稻瘟病對常香粳1813產(chǎn)量和大米品質(zhì)的影響

陶菊紅，李亞娟，季向東，張 濤

(1.常熟市農(nóng)業(yè)科學研究所,江蘇 常熟 215500; 2.常熟理工學院端木銀熙水稻育種研究推廣中心,江蘇 常熟 215500; 3.常熟市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,江蘇 常熟 215500)

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，然而，水稻生產(chǎn)受到稻瘟病(rice blast)、紋章枯萎病(sheath blight)、白葉枯病(bacterial blight)和病毒性疾病等各種疾病的制約[1]，其中稻瘟菌引起的稻瘟病是影響水稻可持續(xù)生產(chǎn)最致命的疾病之一[2]。全世界超過85個國家發(fā)現(xiàn)有稻瘟病菌危害，每年因稻瘟病而造成了全球約30%的水稻產(chǎn)量損失，相當于可以養(yǎng)活6000萬人[3-4]。

稻瘟菌是一種子囊菌真菌，病變主要發(fā)生在葉領(lǐng)、莖稈、莖稈節(jié)、穗頸節(jié)，嚴重影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)[5-7]。對孟加拉國3個芳香水稻品種穗頸瘟感染的研究顯示籽粒不育率提高，籽粒大小和產(chǎn)量下降，而且種子產(chǎn)量和質(zhì)量的下降程度與感染病菌的嚴重程度呈正相關(guān)[8]。育種過程中，抗性水稻品種的選育和栽培是控制稻瘟病菌感染和穩(wěn)定產(chǎn)量最有效方法[9]，比如中國水稻研究所應(yīng)用分子標記輔助篩選技術(shù)將Pita、Pib和Pid2導入高感品種鹽豐47中，選育出高抗品種鹽粳144，其產(chǎn)量和外觀品質(zhì)明顯提高[10]。盡管稻瘟病菌感染會危害水稻產(chǎn)量已經(jīng)成為共識，且科學家們利用現(xiàn)代分子育種手段導入稻瘟病抗性基因改良優(yōu)良水稻種質(zhì)資源的經(jīng)驗逐漸成熟，但稻瘟病菌對大米品質(zhì)尤其是食味品質(zhì)的影響報道較少。

常香粳1813是優(yōu)良食味中熟晚粳，是常熟市農(nóng)業(yè)科學研究所2020年通過江蘇省審定品種，具有良好的應(yīng)用前景。本研究通過對常香粳1813基因組稻瘟病抗性基因鑒定，并對其孕穗期幼穗進行稻瘟病菌接種試驗，檢測成熟期種子千粒重、長寬比，以及大米加工品質(zhì)、食味品質(zhì)各參數(shù)變化情況，分析稻瘟病菌感染對種子生產(chǎn)和大米品質(zhì)的影響，進而為抗病育種和優(yōu)質(zhì)稻米品種的選育和推廣提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用的種質(zhì)材料為常香粳1813，是常熟市農(nóng)業(yè)科學研究所選育品種，對照組和試驗組于2022年種植于常熟市農(nóng)業(yè)科學研究所水稻育種創(chuàng)新基地，統(tǒng)一水肥管理。

1.2 試驗設(shè)計

為了研究稻瘟病菌感染后對種子產(chǎn)量和大米品質(zhì)的影響，對孕穗期的常香粳1813進行了稻瘟病菌(江蘇省內(nèi)稻瘟病菌優(yōu)勢小種的代表菌株混合液)接種試驗。接種后50 d，空白對照組種子成熟。收取試驗組(接種稻瘟病菌)和空白對照組葉片、稻穗進行觀察以及種子千粒重、長、寬等參數(shù)分析；隨后對試驗組和對照組谷粒進行了糙米、精米加工，對兩者糙米率、整精米率、堊白率、堊白度等相關(guān)參數(shù)進行了分析；最后檢測了試驗組和對照組大米的總蛋白、總脂肪、總淀粉和直鏈淀粉的含量，探索稻瘟病感染對常香粳1813大米食味的影響。

