基于Notch1 信號通路調(diào)控巨噬細(xì)胞極化改善佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥的機(jī)制

程 靜，萬 磊，趙 磊，李 舒，李方澤，胡賽賽，陳瑩瑩

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科，安徽 合肥 230031）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種由免疫系統(tǒng)對其自身關(guān)節(jié)組織的異常攻擊引起的系統(tǒng)性自身免疫性疾病［1］。RA 患者的滑膜組織增殖并增厚，有許多浸潤性炎癥細(xì)胞。聚集的免疫細(xì)胞通過促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞的增殖和激活破骨細(xì)胞直接參與滑膜炎的發(fā)展［2］。RA 滑膜中大多數(shù)免疫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞，是產(chǎn)生參與RA 病理發(fā)展的主要促炎細(xì)胞因子［3］。國內(nèi)外研究表明，巨噬細(xì)胞（Mφ）可以被分化為M1 和M2，M1 型Mφ 以CD80+和CD86+為代表，M2 型Mφ 以CD206+和CD163+為代表。M1 型巨噬細(xì)胞可通過釋放白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-a（TNF-a）等促炎因子參與RA 發(fā)生發(fā)展，M2 型Mφ 釋放IL-4、IL-10、IL-13 等抑炎因子減輕炎癥［4，5］。

研究表明，Notch 是調(diào)控巨噬細(xì)胞功能的重要分子?；罨疦otch 信號可調(diào)控Mφ 向M1 型極化，發(fā)揮促炎效應(yīng)；阻斷Notch 信號可誘導(dǎo)Mφ 向M2 型極化，發(fā)揮抗炎效應(yīng)［6］。Notch 信號通路的表達(dá)和活化能夠刺激滑膜細(xì)胞，從而促進(jìn) RA 中促炎因子的產(chǎn)生［7］。前期課題組動物實(shí)驗研究表明，Notch 信號的活化可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的M1 型極化，從而促進(jìn)佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）的發(fā)生［8］。本研究通過復(fù)制AA 大鼠模型，探究Notch1 信號通路在AA 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）、足趾腫脹度、血清中細(xì)胞因子（IL-4、IL-1β、IL-10、TNF-α）及M1/M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究Notch1/Jagged1/RBP-Jκ/Hes1 信 號 軸 在AA 大 鼠 滑 膜M1/M2 型 巨噬細(xì)胞極化中的作用及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

18 只清潔級SD 雄性大鼠，體重（195±15）g。動物購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心。本研究遵循安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗動物倫理委員會的規(guī)定，動物倫理編號AHUCM-rats-2021022。

1.2 主要試劑和儀器

弗氏完全佐劑（美國Sigma公司，貨號MB9887）；白 細(xì) 胞 介 素-4（interleukin-4，IL-4） 、IL-10、IL-1β、TGF-α 試劑盒（武漢基因美公司，貨號：JYM0651 Ra、JYM0297Ra、JYM0636Ra、JYM0612Ra）；兔Notch1、Jagged1、Hes-1 抗體：均購自abcam，貨號分別 為：ab53457，ab108293，ab120934；兔RBP-Jκ 抗體：bioss，貨 號：bs-3906R。Notch1 通 路 抑 制 劑（FLI-06）：上海藍(lán)木化工有限公司，貨號：S8894。流式細(xì)胞儀（貝克曼公司）；倒置顯微鏡（OLYMPUS 公司）；離心機(jī)（上海和欣科教設(shè)備有限公司）；電泳儀、電泳槽（上海天能科技有限公司）。

1.3 分組、造模及給藥

將18 只大鼠按隨機(jī)對照表分為3 組，即健康組、模型組和Notch1 抑制劑組，每組6 只。MC 和FLI 大 鼠 構(gòu) 建AA 大 鼠 模 型［9］。2 周 后 開 始 給 藥，Notch1 抑制劑組：制成0.224 mg/mL 混合液，0.056 mg/0.25 mL/100 g 尾靜脈注射，隔天1 次；健康組及模型組：生理鹽水2 mL/只灌胃1 次/d。給藥30 d。

1.4 關(guān)節(jié)炎癥癥狀的測定

在造模前1 天、致炎后第30 天測量每組SD 大鼠的右后足關(guān)節(jié)容積，計算各組大鼠右后足關(guān)節(jié)腫脹度（E）［10］。致炎后第30 天開始觀察，對其進(jìn)行全身性的觀察，并計算AI。AI 評分正常為0 分，1 處關(guān)節(jié)腫脹為1 分，2 處關(guān)節(jié)腫脹為2 分，2 處以上關(guān)節(jié)腫脹為3 分，全部肢體有腫脹為4 分。

1.5 流式細(xì)胞儀測定巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物

大鼠新鮮血液100 μL，加入抗鼠CD80-PE 0.25 μg、CD163-AF647 0.25 μg。根據(jù)操作手冊流式細(xì)胞儀檢測CD80+、CD163+細(xì)胞表達(dá)。

