基于NLRP3 炎癥小體探討三石湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制研究

樸勇洙，齊明明，聶雙蓮，潘國(guó)雄，張 皓，王欣波

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（gouty arthritis，GA）是由嘌呤代謝異常、血尿酸體內(nèi)堆積所引起的炎癥性病變，其臨床表現(xiàn)以腳趾、踝、膝等關(guān)節(jié)及周圍組織紅腫熱痛為主。作為一種常見的關(guān)節(jié)炎癥性病變，GA 在我國(guó)的發(fā)病率正在逐年增高，并呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)［1，2］。該病在男性中的發(fā)病率要高于女性，不同的生活環(huán)境能導(dǎo)致發(fā)病率出現(xiàn)浮動(dòng)［3］。

血尿酸在體內(nèi)過度堆積出現(xiàn)過飽和狀態(tài)導(dǎo)致了尿酸鈉（MSU）結(jié)晶的析出，后者在關(guān)節(jié)組織中的沉積會(huì)通過多種信號(hào)通路的異常激活，刺激白細(xì)胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）和IL-18 等炎癥因子異常分泌，進(jìn)而促使GA 中的炎癥形成［4，5］。NLRP3炎癥小體為NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、適 配 蛋 白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）與含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-1）組成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，在MSU 的刺激下NLRP3 炎癥小體激活，并通過活化的Caspase-1 切割Pro-IL-1β，從而導(dǎo)致IL-1β 的成熟和分泌，進(jìn)而產(chǎn)生炎癥聯(lián)機(jī)反應(yīng)［6，7］。三石湯出自《溫病條辨》：“暑濕蔓延三焦…三石湯主之”，具有清熱利濕，宣統(tǒng)三焦的功效。本研究通過佛波酯誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞，以MSU 誘導(dǎo)建立NLRP3 活化模型，通過觀察巨噬細(xì)胞中P2X7R/PKR 信號(hào)通路的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，通過巨噬細(xì)胞-滑膜細(xì)胞共培養(yǎng)體系，從而闡明三石湯治療GA 的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

40 只雄性SD 大鼠7 周齡，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（黑）2018-007）提供并飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫20～25 ℃，循環(huán)光照，自由飲水。

THP-1（人單核細(xì)胞白血病）和MH7A（人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維滑膜細(xì)胞）細(xì)胞株購(gòu)買于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

三石湯（滑石30 g、生石膏30 g、寒水石15 g、杏仁15 g、竹茹15 g、銀花15 g、白通草10 g）購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院草藥局，制備為濃縮液備用。佛波酯購(gòu)于愛必信上海生物科技有限公司（貨號(hào)abs9107）；MSU 購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司（貨號(hào)U2875）；P2X7R 抑制劑（AZ10606120 dihydrochloride）購(gòu) 于 美 國(guó) MedChemExpress 公 司（ 貨 號(hào)HY-108669）；RPMI-1640 培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司（貨號(hào)C11875500BT）；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、CCK8 測(cè)定試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-PX）均購(gòu)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司（貨號(hào)20111016R、20111011R、MM-70349 R1 與 20111008R）；NLRP3、IL-18、IL-1β、Caspase-1、GSDMD、P2X7R、PKR 一抗購(gòu)買于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：68102-1-Ig、60070-1-Ig、66737-1-Ig、81482-1-RR、66387-1-Ig、28207-1-AP、66646-1-Ig）；p-PKR 和HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗購(gòu)買于美國(guó)Abcam 公司（貨號(hào)：ab32036和ab150113）。Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞活性氧檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)分別為C1062S 和S0033M）。酶標(biāo)儀、電泳槽和電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司（型號(hào) 分 別 為PR4100、Mini-PROTEAN Tetra 和PowerPac HC）；流式細(xì)胞儀購(gòu)自上海聚慕醫(yī)療器械有限公司（型號(hào)為Wmini52）；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司（型號(hào)為HERACELL150i）。

1.3 方法

1.3.1 含藥血清制備 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求在飼養(yǎng)一周后以10 只一組的規(guī)格將大鼠分為空白組和三石湯低、中、高劑量組。三石湯濃縮液規(guī)格為26.16 g/kg、52.32 g/kg 和104.64 g/kg 每次1 mL?？瞻捉M給予等體積生理鹽水治療。每日1 次，為期1 周。治療后以腹腔注射的方式麻醉大鼠，并于腹主動(dòng)脈取血。3 500 r/min 離心10 min 后收集血清，水浴滅活30 min 后，濾膜過濾后備用。