1.3 基因組測序和分析

用常香粳1813的幼苗進行了全基因組測序(安諾基因，北京)，開展了生物信息學分析，對其所有基因進行了組裝和基因注釋(烈冰生物，上海)。

1.4 稻瘟病菌接種和抗性水平評價

常香粳1813試驗組和對照組稻瘟病菌接種和抗性評價方法參考文獻[11]。

1.5 千粒重測定

谷粒千粒重、長、寬、長寬比均通過SC-G型考種及千粒重自動分析儀(萬深，杭州)進行測定，每個測定重復5組。

1.6 稻米品質(zhì)分析

利用大米外觀品質(zhì)檢測分析儀(萬深，杭州)分析大米的外觀品質(zhì)和加工品質(zhì)，包括長寬比、堊白粒率、堊白度、糙米率、精米率。糙米率和精米率的分析參照國家標準GB/T5495-2008《稻谷出糙率檢驗》和GB/T 21719-2008《稻谷整精米率檢驗法》。

1.7 稻米總蛋白含量測定

稱取精米粉沫(60目篩)試樣0.2 g左右，置于100 mL消煮管中(勿將樣品黏附在瓶頸上)。加入5 mL濃硫酸，輕輕搖勻并放置數(shù)小時。加入適量雙氧水，在管口放一彎頸小漏斗，在消煮爐上380℃消煮。1 h取下稍冷，加雙氧水 1 mL，重復2～3次，消煮到溶液呈無色或清亮后，再加熱5～10 min，以除盡剩余的雙氧水。將消煮管取下至冷卻，并用少量水沖洗彎頸漏斗，洗液流入消煮管。將消煮液無損的洗入50 mL容量瓶中，混勻待測。另外做3個空白。

蒸餾前配制好氫氧化鈉、硫酸標準液、混合指示劑，對定氮儀進行充分預(yù)熱，進行空蒸餾清洗管道，直至讀數(shù)穩(wěn)定。吸取上述待測液5.00 mL，注入凱氏定氮儀(沛歐，上海)蒸餾管中，參數(shù)設(shè)置后，對待測液進行測定。

樣品中蛋白質(zhì)含量可根據(jù)公式計算：

注：V1為滴定體積(mL)；V2為空白滴定體積(mL)；V3為消解定容體積(mL)；6.25為氮換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)；0.01為硫酸標準溶液濃度(mol·L-1)；0.01401為每毫克當量氮的克數(shù)；V4為取液體積(mL)；M為樣品質(zhì)量(g)。

1.8 稻米總脂肪含量測定

稱取精米粉末(60目篩)試樣2～5 g，準確至0.001 g，全部移入濾紙筒內(nèi)。將濾紙筒放入索氏抽提器(菲躍，杭州)的抽提筒內(nèi)，連接已干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入無水乙醚或石油醚至瓶內(nèi)容積的2/3處，于水浴上加熱，使無水乙醚或石油醚不斷回流抽提(6～8次·h-1)，一般抽提6～10 h。提取結(jié)束時，用磨砂玻璃棒接取1滴提取液，磨砂玻璃棒上無油斑表明提取完畢。稱量取下接收瓶，回收無水乙醚或石油醚，待接收瓶內(nèi)溶劑剩余1～2 mL時在水浴上蒸干，再于(100±5)℃干燥1 h，放干燥器內(nèi)冷卻0.5 h后稱量。重復以上操作直至恒重(直至兩次稱量的差不超過2 mg)。

樣品中粗脂肪含量可根據(jù)公式計算：

注：M1為烘干后總質(zhì)量(g)；M2為空瓶質(zhì)量(g)；M3為樣品質(zhì)量(g)。

1.9 稻米總淀粉含量測定

取干凈的15 mL離心管，稱約50 mg干樣(60目)，準確至0.001 g，加2 mL 80%乙醇，混勻，70℃放置2 h，其間渦旋混勻，取出冷卻至室溫。加2 mL去離子水，混勻，12000 r·min-1離心10 min，棄上清。加4 mL 80%乙醇，混勻，12000 r·min-1離心10 min，棄上清，重復2次。加入2 mL 2 mol·L-1氫氧化鉀，用手將離心管上下顛倒混勻，置于冰上搖20 min。加入8 mL 1.2 mol·L-1的醋酸鈉緩沖溶液(pH=3.8)，渦旋均勻。加入0.1 mL耐熱α-淀粉酶，再加入0.1 mL淀粉葡糖苷酶，渦旋均勻，置于50℃水浴鍋中，孵育30 min，其間間斷渦旋均勻。用蒸餾水將0.1 mL樣品稀釋至1 mL，取液體0.05 mL至新的EP管中，加入1.5 mL GOPOD試劑，渦旋混勻，于50℃下孵育20 min。同時取0.05 mL葡萄糖標準溶液，加入1.5 mL GOPOD試劑，50℃反應(yīng)20 min，510 nm處測定吸光度。