1.6 ELISA 方法測定炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)

從腹主動脈采血，按照 ELISA 說明書操作，檢測炎癥細(xì)胞因子的 OD 值，繪制IL-4、IL-1β、IL-10、TNF-α 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線，計 算 出 大 鼠 血 清IL-4、IL-1β、IL-10、TNF-α 濃度。

1.7 Western Blot 測定相關(guān)蛋白表達(dá)水平

用蛋白提取試劑盒提取滑膜總蛋白，電泳分離，采用半干法轉(zhuǎn)膜使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至膜上，用室溫5%的脫脂奶粉封閉膜2 h。免疫反應(yīng)：室溫下，將Notch1、Jagged1、Hes1、RBP-Jκ 抗體1/2 000稀釋后，和膜一起孵育2 h， 化學(xué)發(fā)光法顯色并拍照。計算各組Notch1、Jagged1、Hes1、RBP-Jκ 條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參β-actin 灰度值的比值做為滑膜Notch1、Jagged1、Hes1、RBP-Jκ 蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 27.0 統(tǒng)計軟件，Correlation Analysis法檢測相關(guān)性，ANOVA 法檢測方差分析，獨(dú)立樣本t檢驗兩組間的對比，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Notch1 抑制劑對AA 大鼠E 及AI 的影響

模型組 AA 大鼠的E 及AI 均較健康組明顯增高（P＜0.01）；Notch1 抑制劑組的E 及AI 均較模型組明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠E、AI 比較（n=6， ±s）Tab 1 Comparison of E and AI in each group of rats（n=6，±s）

表1 各組大鼠E、AI 比較（n=6， ±s）Tab 1 Comparison of E and AI in each group of rats（n=6，±s）

注：對 比NC 組，△△P＜0.01；對 比MC 組，▲P＜0.05,▲▲P＜0.01。

關(guān)節(jié)炎指數(shù)（分）0.00±0.00 6.85±1.69△△4.97±0.75▲組別NC MC FLI右后足關(guān)節(jié)腫脹度（%）44.74±11.92 80.26±17.53△△47.30±17.59▲▲

2.2 Notch1 抑制劑對AA 大鼠M1、M2 表面標(biāo)志物的影響

MC 組 AA 大鼠CD80+細(xì)胞的表達(dá)量較 NC組顯著增加，而CD163+細(xì)胞的表達(dá)量較 NC 組顯著減少（P＜0.01）；Notch1 抑制劑組，CD80+細(xì)胞的表達(dá)量顯著低于MC 組，CD163+細(xì)胞的表達(dá)量顯著高于MC 組（P＜0.01）。見表2，圖1、2。

圖1 各組CD80+流式細(xì)胞圖Fig 1 CD80 + flow cytometry of each group

圖2 各組CD163+流式細(xì)胞圖Fig 2 CD163+ flow cytometry of each group

表2 各組巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物的比較（n=6， ±s）Tab 2 Comparison of macrophage polarization markers in different groups（n=6， ±s）

表2 各組巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物的比較（n=6， ±s）Tab 2 Comparison of macrophage polarization markers in different groups（n=6， ±s）

注：對比NC 組，△△P＜0.01；對比MC 組，▲▲P＜0.01。

組別NC MC CD80 0.92±0.15 4.10±0.49△△CD163 5.49±0.39 1.19±0.37△△3.60±0.47▲▲FLI 2.04±0.21▲▲

2.3 Notch1 抑制劑對AA 大鼠IL-4、IL-1β、IL-10、TNF-α 水平的影響

MC 組與 NC 組相比，IL-1β 和TNF-α 的表達(dá)顯著增加（P＜0.01），而IL-4 和IL-10 的表達(dá)顯著減少（P＜0.01）；FLI 組IL-1β 和TNF-α 的表達(dá)顯著低于MC 組（P＜0.05），IL-4 和IL-10 的 表 達(dá) 顯 著 高 于MC 組（P＜0.01）；見表3。

表3 各組大鼠炎癥細(xì)胞因子水平的比較（n=6， ±s）Tab 3 Comparison of inflammatory cytokine levels in rats of each group（n=6， ±s）

表3 各組大鼠炎癥細(xì)胞因子水平的比較（n=6， ±s）Tab 3 Comparison of inflammatory cytokine levels in rats of each group（n=6， ±s）

注：對比NC 組，△△P＜0.01；對比MC 組，▲▲P＜0.01，▲P＜0.05。

組別NC IL-4 10.71±0.55 IL-1β 46.23±5.89 IL-10 67.81±3.91 TNF-α 42.00±7.99 MC 2.87±0.28△△153.60±13.02△△19.36±2.25△△177.41±7.94△△87.41±5.33▲FLI 6.82±0.23▲▲72.67±5.66▲30.00±0.99▲▲

2.4 Notch1 抑制劑對AA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中Notch1、Jagged1、Hes1、RBP-Jκ 蛋白的影響

MC 組 大 鼠 中Notch1、Jagged1、Hes1、RBP-Jκ的表達(dá)均明顯高于NC 組（P＜0.01）；Notch1 抑制劑組滑膜組織中Notch1、Jagged1、Hes1、RBP-Jκ 的表達(dá)明顯低于MC 組（P＜0.05）。見表4，圖3。

