七葉一枝花種質資源鑒定與評價研究進展

牛雨晴，江保東，朱育菁，鄭梅霞，陳 宏，蘇海蘭*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所,福建 福州 350003;2.井岡山市長坪林場,江西 井岡山 363400)

重樓ParisLiliaceae為百合科重樓屬多年生草本植物。2020年版《中國藥典》記載，藥材重樓來源于百合科植物寬瓣重樓[P.polyphyllavar.Yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.](云南重樓或滇重樓)和七葉一枝花重樓(P.polyphyllavar.chinensis)[1]。七葉一枝花重樓又叫華重樓，形狀奇特，葉上有葉，花上有花，具有較高觀賞價值。七葉一枝花以根莖入藥且藥用價值突出，主要化學成分為甾體皂苷類、黃酮類、三萜類和脂肪酸類，主要功效為清熱解毒、驅蚊止血、涼肝定驚，是著名中成藥云南白藥、宮血寧膠囊、季德勝蛇藥片、抗病毒顆粒等產(chǎn)品的主要原料[2]。

隨著七葉一枝花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，市場對七葉一枝花優(yōu)質種質資源的需求十分迫切。國內對七葉一枝花的研究方向多為植物學特征、栽培技術及藥理機制方面，對七葉一枝花種質資源的規(guī)范化鑒定、選種育種等研究較少[3]。七葉一枝花利用價值多樣，在人工栽培過程中，優(yōu)質種質資源匱乏，有效成分含量低等問題日益顯現(xiàn)，因此，急需加強七葉一枝花種質資源鑒定、篩選優(yōu)質種質資源等研究工作。通過調查種質資源，深入開展鑒定與評價，發(fā)掘具有經(jīng)濟價值與學術價值的優(yōu)質資源，是促進種質資源合理利用的有效手段。本文從七葉一枝花的分布、鑒定和評價3個方面進行展開，綜述其種質資源的相關研究進展，以期為七葉一枝花種質資源的進一步開發(fā)利用提供一定參考。

1 七葉一枝花種質資源分布

1.1 地域分布

七葉一枝花主要分布在我國云南、貴州、四川和西藏等省區(qū)，生于海拔500～3500余m左右的闊葉林下[4]。本文對目前我國已有的七葉一枝花野生資源調查分布研究進行統(tǒng)計，見表1。七葉一枝花為陰生植物，喜斜射或散射光，喜溫、喜濕，常生于林蔭潮濕處，闊葉林下陰濕處，或溝谷邊的草叢中，生長地土壤為富含腐殖質和有機質的沙質土壤。七葉一枝花較抗寒和抗干旱，但也懼怕霜凍。

表1 我國七葉一枝花野生資源分布狀況

除七葉一枝花主要分布省區(qū)以外，在黃河流域以南的不少省份均發(fā)現(xiàn)其變種出現(xiàn)。2018年曾在陜西省發(fā)現(xiàn)陜產(chǎn)重樓屬除原記載有重樓組的北重樓和南重樓組的重樓、狹葉重樓和具柄重樓外，還有寬葉重樓、短梗重樓、長藥隔重樓、七葉一枝花和云南重樓5個變種，且均為分布新紀錄；曾百林等[6]對三峽大老嶺自然保護區(qū)內分布的重樓屬植物進行調查與統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)七葉一枝花分布最為廣泛，集中于西南向、硬闊植被下且海拔為800～2000 m。因此，在七葉一枝花資源收集與調查研究中，了解野生種質資源分布和生長現(xiàn)狀以外，也可以進一步詳細掌握各地存在的變種及資源特點，才能推進野生資源的有效保護，更有效地服務于七葉一枝花種質資源研究和林下種植產(chǎn)業(yè)。