樣品中總淀粉含量可根據(jù)以下公式計算：

注：ΔA為樣品OD值減去空白OD值；F為葡萄糖的OD值；M為樣品質(zhì)量；90為換算系數(shù)。

1.10 稻米直鏈淀粉含量測定

取干凈的15 mL離心管，稱取適量樣本(約10 mg)。加入100 μL 95%酒精，900 μL NaOH溶液，渦旋混勻。沸水煮13 min，待冷卻后定容至10 mL，搖勻后靜置10 min。取干凈的15 mL離心管，依次加入0.5 mL上清，0.1 mL乙酸和0.2 mL碘化鉀溶液，定容至10 mL，室溫避光放置10 min，620 nm處測定吸光值。

標準曲線制定：稱取直鏈淀粉和支鏈淀粉標樣各10 mg，加入0.1 mL酒精和0.9 mL NaOH，沸水煮10 min，冷卻后定容至10 mL。按如下比例混勻(表1)，取混樣0.5 mL加入離心管，按測定方法同樣品一起測定。

表1 淀粉標準溶液配方

1.11 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用SigmaPlot 12.0分析，用GraphPad Prism 6.05進行統(tǒng)計學分析。不同組之間的顯著性差異用Student′st和one-way ANOVA檢驗。所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。P<0.05視作差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 常香粳1813稻瘟病抗性基因分析

根據(jù)序列比對結(jié)果和現(xiàn)有稻瘟病抗性基因功能位點報道，常香粳1813中Pid2(LOC_Os06g29810)、Pid3(LOC_Os06g22460)和Pib(LOC_Os02g57305)基因?qū)儆诘疚敛】剐曰?，而Bsr-d1(LOC_Os03g32230)、Pita(LOC_Os12g18360)、Pit(LOC_Os01g05620)、Pi21(LOC_Os04g32850)、Pi37(LOC_Os01g57310)、Pi36(LOC_Os08g05440)、Pita2(LOC_Os12g18729)、Pish(LOC_Os01g57340)則對稻瘟病菌無抗性。

2.2 稻瘟病菌感染后常香粳1813種子產(chǎn)量和質(zhì)量變化分析

由圖1可知，試驗組劍葉表面有明顯的褐色病斑，且葉片頂部干枯面積較對照組明顯大(圖1A)。試驗組稻穗頂部一些谷粒明顯干秕，而中下部灌漿的谷粒外稃表面有明顯的褐色斑點(圖1B和1C)。同時，對這些灌漿的谷粒進行了千粒重和長寬比分析，結(jié)果顯示試驗組和對照組谷粒的千粒重分別約為19.98 g和23.42 g，且顯著性分析顯示試驗組較對照組顯著下降；而兩者長寬比分別約為2.27和2.23，試驗組較對照組顯著上升(P<0.05)(圖2)。

注：(A)稻瘟病菌感染后葉片出現(xiàn)銹斑和干枯現(xiàn)象。(B)稻瘟病菌感染后稻穗頂部有明顯的秕谷，稻谷外稃有明顯的銹斑。箭頭指示秕谷。(C)稻瘟病菌感染后谷粒外觀比較。A和C中標尺為3.5 cm，B中標尺為3 cm

注：數(shù)據(jù)為平均值±標準差，n≥3，圖中不同小寫字母表示不同處理間差異達顯著水平(P<0.05)

2.3 稻瘟病菌感染后常香粳1813大米加工品質(zhì)分析

由圖3可知，和對照組比較，試驗組加工后的精米色澤稍發(fā)黃。由圖4可知，試驗組大米的出糙率和整精米率分別約為0.80和0.68，而對照組分別為0.84和0.70，顯著性分析試驗組出糙率和整精米率都顯著低于對照組；且同谷粒長寬比情況相似，試驗組大米長寬比同樣顯著高于對照組(P<0.05)。由圖5可知，試驗組和對照組加工整精米的堊白度分別約為5.51和2.14，且兩者差異顯著(P<0.05)，但兩者堊白率無顯著差別。

