of ethanolamine metabolism， EutJ and EutG， were expected to be the targets for the development of immune adjuvants or new antibiotics.

Key words： Ethanolamine-utilizing chaperone protein EutJ； Alcohol dehydrogenase EutG； Gentamicin； Drug resistance

自1966年慶大霉素（Gentamicin）被我國王岳教授首次從小單孢菌中分離后，便廣泛用于臨床和獸醫(yī)治療[1]。慶大霉素屬于氨基糖苷類抗生素，具有廣譜抗菌性和速效殺菌性[2]，但由于長期的不合理使用，導(dǎo)致耐藥細(xì)菌（Antibiotic-resistant bacteria）的大量出現(xiàn)，這讓慶大霉素的利用效率大大降低[3-4]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的耐藥細(xì)菌有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）[5]、耐萬古霉素腸球菌（VRE）[6]、耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌[7]、多重耐藥銅綠假單胞菌[8]和多重耐藥的大腸桿菌[9]。為緩解日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥問題，不僅需要研制能夠應(yīng)對的抗生素藥物，同時(shí)還應(yīng)篩選更多潛在的藥物靶點(diǎn)[10-11]。已有研究發(fā)現(xiàn)涉及許多偶聯(lián)反應(yīng)的代謝途徑是多重靶向抗生素的理想靶標(biāo)，例如參與類異戊二烯生物合成及催化甾醇和大腸桿菌細(xì)胞壁生物合成后期階段的酶是甲氧西林和萬古霉素等抗生素的靶標(biāo)[12]。乙醇胺（Ethanolamine， EA）以磷脂酰乙醇胺的形式存在，是大腸桿菌細(xì)胞膜的基本成分，同時(shí)作為重要的碳氮替代來源[13]。而乙醇胺利用伴侶蛋白EutJ、醇脫氫酶EutG在乙醇胺代謝中發(fā)揮著不可缺少的作用[14-17]，因此推測其可作為大腸桿菌新耐藥靶點(diǎn)。目前對EutJ、EutG與抗生素耐藥性的研究較少，也未有證據(jù)表明這兩種蛋白與細(xì)菌耐受性有直接關(guān)系，但有研究認(rèn)為EutG活性對工程菌株中異丁醛向異丁醇的轉(zhuǎn)化有關(guān)，并參與自然環(huán)境中四環(huán)素的降解[18-19]。

為探討乙醇胺代謝與細(xì)菌耐藥的關(guān)聯(lián)問題，本研究通過使用pCA24N表達(dá)載體構(gòu)建大腸桿菌乙醇胺代謝相關(guān)蛋白過表達(dá)菌株BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG），并與攜帶pCA24N空質(zhì)粒的野生型大腸桿菌進(jìn)行慶大霉素殺傷情況比較，以測試過表達(dá)EutJ、EutG菌株對慶大霉素耐受性的影響，經(jīng)過測定最小抑菌濃度排除其為耐藥菌后，進(jìn)一步利用抑菌圈檢測抗生素?cái)z取方法檢測EutJ、EutG過表達(dá)菌株的胞內(nèi)抗生素濃度，以便深入了解乙醇胺代謝相關(guān)蛋白EutJ、EutG對大腸桿菌慶大霉素耐藥性的影響，并挖掘了EutJ、EutG蛋白在細(xì)菌耐藥方面的新功能，希望為研制抗生素基因抑制型佐劑提供有效的靶點(diǎn)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

1.1.1? 菌株與質(zhì)粒? 本試驗(yàn)所用菌株為實(shí)驗(yàn)室保藏野生型大腸桿菌BW25113，質(zhì)粒載體為pCA24N。

1.1.2? 試驗(yàn)儀器與試劑? 試驗(yàn)儀器：超低溫冰箱（-80℃）、恒溫水平震蕩搖床、凝膠瓊脂電泳儀、SDS-PAGE電泳儀、凝膠成像儀、恒溫培養(yǎng)箱（37℃）、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、震蕩渦旋儀、金屬浴。試劑：慶大霉素（25 mg·mL-1）由ddH2O配置而成，氯霉素（35 mg·mL-1）用分析乙醇配制而成。以上抗生素儲液均用0.22 μm濾膜過濾除菌后備用?？捡R斯亮藍(lán)R250染料，6×Loading Buffer， 10% SDS，洗脫液。0.01 mol·L-1 PBS緩沖液（每1 L包含NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 1.42 g、KH2PO4 0.27 g）經(jīng)過高溫高壓滅菌后使用，100 mg·mL-1溶菌酶用0.22 μm濾膜過濾除菌后備用。