1.3.2 細(xì)胞誘導(dǎo)分化 THP-1 以RPMI-1640 培養(yǎng)液（含有10%FBS、1%青-鏈霉素雙抗和β-巰基乙醇）進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱設(shè)置：37 ℃、含5%CO2、2～3 d換液1 次。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6 孔板（1×106個(gè)/mL），并 加 入 佛 波 酯（160 nmol/L）誘 導(dǎo)THP-1 向巨噬細(xì)胞分化，以細(xì)胞貼壁狀態(tài)提示分化成功。

1.3.3 細(xì)胞分組與藥物干預(yù) 將1.3.2 中巨噬細(xì)胞以2.5×105個(gè)/mL 的密度接種于6 孔板，每孔900 μL。根據(jù)方案分組并進(jìn)行藥物干預(yù)。（1）空白組：900 μL 培養(yǎng)基+100 μL 空白血清；（2）模型組：900 μL 培養(yǎng)基+100 μL 空白血清+MSU 400 μmol/L；（3）三 石 湯 低 劑 量 組：900 μL 培 養(yǎng) 基+MSU 400 μmol/L+100 μL 含藥血清（26.16 g/kg）；（4）三石湯中劑量組：900 μL 培養(yǎng)基+MSU 400 μmol/L+100 μL 含藥血清（52.32 g/kg）；（5）三石湯高劑量組：900 μL 培養(yǎng)基+MSU 400 μmol/L+100 μL 含藥血清（104.64 g/kg）；（6）抑 制 劑 組：900 μL 培 養(yǎng) 基+100 μL 空 白 血 清+ AZ10606120 dihydrochloride 10 mmol/L。

1.3.4 細(xì)胞共培養(yǎng)體系 滑膜細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)（含20%FBS、1%雙抗）傳代培養(yǎng)，并置于CO2濃度為5%和37 ℃孵育箱中進(jìn)行孵育。接著以1×105/mL 的密度將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的滑膜細(xì)胞置于Transwell 小室的上層，并隨后將Transwell 小室置于6 孔板內(nèi)，與上述的各組的巨噬細(xì)胞構(gòu)建共培養(yǎng)體系。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 于48 h 后收集1.3.3 中各組巨噬細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入PBS 重 懸 后1 000 r/min 離 心5 min，PBS 洗 滌2 次，棄上清液，留100 μL 細(xì)胞于離心管內(nèi)，混勻，置于冰上，以DCFH-DA 為熒光探針，上機(jī)檢測(cè)。

分離滑膜細(xì)胞并以PBS 進(jìn)行洗滌，隨后收集沉淀并添加100 μL 的Binding buffer 將細(xì)胞進(jìn)行懸浮處理，分別向細(xì)胞懸液中加入Annexin V-FITC（5 μL）及PI（1 μL）于避光環(huán)境下孵育15 min 后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。以Annexin V-FITC 陽性表示細(xì)胞凋亡早期階段，以Annexin V-FITC 和PI 雙陽性表示細(xì)胞凋亡晚期階段，以二者之和表示細(xì)胞的凋亡水平。

1.3.6 Western blot 檢測(cè) 于48 h 后 收集1.3.3 中各組巨噬細(xì)胞，加入適當(dāng)?shù)腞IPA 于冰上進(jìn)行細(xì)胞裂解。隨后以2 000 r/min 的速度離心15 min 后取上清液。BCA 法檢測(cè)蛋白的濃度。取25 μg 的蛋白上樣，采用SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜至PVDF，用5%脫脂牛奶在室溫下封閉處理1 h。加入稀釋后的一抗：NLRP3、IL-1β、IL-18、Caspase-1、GSDMD、P2X7R、PKR、p-PKR、PKR 和β-actin，4 ℃孵育過夜后加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗，常溫下繼續(xù)孵育2 h，利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，研究以β-actin 作為內(nèi)參，以計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.7 CCK8 檢測(cè)化膜細(xì)胞活性 滑膜細(xì)胞接種于96 孔板，待細(xì)胞貼壁根據(jù)不同組別給予相應(yīng)藥物處理，設(shè) 置6 個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h，加入CCK8 孵育2 h，于450 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 軟件（版本26.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間數(shù)據(jù)的比較采用ANOVA 進(jìn)行，組間兩兩數(shù)據(jù)的的對(duì)比采用LSD 進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三石湯對(duì)巨噬細(xì)胞ROS 水平的影響