注：圖中標尺為3 cm。

注：數(shù)據(jù)為平均值±標準差，n≥3，圖中不同小寫字母表示不同處理間差異達顯著水平(P<0.05)

注：數(shù)據(jù)為平均值±標準差，n≥3，圖中不同小寫字母表示不同處理間差異達顯著水平(P<0.05)

2.4 稻瘟病菌感染后常香粳1813大米主要物質(zhì)含量發(fā)生變化

由圖6可知，常香粳1813試驗組和對照組總脂肪含量分別約為0.38%和0.80%(圖6A)，而兩者總蛋白含量分別約為88.11 g·kg-1和66.03 g·kg-1(圖6B)，總淀粉含量分別約為75.98%和80.76%(圖6C)，而兩者直鏈淀粉含量分別約為7.93%和9.15%(圖6C)，顯著性分析發(fā)現(xiàn)兩者這些參數(shù)差異均達顯著水平(P<0.05)。

注：數(shù)據(jù)為平均值±標準差，n≥3，圖中不同小寫字母表示不同處理間差異達顯著水平(P<0.05)

3 討論與結(jié)論

稻瘟病是最嚴重的水稻病害之一，由于稻瘟病菌的不穩(wěn)定性，全球水稻生產(chǎn)受到稻瘟病的威脅一直沒有解除[12]。利用經(jīng)典的植物育種技術(shù)，育種家已經(jīng)開發(fā)出了許多適應(yīng)全球不同水稻種植地區(qū)的抗稻瘟病品種。常香粳1813是適宜江蘇省沿江和蘇南稻區(qū)種植的香軟米水稻品種，根據(jù)試驗結(jié)果顯示，常香粳1813基因組含有Pid2、Pid3和Pib稻瘟病抗性基因。其中Pib基因?qū)|南亞稻瘟病菌小種具有廣譜抗性[13-14]，Pid2和Pid3則對特異性稻瘟病菌小種有抗性[15-17]。因此，常香粳1813基因組中多個稻瘟病抗性基因的存在，使常香粳1813對稻瘟病菌具備一定免疫抗性，并順利通過江蘇省品種審定。

水稻穗瘟對糧食生產(chǎn)造成的損失最為嚴重[18-19]。對常香粳1813孕穗期幼穗接種稻瘟病菌后，雖然常香粳1813表現(xiàn)出明顯的抗性，但其穗頂部仍有一小部分癟粒，且中下部谷粒外稃表面有明顯的褐色病斑，千粒重下降，谷粒長寬比上升，說明稻瘟病菌感染對其灌漿過程有明顯的影響，谷粒不夠飽滿。這進一步證實稻瘟病會造成種子產(chǎn)量和質(zhì)量的下降[8，20]。

本研究中，試驗組大米色澤變暗黃，出糙率和精米率顯著下降，而堊白度和長寬比顯著上升，說明常香粳1813感染稻瘟病菌后大米的加工品質(zhì)明顯下降。蛋白質(zhì)含量、淀粉含量和結(jié)構(gòu)有顯著的功能特征，能夠很好地指示大米食味性能[21]，本研究中試驗組大米的總蛋白含量顯著增加，總淀粉含量、直鏈淀粉含量和總脂肪含量卻都顯著減少。因為高口感值的大米往往具有較高的直鏈淀粉含量以及較低的蛋白質(zhì)含量[22]，所以這些結(jié)果說明稻瘟病菌的感染明顯影響了常香粳1813的食味品質(zhì)。而且大麥的研究也表明蛋白質(zhì)含量的增加與直鏈淀粉含量顯著負相關(guān)[21]，本試驗結(jié)果進一步驗證了該觀點。

本研究證明常香粳1813品種中存在多個抗病性基因，因此具備了對稻瘟病菌的一定抗性，但是稻瘟病菌感染對軟香米常香粳1813的種子、大米產(chǎn)量和品質(zhì)還有顯著的影響，因此優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病品種的選育需要結(jié)合分子標記、產(chǎn)量、品質(zhì)相關(guān)指標參數(shù)的結(jié)合驗證，這也是今后育種過程中需要關(guān)注的方面。