1.1.3? 培養(yǎng)基? LB培養(yǎng)基：每1 L包含氯化鈉10 g、酵母粉5 g、蛋白胨10 g；MHB培養(yǎng)基（由北京索萊寶科技有限公司提供）；LB固體培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基需在LB液體培養(yǎng)基中加入7.5 g瓊脂后高溫高壓滅菌，在培養(yǎng)基溫?zé)釙r(shí)倒入無菌培養(yǎng)皿中，待凝固后備用。以上培養(yǎng)基均經(jīng)過高溫高壓滅菌。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 大腸桿菌EutJ、EutG過表達(dá)菌株的構(gòu)建? 將實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱保藏的ASKA文庫中的帶有pCA24N（eutJ）、pCA24N（eutG）的菌株JM109選取出來，劃線至帶有氯霉素抗性的平板中，于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h后，挑取帶有pCA24N（eutJ）、pCA24N（eutG）的菌株單克隆進(jìn)行菌落PCR，將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠電泳分離，并送樣測序。待測序正確后，用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit試劑盒提取質(zhì)粒。在微融的野生型大腸桿菌BW25113感受態(tài)中加入2 μL提取的質(zhì)粒，冰上靜止30 min后，在預(yù)熱充分的42℃金屬浴上熱激90 s，迅速放于冰上靜止2 min，在EP管中加入1 mL LB后，放置搖床復(fù)蘇1 h，將復(fù)蘇后的菌液濃縮涂布于含有氯霉素的抗性板中，與37℃恒溫培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落接種于LB，培養(yǎng)至平臺期后保菌備用。

1.2.2? 考馬斯亮藍(lán)染色法驗(yàn)證蛋白表達(dá)情況? 將保藏的過表達(dá)菌株接種于新鮮LB，過夜培養(yǎng)至平臺期后，以1∶100轉(zhuǎn)接于含35 μg·mL-1 氯霉素的LB中，以220 r·min-1，37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)期OD600 0.45～0.55后，加入終濃度為1 mmol·mL-1的IPTG，搖床誘導(dǎo)30 min后，取500 μL菌液于1.5 mL EP管中，用12000 r·min-1離心2 min，徹底去除上清，加入25 μL 10% SDS溶液和25 μL Loading Buffer，震蕩混勻后，于99.9℃金屬浴煮樣15 min，待樣品澄清透明后，冷卻至室溫。將獲得的蛋白樣用15%的SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離。分離完成后用將膠切下考馬斯亮藍(lán)R250染色40 min，染色至蛋白分離膠呈深藍(lán)色后，用洗脫液洗脫至清晰的蛋白條帶出現(xiàn)。

1.2.3? EutJ、EutG過表達(dá)菌株對氨基糖苷類抗生素慶大霉素耐受性測驗(yàn)? 將平臺期BW25113-pCA24N（empty）、BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）接種于新鮮LB，以1∶100轉(zhuǎn)接于含35 μg·mL-1 氯霉素的LB中，置于搖床培養(yǎng)至對數(shù)期OD600 0.45～0.55后，加入終濃度為1 mmol·mL-1的IPTG，搖床誘導(dǎo)30 min，取100 μL菌液于EP管中，12000 r·min-1離心去上清，加入同體積的0.01 mol·L-1 PBS緩沖液重懸作為對照樣品備用。取誘導(dǎo)至OD600≈0.8的菌液1 mL于滅菌后的玻璃搖菌管。分別加入終濃度5 μg·mL-1慶大霉素，在處理時(shí)間1、2、3 h分別取100 μL菌液，12000 r·min-1離心去上清，加入同體積的0.01 mol·L-1 PBS緩沖液，充分混勻作為處理樣品備用。將以上樣品用PBS緩沖液10倍稀釋后點(diǎn)板，吹干后放置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后觀察菌的生長狀況。

1.2.4? EutJ、EutG過表達(dá)菌株對慶大霉素MIC測定? 將慶大霉素用2倍稀釋法在含氯霉素的MHB培養(yǎng)基中稀釋成相應(yīng)濃度（0、0.5、1、2、4、8、16、32 μg·mL-1），再分別取200 μL含慶大霉素MHB培養(yǎng)基按照濃度從小到大排列加入96孔板中備用。將平臺期BW25113-pCA24N（empty）、BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）轉(zhuǎn)接于新鮮MHB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至對數(shù)期OD600 0.45～0.55，用1 mmol·mL-1 IPTG誘導(dǎo)30 min后，將得到的OD600≈0.8的菌液1∶5稀釋，取2 μL稀釋后的菌液加入對應(yīng)的板孔中。將加樣完畢的放置在37℃培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)24 h后，用移液槍輕輕吹打菌液混勻，觀察菌株在不同濃度抗生素條件下的生長情況。