1.2 種質資源生物學特性

隨著重樓新資源的不斷發(fā)現(xiàn)，各種古籍中對重樓資源生物學特征的描述稍有不同之處?！秷D經(jīng)本草》記載重樓圖并對其做如下描述“河中、河陽、華、鳳、文州及江淮有之。六月開紫黃花、蕊赤黃色，上有金絲垂下，俗呼重樓金線。秋結紅子，根似肥姜，皮赤肉白。四五月采根，日干用”?！侗静菰肌穼χ貥堑拿枋鰹椤傲麻g開黃紫花，蕊赤黃色，上有金絲垂下。秋結紅子。根如紫參，皮黃肉白。四、五月采根，日干”[18]?，F(xiàn)代《中國植物志》[19]考證，七葉一枝花葉植株高35～100 cm，基部為圓形或寬楔形，雄蕊8～12枚，花藥短，長0.5～1.8 cm，長與花絲等長或稍長，根狀莖粗厚，直徑達1～2.5 cm，外面棕褐色，密生多數(shù)環(huán)節(jié)和許多須根。

七葉一枝花的葉序屬于輪生葉，葉片有個體差異，從4片到14片都有，因此“七葉”只是名稱。研究者在古籍的基礎上，對七葉一枝花資源的形態(tài)進行補充描述，其根狀莖粗厚、棕褐色，密生環(huán)節(jié)和須根，果實呈紫色，直徑1.5～2.5 cm，3～6瓣裂開，種子數(shù)目較多[20]。

2 七葉一枝花種質資源鑒定研究

七葉一枝花種質資源的差異反映在不同層面上，檢測方法包括形態(tài)標記、顯微鑒別、分子標記等，用多種方法從不同層面對七葉一枝花種質資源進行鑒定及研究其遺傳多樣性，能夠更好地定義七葉一枝花種質資源，對于挖掘和利用優(yōu)異種質資源具有重要意義[21]。

2.1 形態(tài)學標記研究

形態(tài)學標記研究是基于個體性狀描述，通過肉眼可見或儀器測量樣本的外部特征的一項研究。形態(tài)學標記研究質量性狀的遺傳顯得更簡單、方便，可對植物進行初步的評價分析，此方法在七葉一枝花研究中得到了廣泛應用。閆道良等[5]測量莖數(shù)、株高、莖粗、葉片數(shù)、葉長、花萼寬、花萼長等多個性狀數(shù)據(jù)并進行聚類分析，將浙江省48份七葉一枝花種質資源分為三大類群，各項指標顯著高的為第一大類群，外部形態(tài)普遍矮小的為第二大類群，各項指標在中等水平的為第三大類群。王元忠等[22]收集七葉一枝花、南重樓、西疇重樓等5種重樓屬植物6個種群的野生資源，測定16個與藥材品質相關的表型性狀(包括株高、莖粗、葉片數(shù)等)，結合多元統(tǒng)計分析，通過形態(tài)學標記可以將大部分樣品區(qū)分開，并且可通過花梗長、株高、莖粗、葉寬、葉柄長、葉長和葉片數(shù)間接預測地下藥用部位產(chǎn)量。趙飛亞等[23]基于植株大小、葉片、葉脈、萼片、花瓣、花亭和雄蕊等形態(tài)特征對七葉一枝花、矮重樓、多葉重樓等建立了鑒別方法，為指導重樓栽培、臨床應用和資源開發(fā)提供科學依據(jù)。周玲[24]通過試驗研究了神農(nóng)架林區(qū)多葉重樓3個變種的形態(tài)解剖結構及光合生理特征，分析了它們葉片、根系形態(tài)結構的差異。

基于形態(tài)學標記研究可以快速、簡單的初步鑒別樣本類別，但是重樓屬植物種類較多，基本外觀特征均為莖中部有一輪葉，莖頂生一朵花，葉片的形狀、數(shù)目即使同種之間也各不相同。形態(tài)學標記研究深度和廣度不足，得到的數(shù)據(jù)往往不夠完善，數(shù)量性狀很難剔除環(huán)境的影響，因此從形態(tài)標記學的角度完全區(qū)分重樓屬的植物具有較大難度，需要配合其他鑒定方法加以鑒別。

