Cd 脅迫下水稻Cd亞細(xì)胞特征及游離氨基酸含量變化分析

林紅梅，李齊向

(1.閩江學(xué)院地理與海洋學(xué)院,福建 福州 350108; 2.福州海洋研究院,福建 福州 350002;3.三明市種子站,福建 三明 365000)

Cd(cadmium，Cd)是元素周期表中第五周期ⅡB的金屬元素，地殼中Cd主要以硫Cd礦物的形式存在。隨著工業(yè)革命后化石燃料燃燒及有色金屬的開采增加以來，被釋放的Cd通過空氣、水等途徑進(jìn)入土壤，造成礦區(qū)附近的耕地受到不同程度的Cd污染，而且，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，污水灌溉、污泥農(nóng)用等一系列活動(dòng)進(jìn)一步加劇農(nóng)田土壤Cd污染程度。水稻是全球人口的主要糧食作物之一，也是Cd吸附能力較強(qiáng)的農(nóng)作物之一，人體過量的攝入Cd容易導(dǎo)致腎損傷、骨損傷、肝臟損傷，甚至致癌、致突變等。近年來，水稻受Cd污染的事件越來越受到重視，探索水稻應(yīng)答Cd脅迫的響應(yīng)機(jī)制有助于降低或防止種植Cd污染的稻米。

植物長(zhǎng)期或短期暴露于Cd環(huán)境中均能引起植株異常的Cd毒性反應(yīng)。研究顯示，當(dāng)水稻受到高于0.05 mmol·L-1Cd濃度脅迫時(shí)即能產(chǎn)生明顯的損傷[1]，表現(xiàn)出葉綠體結(jié)構(gòu)破壞、色素合成受阻，光合作用和呼吸作用發(fā)生改變，物質(zhì)和能量代謝發(fā)生紊亂。與此同時(shí)，植株體內(nèi)也能產(chǎn)生一系列的生理響應(yīng)來緩解Cd的毒害。細(xì)胞壁是阻擋Cd進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的第一道屏障[2]，而且Cd在植物組織中有選擇性的分布能有效減少Cd脅迫對(duì)植物產(chǎn)生的傷害。目前Cd脅迫下水稻組織Cd的亞細(xì)胞分布研究報(bào)道較少。此外，作為多種天然產(chǎn)物的前體，氨基酸在植物受到脅迫時(shí)的反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用[3]。在生物與非生物脅迫下，作為機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育最重要的代謝物質(zhì)-氨基酸及其衍生物通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白磷酸化過程，改變氨基酸的代謝過程和代謝水平，代謝物響應(yīng)變化顯示了植物體對(duì)抗Cd脅迫所做出的防御機(jī)制。因此，通過監(jiān)測(cè)氨基酸代謝的變化，可以更好地了解Cd脅迫程度及其相關(guān)機(jī)制。

因此，本研究以水稻Nipponbare和Lemont為研究材料，分析不同Cd處理水平對(duì)水稻葉片Cd的亞細(xì)胞分布以及游離氨基酸生理代謝的影響，探討不同水稻品種對(duì)Cd脅迫在物質(zhì)積累及Cd積累效應(yīng)上的響應(yīng)差異，以期揭示水稻應(yīng)答Cd脅迫的重要防御機(jī)制，為低Cd水稻種質(zhì)資源篩選以及Cd污染農(nóng)田的生態(tài)修復(fù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試材料為Nipponbare及Lemont兩個(gè)水稻品種，Cd為CdCl22.5H2O分析純?cè)噭Ｔ囼?yàn)于2023年5月閩江學(xué)院教學(xué)試驗(yàn)基地進(jìn)行。首先，選取飽滿健康的水稻種子經(jīng)自來水清洗后浸泡24 h，經(jīng)10%次氯酸鈉消毒及雙蒸水沖洗后，置30℃培養(yǎng)箱催芽，隨后將種子均勻播于裝滿濕潤(rùn)細(xì)沙的砂盆中。待3葉1心時(shí)，選取健壯且長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽至塑料盆中。水稻植株由打孔的泡沫板及海綿固定，塑料盆含2 L營(yíng)養(yǎng)液，營(yíng)養(yǎng)液配方參照Yoshida等[4]方法配置，pH調(diào)至5.6，每盆栽種6棵水稻幼苗。待水稻幼苗恢復(fù)生長(zhǎng)1周后，以正常水培且未加Cd處理的水稻為對(duì)照組(CK)，添加5 μmol·L-1(Cd5)、50 μmol·L-1(Cd50)和100 μmol·L-1(Cd100)Cd營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的植株為處理組，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，處理時(shí)間為7 d，處理結(jié)束后采其植株葉片，液氮速凍，用于光合色素、Cd亞細(xì)胞分布及游離氨基酸含量測(cè)定。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1水稻葉片葉綠素和類胡蘿卜含量測(cè)定 葉綠素和類胡蘿卜素含量測(cè)定采用比色法。取0.2 g水稻鮮樣置于含少量石英砂和碳酸鈣粉的研缽中，加入95%乙醇研磨浸提至組織變白，靜置3 min；通過乙醇濕潤(rùn)過的濾紙過濾至25 mL棕色容量瓶中、搖勻，即為色素提取液。取適量提取液移入1 cm光徑比色杯，測(cè)定470、649和665 nm波長(zhǎng)下吸光度，同時(shí)以未加樣品的95%乙醇溶液為空白對(duì)照。