1.2.5? EutJ、EutG過表達(dá)菌株胞內(nèi)慶大霉素濃度測定? 為測試BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）對慶大霉素耐受性是否是由于對抗生素的攝取減少導(dǎo)致的。首先將野生型BW25113培養(yǎng)至OD600≈0.3，用PBS稀釋50后，取1 mL菌液均勻的涂布在含有固體LB培養(yǎng)基的10 cm×10 cm方型培養(yǎng)基上晾干備用。其次將BW25113-pCA24N（empty）、BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）培養(yǎng)至OD600≈0.5，加入終濃度為1 mmol·mL-1的IPTG誘導(dǎo)30 min后，取50 μL菌液離心去上清，再加入等體積的PBS緩沖液，震蕩后點(diǎn)板在瓊脂培養(yǎng)基上。另取2個1 mL誘導(dǎo)后的BW25113-pCA24N（empty）、BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）菌液于玻璃搖菌管中，在上述菌液中加入終濃度15、25 μg·mL-1 Genta置于37℃、220 r·min-1搖床處理1 h。同時(shí)取900 μL BW25113-pCA24N（empty）菌液于1.5 mL EP管中，12000 r·min-1、離心2 min，徹底去除上清，加入25 μL溶菌酶工作液，分別加入濃度梯度為20、30、40、50、60 μg·mL-1的慶大霉素，渦旋充分震蕩后，放入搖床孵育1.5 h以制備標(biāo)準(zhǔn)品。待樣品處理完畢，取50 μL菌液離心去上清，加入等體積PBS緩沖液，震蕩后點(diǎn)板在瓊脂培養(yǎng)基上。另取900 μL處理后菌液在EP管中，同上述方法離心徹底去除上清后，加入25 μL溶菌酶工作液，充分渦旋，放入搖床孵育1.5 h制成處理樣品。將孵育后的標(biāo)準(zhǔn)品和處理樣品，用液氮反復(fù)凍融3次，每次10 s，使細(xì)胞充分破碎。為使溶菌酶失活，需用90℃金屬浴煮樣10 min。最后，取5 μL孵育后的標(biāo)準(zhǔn)品和處理樣品點(diǎn)在涂布過BW25113的方型培養(yǎng)基上。將點(diǎn)好樣品的方型培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后觀察出圈情況。

2? 結(jié)果與分析

2.1? EutJ、EutG過表達(dá)菌株的構(gòu)建

由圖1可知，所構(gòu)建的EutJ、EutG過表達(dá)菌株目的基因長度正確。由圖2可知，目的片段eutJ、eutG基因測序結(jié)果與NCBI上大腸桿菌K-12 MG1655菌株eutJ、eutG基因一致。由圖3可知，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）能夠表達(dá)目的蛋白EutJ、EutG。綜上結(jié)果表明EutJ、EutG過表達(dá)菌株構(gòu)建成功。

2.2? 過表達(dá)EutJ、EutG菌株對氨基糖苷類抗生素慶大霉素的耐受分析

由圖4可知，BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）在抗生素未處理時(shí)的菌量基本一致，用5 μg·mL-1 Genta處理1 h后菌量無顯著差異，但處理2 h和3 h，相比于BW25113-pCA24N（empty），BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）存活菌量對比空質(zhì)粒菌株高了4個數(shù)量級，呈現(xiàn)明顯的耐受表型，差異極顯著。結(jié)果表明，過表達(dá)EutJ、EutG能增加野生型大腸桿菌BW25113對慶大霉素的抵抗力。

2.3? EutJ、EutG過表達(dá)菌株對慶大霉素MIC測定

由圖5可知，BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）對慶大霉素的MIC為0～0.5 μg·mL-1，并未高于對照組，由此說明BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）不屬于耐藥菌。

2.4? EutJ、EutG過表達(dá)菌株胞內(nèi)慶大霉素濃度測定

由圖6可知，與BW25113-pCA24N（empty）相比，BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）在15、25 μg·mL-1 Genta處理1 h的殺菌條件下，細(xì)菌存活率高2～3個數(shù)量級。根據(jù)圖7標(biāo)準(zhǔn)樣品出圈直徑繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示。將圖7處理樣品抑菌圈對應(yīng)直徑標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到處理樣品胞內(nèi)抗生素濃度。由圖9可知，BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）相較于BW25113-pCA24N（empty）胞內(nèi)慶大霉素含量減少。

3? 結(jié)論與討論

抗生素的發(fā)現(xiàn)為醫(yī)療、養(yǎng)殖、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域帶來了巨大的好處，但抗生素的濫用也導(dǎo)致耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生。因此，迫切需要開發(fā)新的抗生素以跟上細(xì)菌耐藥的步伐。目前可以通過基于全細(xì)胞的表型篩選、基于靶標(biāo)的篩選或基因篩選來識別新的可藥用靶標(biāo)和新類別的抗菌化合物[12]。

本研究通過表型驗(yàn)證得到對慶大霉素耐受的乙醇胺代謝相關(guān)基因eutJ、eutG，通過MIC測試過表達(dá)EutJ、EutG的MIC不改變，即未產(chǎn)生耐藥菌。而研究表明，當(dāng)細(xì)菌間歇性暴露于抗生素時(shí)，耐受性也可能在耐藥性的演變中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。因此篩選能夠抑制這些耐受相關(guān)基因的靶向化合物顯得格外重要。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌過表達(dá)EutJ、EutG能通過降低胞內(nèi)抗生素水平來抵抗殺傷，極端自然條件或人為造成的高濃度抗生素環(huán)境是否會造成EutJ、EutG表達(dá)量自主上調(diào)，而EutJ、EutG的上調(diào)是如何造成胞內(nèi)抗生素水平含量降低，是否有其他導(dǎo)致慶大霉素耐受的機(jī)制，例如，抗生素外排增加、代謝途徑變緩慢、ATP水平降低、活性氧水平降低等，有待進(jìn)一步深入的探究。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）