如圖1 和表1 中所示，模型組巨噬細(xì)胞ROS 水平與空白組相比較顯著的增加，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而三石湯低劑量、中劑量、高劑量和抑制劑組巨噬細(xì)胞ROS 的水平與模型組相比較顯著的降低，差異比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 各組巨噬細(xì)胞ROS 水平的比較（n=3，±s，%）Tab 1 Comparison of ROS levels of macrophages in each group（n=3，±s，%）

表1 各組巨噬細(xì)胞ROS 水平的比較（n=3，±s，%）Tab 1 Comparison of ROS levels of macrophages in each group（n=3，±s，%）

注：與空白組相對(duì)比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相對(duì)比，●P＜0.05，●●P＜0.01。

ROS 9.27±0.47 33.87±1.59**28.43±1.21●●18.63±0.76●●13.57±0.81●●14.40±0.62●●278.928 0.000組別空白組模型組三石湯低劑量組三石湯中劑量組三石湯高劑量組抑制劑組FP

2.2 三石湯對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

如表2 所見，與空白組相比，模型組巨噬細(xì)胞SOD 和GSH-PX 的 活 性 顯 著 降 低，MDA 的 含 量 顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，三石湯低劑量、中劑量、高劑量和抑制劑組巨噬細(xì)胞SOD 和GSH-PX 的活性顯著增加，MDA的含量顯著的降低，差異比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義（P＜0.05 和P＜0.01）。

表2 各組巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較（n=3，±s）Tab 2 Comparison of oxidative stress indicators of macrophages in each group（n=3，±s）

表2 各組巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較（n=3，±s）Tab 2 Comparison of oxidative stress indicators of macrophages in each group（n=3，±s）

注：與空白組相對(duì)比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相對(duì)比，●P＜0.05，●●P＜0.01。

組別空白組模型組三石湯低劑量組三石湯中劑量組三石湯高劑量組抑制劑組SOD（U/mL）300.15±9.53 MDA（mmol/mL）39.83±3.15 GSH-PX（U/mL）678.21±44.70 215.52±13.57**88.06±3.86**247.05±13.17**259.99±10.07●60.58±2.86●●331.66±16.19●●287.68±9.93●●53.98±3.99●●452.91±12.91●●335.01±33.88●●44.97±3.47●●575.58±19.77●●563.97±19.69●●140.990 0.000 FP 348.31±31.36●●16.541 0.000 43.34±3.93●●75.023 0.000

2.3 三石湯對(duì)巨噬細(xì)胞NLRP3 炎癥小體的影響

如圖2 所示，與空白組相比，模型組巨噬細(xì)胞NLRP3、Mature IL-1β、Pro IL-1β、Mature IL-18、Pro IL-18、Mature Caspase-1 和GSDMD-NT 蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，GSDMD-FL 蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而巨噬細(xì)胞中Pro-Caspase-1 蛋白的表達(dá)則無明顯改變，組間相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。三石湯低劑量、中劑量、高劑量和抑制劑組巨噬細(xì)胞NLRP3、Mature IL-1β、Pro IL-1β、Mature IL-18、Pro IL-18、Mature Caspase-1 和GSDMD-NT 蛋白的表達(dá)水平與模型組相比較顯著下調(diào)，GSDMD-FL 蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而巨噬細(xì)胞中Pro-Caspase-1 蛋白的表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3 和表4。

表3 各組巨噬細(xì)胞NLRP3、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)的比較（n=3，±s）Tab 3 NLRP3 and IL-1 of macrophages in each group β Comparison with IL-18 protein expression（n=3，±s）

表3 各組巨噬細(xì)胞NLRP3、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)的比較（n=3，±s）Tab 3 NLRP3 and IL-1 of macrophages in each group β Comparison with IL-18 protein expression（n=3，±s）

注：與空白組相對(duì)比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相對(duì)比，●P＜0.05，●●P＜0.01。