1.2.2水稻葉片Cd亞細(xì)胞分布 不同的細(xì)胞組分分離參照宋阿琳等[2]方法(差速離心法)略有改動(dòng)。取0.5 g鮮樣于研缽中，加入250 mmol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCL緩沖液(pH 7.5)及1 mmol·L-1DTT，低溫快速研磨至勻漿，移入離心管，離心，轉(zhuǎn)移上清液1，剩余殘?jiān)鼮榧?xì)胞壁組分；4℃、16000 r·min-1離心上清液1，轉(zhuǎn)移上清液2，剩余部分為細(xì)胞器組分，上清液2為細(xì)胞質(zhì)組分。細(xì)胞壁、細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)組分置干燥箱中烘干，參照Lin等[5]方法進(jìn)行微波消解以及電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)定Cd元素含量。

1.2.3水稻葉片游離氨基酸測(cè)定 參照鄭瑞生等[6]測(cè)定水稻葉片游離氨基酸含量。新鮮樣品加入70%乙醇，100℃回流浸提4次，浸提液去乙醇、脫色、蒸干，pH2.2、0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，采用氨基酸全自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用EXCEL整理、DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 Cd脅迫對(duì)水稻葉片色素含量的影響

由表1可知，隨Cd處理濃度增加，葉綠素和類胡蘿卜素含量均不斷下降；與CK相比，Cd5處理顯著降低Nipponbare葉綠素含量，降幅達(dá)6.17%，類胡蘿卜素含量未發(fā)生顯著變化；Cd50和Cd100顯著降低2種水稻葉綠素和類胡蘿卜素含量，其中Nipponbare葉綠素降幅分別為20.13%和50.32%，降幅大于Lemont(分別為14.06%和39.62%)；Nipponbare類胡蘿卜素含量降幅分別為41.94%和67.74%，降幅大于Lemont(分別為29.41%和52.94%)。對(duì)比2種水稻色素含量，Lemont水稻葉綠素和類胡蘿卜素含量均大于Nipponbare，且Cd50和Cd100處理時(shí)差異達(dá)顯著水平。

表1 不同Cd濃度處理下水稻葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量

2.2 Cd脅迫對(duì)水稻葉片Cd亞細(xì)胞分布的影響

由表2可知，隨Cd處理濃度增加，2種水稻各亞細(xì)胞組織Cd含量不斷增加，與CK相比，當(dāng)Cd5、Cd50和Cd100處理時(shí)，Nipponbare水稻各亞細(xì)胞組織Cd含量差異均達(dá)顯著水平；當(dāng)Cd50和Cd100處理時(shí)，Lemont各亞細(xì)胞組織Cd含量也達(dá)顯著水平；各亞細(xì)胞組織Cd含量表現(xiàn)為細(xì)胞壁>細(xì)胞質(zhì)>細(xì)胞器，表明細(xì)胞壁是水稻積累Cd的主要部位；其中，不同Cd濃度處理下Nipponbare細(xì)胞壁Cd含量占總Cd比例為86.24%～88.59%，Lemont為88.66%～94.17%。對(duì)比2種水稻Cd亞細(xì)胞分布可知，Nipponbare水稻顯著高于Lemont水稻。

表2 不同Cd處理下水稻葉片Cd亞細(xì)胞分布

2.3 Cd脅迫對(duì)水稻葉片游離氨基酸含量的影響

由表3可知，當(dāng)Cd5處理時(shí)，Nipponbare水稻甘氨酸和Lemont水稻脯氨酸發(fā)生顯著改變，其他游離氨基酸含量均未發(fā)生顯著改變。與CK相比，當(dāng)Cd50和Cd100處理時(shí)，Nipponbare水稻脯氨酸、半胱氨酸及谷氨酸含量隨Cd處理濃度增加而顯著增加，增幅為77.27%和139.61%、62.5%和112.5%、45.37%和67.22%；當(dāng)Cd50和Cd100處理時(shí)，Lemont水稻脯氨酸、半胱氨酸及谷氨酸增加25.7%和84.92%、57.14%和107.14%、38.69%和68.59%；Cd50處理顯著提高兩種水稻丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸含量，但隨Cd處理濃度增加到Cd100時(shí)，Nipponbare水稻苯丙氨酸、甲硫氨酸以及Lemont水稻丙氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸未發(fā)生顯著性變化；對(duì)于組氨酸，僅當(dāng)濃度為Cd100時(shí)才發(fā)生顯著增加，而蘇氨酸在任何Cd處理水平下都未發(fā)生顯著改變。對(duì)比2種水稻在3種Cd處理水平下游離氨基酸含量，結(jié)果顯示，除蘇氨酸外，Nipponbare水稻游離氨基酸含量都大于Lemont水稻?？梢姡珻d脅迫下，2種水稻細(xì)胞通過積累游離氨基酸含量增強(qiáng)其抗性，而且不同水稻品種之間存在一定的基因型差異。