2.2 顯微鑒別研究

大多數(shù)樣品單憑表型性狀難以鑒別，因此學者們開始進行顯微鑒別的研究。顯微鑒別研究主要是利用顯微鏡觀察樣本的組織構造、細胞形狀及其后含物的特征。顯微鑒別研究在許多中藥材質量鑒別、中醫(yī)臨床等有廣泛的應用，但在七葉一枝花種質資源研究中應用較少。張晨陽[25]對七葉一枝花和球藥隔重樓不同器官結構進行了觀察，觀察發(fā)現(xiàn)七葉一枝花的葉片為異面葉，根部表皮具有栓皮層。莖中心沒有髓腔，只具有初生結構。根部不具備周皮和次生組織結構，與單子葉植物營養(yǎng)器官結構相似。同時，七葉一枝花葉片的海綿組織較為松散，柵欄組織排列不夠緊密，萼片中的柵欄組織和海綿組織分化不明顯。符德歡等[26]利用顯微鏡觀察七葉一枝花根莖橫切面構造發(fā)現(xiàn)其表皮細胞排列不整齊，內皮層不明顯，完全不同于表皮細胞規(guī)則的長柱重樓，同時七葉一枝花根莖粉末的淀粉粒粒莖稍小、導管多見網(wǎng)紋，不同于滇重樓和毛重樓的根莖粉末，從而得到一種區(qū)分鑒別滇重樓、七葉一枝花、長柱重樓和毛重樓的方法。

顯微鑒別研究優(yōu)點眾多，如經(jīng)濟、簡便、快速、直觀、取樣少等，后續(xù)研究可以對七葉一枝花顯微鑒別更加細致且深入，如分別對其根莖結構、不定根結構、莖結構、葉結構，從而達到能夠通過顯微鑒別判斷七葉一枝花的真?zhèn)纹贰⒅貥菍俚牟煌兎N、純度等質量指標，提高其種質資源的質量和安全性。

2.3 分子標記研究

與傳統(tǒng)形態(tài)標記、顯微鑒別研究相比，DNA分子標記具有分布廣、多態(tài)性高、準確性高、操作快速簡便、不受外界環(huán)境影響、能夠更準確地揭示種間、種內差異等優(yōu)點。DNA分子標記法在藥材種質資源及其評價近緣品種遺傳多樣性有廣泛的應用，對選配育種親本、系統(tǒng)進化研究、品種分類鑒定、明確種間親緣關系等具有重要價值?，F(xiàn)已用于七葉一枝花鑒定的分子標記技術有DNA條形碼、簡單重復序列(SSR)分子標記、保守DNA衍生多態(tài)性(CDDP)分子標記、起始密碼子多態(tài)性(SCoT)分子標記等技術及HPLC指紋圖譜，其中DNA條形碼技術的應用較為廣泛。

周武先等[27]采用CDDP分子標記方法，對七葉一枝花等13份重樓屬種質資源進行分子編碼，構建的分子條形碼能夠靈敏、快捷的能夠鑒定重樓屬種質資源。張曉瑞等[28]利用DNA條形碼技術，對七葉一枝花等17份重樓屬樣本的ITS2(Internal Transcribed Spacers)序列進行擴增并預測結構，后續(xù)可通過ITS2結構對其他重樓屬樣本進行鑒別。過立農(nóng)等[29]采用ITS和ITS2 2個序列相結合的方法，可有效地將60批重樓屬樣品的基源進行鑒別。

通過這些分子標記技術的開發(fā)和應用，不僅為七葉一枝花種質資源的鑒定提供了新的、準確有效的方法，還可以進一步防止七葉一枝花藥材市場上出現(xiàn)混偽品的現(xiàn)象，不斷規(guī)范重樓藥材的市場環(huán)境。在未來的研究中，可利用全基因組測序技術，開發(fā)更多分子標記，并驗證其準確性。

3 七葉一枝花種質資源評價研究

對每一份種質資源科學甄別研判后，遴選可供利用的農(nóng)作物種質資源是一項長期基礎性工作，才能滿足選種育種創(chuàng)新要求，因此對種質資源進行評價從而選出優(yōu)質資源就顯得尤為重要，而目前針對七葉一枝花種質資源評價的研究相對較少。