組別空白組模型組三石湯低劑量組三石湯中劑量組三石湯高劑量組抑制劑組NLRP3/β-actin 0.18±0.04 Mature IL-1β/β-actin 0.05±0.01 Mature IL-18/β-actin 0.02±0.01 Pro IL-18/β-actin 0.08±0.01 0.93±0.04**0.70±0.07**Pro IL-1β/β-actin 0.05±0.02 0.98±0.12*0.76±0.15**0.93±0.07**0.67±0.07●●0.51±0.03●●0.69±0.18●●0.37±0.04●●0.66±0.14●●0.33±0.07●●0.37±0.08●●0.48±0.10●●0.22±0.09●●0.38±0.09●●0.20±0.04●●0.34±0.04●●0.46±0.13●●0.09±0.01●●0.11±0.03●●0.15±0.02●●73.760 0.000 FP 0.17±0.01●●122.841 0.000 0.33±0.04●●52.349 0.000 0.38±0.04●●23.267 0.000 0.07±0.02●●42.359 0.000

表4 各組巨噬細(xì)胞Caspase-1 和GSDMD 蛋白表達(dá)的比較（n=3，±s）Tab 4 Comparison of Caspase-1 and GSDMD protein expression in macrophages of each group（n=3，±s）

表4 各組巨噬細(xì)胞Caspase-1 和GSDMD 蛋白表達(dá)的比較（n=3，±s）Tab 4 Comparison of Caspase-1 and GSDMD protein expression in macrophages of each group（n=3，±s）

注：與空白組相對(duì)比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相對(duì)比，●P＜0.05，●●P＜0.01。

組別Mature Caspase-1/Pro-Caspase-1 GSDMD-NT/β-actin GSDMD-FL/β-actin 0.99±0.07 0.11±0.01**0.38±0.04●●0.51±0.10●●0.90±0.04●●0.91±0.04●●111.320 0.000空白組模型組三石湯低劑量組三石湯中劑量組三石湯高劑量組抑制劑組FP 0.06±0.03 0.96±0.04**0.74±0.08●●0.29±0.05●●0.09±0.04●●0.11±0.04●●182.648 0.000 0.01±0.01 0.80±0.15**0.52±0.06●0.26±0.09●●0.13±0.04●●0.10±0.02●●43.512 0.000

2.4 三石湯對(duì)巨噬細(xì)胞P2X7R/PKR 信號(hào)通路的影響

如圖3 和表5 所示，與空白組相比，模型組巨噬細(xì)胞P2X7R 和p-PKR 蛋白的表達(dá)顯著的上調(diào)，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而巨噬細(xì)胞中Total-PKR 蛋白的表達(dá)則無明顯的改變，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。三石湯低劑量、中劑量、高劑量和抑制劑組巨噬細(xì)胞P2X7R 和p-PKR 蛋白的表達(dá)水平與模型組相比較顯著下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 和P＜0.01），而巨噬細(xì)胞中Total-PKR 蛋白的表達(dá)無明顯的變化，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各組巨噬細(xì)胞P2X7R/PKR 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較Fig 3 Comparison of the expression levels of P2X7R/PKR signaling pathway related proteins in macrophages of each group

表5 各組巨噬細(xì)胞P2X7R/PKR 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（n=3，±s）Tab 5 Comparison of expression levels of P2X7R/PKR signaling pathway related proteins in macrophages of each group（n=3，±s）

表5 各組巨噬細(xì)胞P2X7R/PKR 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（n=3，±s）Tab 5 Comparison of expression levels of P2X7R/PKR signaling pathway related proteins in macrophages of each group（n=3，±s）

注：與空白組相對(duì)比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相對(duì)比，●P＜0.05，●●P＜0.01。

組別空白組模型組三石湯低劑量組三石湯中劑量組三石湯高劑量組抑制劑組P2X7R/β-actin 0.16±0.07 p-PKR/Total-PKR 0.06±0.01 0.81±0.09**0.82±0.09**0.62±0.09●0.53±0.07●●0.39±0.06●●0.38±0.09●●0.30±0.07●●0.09±0.02●●0.11±0.02●●77.406 0.000 FP 0.33±0.10●●24.224 0.000

2.5 三石湯對(duì)滑膜細(xì)胞活性的影響

如表6 所示，模型組滑膜細(xì)胞的活性與空白組相對(duì)比顯著的降低，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。三石湯中劑量、高劑量及抑制劑組滑膜細(xì)胞的活性與模型組相比較顯著的增加，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 和P＜0.01）。