表3 不同Cd處理下水稻葉片游離氨酸含量

3 討論

3.1 水稻葉片光合色素及Cd亞細(xì)胞分布對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)

光合作用是植物物質(zhì)合成的主要途徑，而光合色素直接影響光合作用的強(qiáng)度。本研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫導(dǎo)致葉綠素和類胡蘿卜素含量下降，低濃度Cd5時(shí)表現(xiàn)不太顯著，但高濃度Cd50和Cd100時(shí)表現(xiàn)顯著，表明Cd脅迫導(dǎo)致水稻葉綠素和類胡蘿卜素合成受阻，而且隨著Cd處理濃度增加，光合色素下降越明顯，說明Cd對(duì)色素合成的抑制存在劑量效應(yīng)，該生理變化模式與王霞等[7]發(fā)現(xiàn)的研究結(jié)果相一致。光合色素合成主要由葉綠體結(jié)構(gòu)和相關(guān)酶活性調(diào)節(jié)，本研究高濃度Cd脅迫下，Nipponbare水稻葉綠素和類胡蘿卜素下降幅度大于Lemont水稻，可能是高濃度Cd對(duì)Nipponbare水稻葉綠體結(jié)構(gòu)和相關(guān)酶活性影響更大，促使色素合成受阻，甚至發(fā)生分解。水稻對(duì)Cd的抗性不僅與其各器官對(duì)Cd的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[8]，而且還與Cd在組織內(nèi)的亞細(xì)胞分布緊密聯(lián)系[9]。本研究Cd亞細(xì)胞組織分布結(jié)果顯示，各組織Cd含量隨Cd處理濃度增加而顯著增加，其中Lemont水稻各組織Cd小于Nipponbare水稻，表明水稻組織中Cd在亞細(xì)胞內(nèi)的分布因水稻品種不同而表現(xiàn)差異。此外，所有組織中Cd，絕大部分Cd分布在細(xì)胞壁，其中Nipponbare占比最高達(dá)88.59%，Lemont占比最高達(dá)94.17%，說明Lemont細(xì)胞壁對(duì)Cd有更強(qiáng)的結(jié)合作用，減少Cd2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引起Cd毒害。該結(jié)果與Cd脅迫對(duì)棉花和堿蓬等[10-11]物種的研究結(jié)果一致，說明細(xì)胞壁固定Cd是植物抗Cd毒害的重要機(jī)理之一。

3.2 水稻葉片游離氨基酸含量對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)

氨基酸作為蛋白質(zhì)組成原料，不僅對(duì)適宜環(huán)境下植物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的作用，而且也能在植物逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮積極作用。本研究發(fā)現(xiàn)不同種類間游離氨基酸含量變化存在較大差異，其中高濃度Cd50和Cd100均提高了兩種水稻脯氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸含量，而且Nipponbare水稻顯著高于Lemont，表明Cd脅迫可引起抗逆相關(guān)的游離氨基酸的合成，Nipponbare水稻表現(xiàn)更為明顯。張金彪等[12]研究顯示，Cd脅迫引起草莓游離脯氨酸的增加；不僅如此，重金屬脅迫導(dǎo)致植物游離脯氨酸的積累在較多植物中普遍存在，游離脯氨酸的積累有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢(shì)，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，本研究水稻在重金屬Cd脅迫下游離脯氨酸含量增加是水稻應(yīng)對(duì)逆境脅迫的一種生理適應(yīng)。半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸是合成谷胱甘肽的重要前體物質(zhì)，而谷胱甘肽是植物細(xì)胞內(nèi)含巰基的一種低分子肽，不僅是一種重要的抗氧化物質(zhì)，而且能通過巰基與Cd離子結(jié)合，緩解Cd產(chǎn)生的毒害[13]。本研究Cd脅迫下半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸含量增加是機(jī)體運(yùn)用谷胱甘肽代謝來增強(qiáng)水稻Cd抗性的策略之一。不僅如此，含硫化合物，如甲硫氨酸等，均可通過其氨基酸代謝調(diào)控參與緩解Cd對(duì)植株產(chǎn)生的毒害[14]。近年的研究表明，游離氨基酸越來越多地參與植物抗重金屬脅迫的過程，游離氨基酸中的功能團(tuán)(羧基和氨基等)可通過螯合作用螯合有毒的重金屬離子，降低重金屬對(duì)植物產(chǎn)生的毒害，起到解毒作用[15]。

綜上所述，2種水稻通過調(diào)整體內(nèi)光合色素生物合成、游離氨基酸合成及Cd亞細(xì)胞分布響應(yīng)Cd脅迫，而且不同水稻品種間在Cd脅迫生理響應(yīng)中存在顯著的基因型差異，該差異可視為水稻對(duì)Cd毒害的一種抗逆適應(yīng)表現(xiàn)。