周愛存等[30]測定了來自浙江不同種源地的12份七葉一枝花樣品中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量，以4種皂苷含量之和為評價指標，最終只篩選出一半的樣品可以作為優(yōu)質種源；蘇海蘭等[31]對多份七葉一枝花種質資源在福建地區(qū)的適應性、農(nóng)藝性狀、抗病性、重樓皂苷含量進行測定，并利用主成分分析法和權重評分法開展資源評價，最終篩選出6份資源作為適宜福建地區(qū)種植的優(yōu)質種質資源；劉斌[32]建立了重樓的高效液相色譜指紋圖譜，對鄂西北地區(qū)29批次不同產(chǎn)地重樓樣品質量進行比較評價，結果僅有8批次符合藥典規(guī)定；陳鐵柱等[33]收集21份不同產(chǎn)地的七葉一枝花資源進行重樓皂苷等成分的含量測定，分析得出不同產(chǎn)地七葉一枝花的主成分值存在較大差異，產(chǎn)地為巴中、青川、鹽津等地的七葉一枝花皂苷類成分更加穩(wěn)定。

各地區(qū)七葉一枝花種源混雜，資源質量評價不達標，易導致七葉一枝花藥材性狀多樣且差異巨大，最終混亂藥材市場。對七葉一枝花種質資源進行評價，并篩選優(yōu)質種質資源以及某地區(qū)內最宜種植七葉一枝花的區(qū)域，同時將優(yōu)質種源進行家化、規(guī)范化栽培研究具有重要意義。因此，在今后的研究中，可以加強與重要性狀基因緊密連鎖的功能性分子標記的系統(tǒng)研究，例如，調控產(chǎn)量性狀、抗病性狀、重樓皂苷等有效成分優(yōu)良性狀的功能基因，能夠促進鑒定評價一批優(yōu)異的七葉一枝花種質資源。

4 七葉一枝花種質資源研究展望

七葉一枝花作為我國瀕危珍稀藥用植物，應當在保護已知現(xiàn)有野生資源的基礎上，做好種質資源的調查、收集、鑒定、保存和應用等科學研究。未來針對七葉一枝花種質資源的深入研究可從以下三個方面開展：

第一，形態(tài)學研究大體上能將七葉一枝花與其他重樓屬種類加以區(qū)別，但仍有少數(shù)種或變種間的分離度較小，而且在惡劣的自然環(huán)境下生長的資源受到脅迫后表型性狀會有明顯變化，極易導致形態(tài)學鑒定不準確。因此，在今后的研究中，應深入推進七葉一枝花種質資源精準鑒定。依托優(yōu)勢科研院所、高等學校和企業(yè)，搭建一批種質資源精準鑒定平臺，構建全國統(tǒng)籌、科企合作的種質資源鑒定體系，并進一步地開展基因型和性狀精準鑒定，挖掘關鍵基因信息鑒定篩選出一批高產(chǎn)、優(yōu)質和抗逆性強的種質資源和基因資源，充分提升資源的可利用價值。

第二，后續(xù)研究中應避免單一性狀的評價，須結合藥材有效成分含量的分析，對現(xiàn)有種質資源進行綜合評價，以構建更完善的品質評價體系，保障七葉一枝花中藥材品質質量。在對種質資源進行綜合評價的基礎上，將發(fā)掘出的優(yōu)異種質用于種質創(chuàng)新，未來將種質資源優(yōu)勢轉變成育種優(yōu)勢。

第三，推動優(yōu)質種質資源的直接利用助力鄉(xiāng)村振興。通過發(fā)掘七葉一枝花綠色優(yōu)質、營養(yǎng)健康、便宜觀賞等特色資源，選育七葉一枝花優(yōu)質品種，既能夠滿足市場需要，又能夠促進鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)振興和生態(tài)振興。如選育觀賞形種質資源為欠發(fā)達地區(qū)提供了農(nóng)田景觀和旅游資源，選育適合特定貧困地區(qū)種植的優(yōu)質種質資源，促進當?shù)仄呷~一枝花特色產(chǎn)業(yè)的發(fā)展與壯大。