表6 各組滑膜細(xì)胞活性和凋亡水平的比較（n=3，±s）Tab 6 Comparison of activity and apoptosis levels of Synovial cell in each group（n=3，±s）

表6 各組滑膜細(xì)胞活性和凋亡水平的比較（n=3，±s）Tab 6 Comparison of activity and apoptosis levels of Synovial cell in each group（n=3，±s）

注：與空白組相對(duì)比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相對(duì)比，●P＜0.05，●●P＜0.01。

凋亡（%）7.19±0.28 18.62±3.18**16.11±1.76 13.56±0.90●●9.92±0.52●●10.91±0.85●●21.157 0.000分組空白組模型組三石湯低劑量組三石湯中劑量組三石湯高劑量組抑制劑組FP細(xì)胞活性（OD）0.69±0.16 0.32±0.03**0.46±0.05 0.55±0.14●0.63±0.08●●0.63±0.09●●5.456 0.008

2.6 三石湯對(duì)滑膜細(xì)胞凋亡的影響

如圖4 和表6 所示，模型組滑膜細(xì)胞的凋亡水平與空白組相比較顯著的增加，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。三石湯中劑量、高劑量和抑制劑組滑膜細(xì)胞的凋亡水平與模型組相比顯著的降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05和P＜0.01）。

圖4 各組滑膜細(xì)胞凋亡水平的比較Fig 4 Comparison of apoptosis levels of synovial cells in each group

3 討論

氧化應(yīng)激是一種由外界刺激導(dǎo)致的機(jī)體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）及內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)之間失衡，使細(xì)胞受到的氧化損傷超過其承受范圍而使機(jī)體出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)。ROS 是一類高度活性的氧化分子，在常態(tài)下具有抵抗病原體侵害和傳遞細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的作用。病態(tài)下，ROS 生成增加并且機(jī)體對(duì)ROS 的清除能力減弱，導(dǎo)致氧化應(yīng)激加 劇，損 害 細(xì) 胞 的 結(jié) 構(gòu) 和 功 能［7］。MDA、SOD 和GSH-PX 是評(píng)估機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志性指標(biāo)［8］。MDA 是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，可反饋氧 化 應(yīng) 激 和 細(xì) 胞 損 傷 程 度［9］。SOD 和GSH-PX 是抗氧化酶指標(biāo)，能夠清除氧自由基和其他氧化物，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，其水平越高標(biāo)示細(xì)胞具有較好的抗氧化能力，反之則表示細(xì)胞對(duì)氧自由基的清除能力越差［8］。研究證明氧化應(yīng)激是導(dǎo)致GA 發(fā)生的重要愿意之一，中醫(yī)藥能夠通過抑制氧化應(yīng)激水平達(dá)到治療GA 的的效果［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，MSU 誘導(dǎo)能夠提高巨噬細(xì)胞ROS 水平和MDA的含量，并抑制巨噬細(xì)胞SOD 和GSH-PX 的活性。三石湯呈劑量依賴式降低巨噬細(xì)胞ROS 水平和MDA 的 含 量，并 提 升 巨 噬 細(xì) 胞SOD 和GSH-PX 的活性。

孤立MSU 的并不能引發(fā)GA，需要激活NLRP3 炎癥小體進(jìn)而引起GA 中炎癥的產(chǎn)生［11］。NLRP3 炎癥小體是一種細(xì)胞內(nèi)的多蛋白復(fù)合體，與包括GA 在內(nèi)的多種炎癥性疾病相關(guān)［12，13］。其組成包括NLRP3、ASC 和Pro-Caspase-1 三部分。MSU 可刺激NLRP3 誘導(dǎo)蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成，促進(jìn)前體Caspase-1 自身割活化，活化后的Caspase-1 對(duì)胞漿中pro-IL-1β 和pro-IL-18 進(jìn)行剪切，使其轉(zhuǎn)化為活性 形 式 的IL-1β 和IL-18［14，15］。Caspase-1 還 能 切 割活化GSDMD 蛋白，促使細(xì)胞膜通道生成和IL-1β和IL-18 外排，最終導(dǎo)致細(xì)胞炎癥性死亡［16］。在NLRP3 炎癥小體激活的過程中，ASC 作為連接蛋白不僅連接了受體蛋白和Caspase-1 反應(yīng)器，其C 端還能夠亮氨酸序列可識(shí)別包括MSU 在內(nèi)的多種內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)［17］。本研究結(jié)果顯示，MSU 誘導(dǎo)能夠上 調(diào) 巨 噬 細(xì) 胞NLRP3、Mature IL-1β、Pro IL-1β、Mature IL-18、Pro IL-18、Mature Caspase-1 和GSDMD-NT 蛋白的表達(dá)水平，下調(diào)GSDMD-FL 蛋白的表達(dá)水平。三石湯呈劑量依賴式抑制巨噬細(xì)胞NLRP3、Mature IL-1β、Pro IL-1β、Mature IL-18、Pro IL-18、Mature Caspase-1 和GSDMD-NT 蛋白的表達(dá)水平，上調(diào)GSDMD-FL 蛋白的表達(dá)水平，從而抑制NLRP3 炎癥小體的活化。

P2X7R 是一種ATP 感受性離子通道受體，在炎癥性疾病發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用［18］。P2X7R 與ATP 結(jié)合后能夠?qū)е翹a+和Ca2+的內(nèi)流和K+的外流，從而誘導(dǎo)NLRP3 炎癥小體中的NLRP3、ASC 及Caspase-1 的活化，并引起血清炎癥因子（如IL-1β 和IL-18 等）的釋放，導(dǎo)致靶器官的損傷［19］。有研究證明中醫(yī)藥能夠通過抑制P2X7R 介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路，達(dá)到改善GA 大鼠關(guān)節(jié)指征的效果［20］。PKR 是一種RNA 蛋白酶，可通過磷酸化達(dá)到激活狀態(tài)從而參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖和凋亡等過程。研究顯示P2X7R 可通過調(diào)節(jié)PKR 磷酸化來影響NLRP3 炎癥小體活性，而抑制PKR 磷酸化水平也可實(shí)現(xiàn)明顯降低NLRP3 表達(dá)的效 果［21，22］。本 研 究 中MSU 誘 導(dǎo) 上 調(diào) 了 巨 噬 細(xì) 胞P2X7R 和p-PKR 蛋白的表達(dá)，而三石湯含藥血清呈劑量依賴式抑制巨噬細(xì)胞P2X7R 和p-PKR 蛋白的表達(dá)，其中高劑量三石湯效果與抑制劑效果相當(dāng)。

滑膜細(xì)胞是關(guān)節(jié)滑膜中的主要細(xì)胞類型，在GA 的發(fā)病中具有重要的意義。研究證明，MSU 誘導(dǎo)能夠上調(diào)滑膜細(xì)胞中NLRP3 炎癥小體的表達(dá)及相關(guān)炎癥因子的釋放，進(jìn)而促使了炎癥反應(yīng)的發(fā)生［23］。另有研究證明中藥可通過抑制滑膜組織炎癥反應(yīng)及凋亡達(dá)到治療GA 的效果［24］。本研究結(jié)果顯示MSU 可通過巨噬細(xì)胞降低滑膜細(xì)胞活性，并促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡。三石湯含藥血清呈劑量依賴式增加滑膜細(xì)胞活性并抑制滑膜細(xì)胞凋亡，其中高劑量三石湯效果與抑制劑效果相當(dāng)。

三石湯由飛滑石、生石膏、寒水石、杏仁、竹茹、銀花、白通草等組成，具有祛邪通竅并除三焦?jié)駸峋奂墓π?。方中滑石甘寒、清上利下，除熱祛濕，和表里而利陰陽，以為君藥。生石膏，寒水石皆取其寒，助君清熱利竅，又能解肌止渴。銀花清熱解毒亦助君之用。此三者用之為臣。杏仁宣上焦肺氣，助氣化以除濕。竹茹清瀉中焦，促邪從出行于下竅。此二者用之為佐。白通草上通下達(dá)，通行藥力，又能導(dǎo)熱排濕于下竅，用之為使。

綜上所述，NLRP3 炎癥小體在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中具有重要地位，而三石湯可通過P2X7R/PKR 信號(hào)通路從而抑制NLRP3 炎癥小體激活，從而抑制滑膜細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療GA 的效果。

作者貢獻(xiàn)度說明：

樸勇洙：為本課題總負(fù)責(zé)；王欣波：為全部實(shí)驗(yàn)過程協(xié)調(diào)人員；齊明明： 文獻(xiàn)檢索；聶雙蓮：后期數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析工作；潘國(guó)雄，張皓：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。