圖3 各組大鼠Notch1/Jagged1/RBP-Jκ/Hes1 蛋白表達(dá)Fig 3 The protein expression of Notch1 / Jagged1 /RBP-Jκ / Hes1 in each group of rats

表4 各組大鼠Notch1、Jagged1、Hes1 及RBP-Jκ 表達(dá)水平比較（n=6， ±s）Tab 4 Comparison of Notch1， Jagged1， Hes1 and RBP-Jκ expression levels in each group of rats（n=6， ±s）

表4 各組大鼠Notch1、Jagged1、Hes1 及RBP-Jκ 表達(dá)水平比較（n=6， ±s）Tab 4 Comparison of Notch1， Jagged1， Hes1 and RBP-Jκ expression levels in each group of rats（n=6， ±s）

注：與NC 組比較，△△P＜0.01；與MC 組比較，▲P＜0.05。

組別NC MC FLI RBP-Jκ 0.41±0.13 0.90±0.21△△0.61±0.16▲Notch1 0.15±0.13 0.73±0.12△△0.44±0.19▲Jagged1 0.10±0.04 0.54±0.12△△0.35±0.01▲Hes1 0.19±0.01 1.45±0.50△△0.46±0.08▲

2.5 AA 大鼠巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物與Notch1、Jagged1、Hes1、RBP-Jκ 蛋白的相關(guān)性分析

相 關(guān) 性 分 析 顯 示，CD80 與Notch1、Jagged1、Hes1、RBP-Jκ 蛋白成正相關(guān)（P＜0.01），CD163 與Notch1、Jagged1、Hes1、RBP-Jκ 蛋白成負(fù)相關(guān)（P＜0.01），見表5。

表5 CD80、CD163 與其他指標(biāo)相關(guān)性分析Tab 5 Correlation analysis of CD80， CD163 and other indicators

3 討論

RA 是一種自身免疫性炎癥性疾病，受累關(guān)節(jié)破壞不可逆主要特征為免疫細(xì)胞浸潤和滑膜炎癥，在RA 中，活化的滑膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和趨化因子，導(dǎo)致特征性關(guān)節(jié)炎癥和軟骨破壞［11，12］。研 究 發(fā) 現(xiàn)，IL-4、IL-10 和TNF-α 是RA 發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素，它們參與Th1 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致軟骨和骨破壞［13］。M1 型巨噬細(xì)胞是 RA 關(guān)節(jié)軟骨炎癥的關(guān)鍵調(diào)控分子，M2 巨噬細(xì)胞通過分泌IL-10 等細(xì)胞因子發(fā)揮抗炎活性并有利于組織修復(fù)，IL-4 可以誘導(dǎo)M1 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表降低和M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物增加［14-16］。研究表明，誘導(dǎo)從M1 極化為抗炎M2 巨噬細(xì)胞的治療可能是更好地控制RA 異常炎癥反應(yīng)［17］。本次研究結(jié)果表明，與NC 組 對 比，MC 組IL-1β、TNF-α 表 達(dá) 水 平 明 顯升高，IL-4、IL-10 表達(dá)水平明顯降低；CD80+細(xì)胞表達(dá)明顯升高，CD163+細(xì)胞表達(dá)明顯降低；Notch1、Jagged1、Hes1、RBP-Jκ 蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明AA 大鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞向M1 型巨噬細(xì)胞極化，抑制抗炎細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)；異常激活A(yù)A 大鼠體內(nèi)的Notch1/Jagged1 /RBP-Jκ/Hes1 信號軸研究結(jié)果驗證了課題組前期研究，在RA 發(fā)病中，Notch 信號通路和巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用密切相關(guān)。

Notch 信 號 通 路 包 含Notch 受 體（Notch1）和Notch 配體（Jagged-1）［18］。Notch 信號激活可能對巨噬細(xì)胞中的免疫防御機(jī)制產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)，同時可以促進(jìn) 細(xì) 胞 因 子 分 泌 并 加 重RA［19］。Notch1 和Jagged1結(jié)合之后，再與轉(zhuǎn)錄因子RBP-Jκ 相結(jié)合，從而形成一個轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，進(jìn)而調(diào)控靶基因Hes1的表達(dá)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的炎癥極化向M1 型分化，促進(jìn)IL-1β、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子的形成，能參與RA 的發(fā)展過程。抑制Notch 信號通路傳導(dǎo)引起巨噬細(xì)胞極化從M1 型向M2 型分化，可能參與治療RA 的過程［20-22］。本 次 實(shí) 驗 研 究 發(fā) 現(xiàn)，Notch1 抑 制 劑 組 的IL-1β、TNF-α 表達(dá)水平明顯低于MC 組，IL-4、IL-10表 達(dá) 水 平 明 顯 高 于MC 組；與Su 等［23］研 究 結(jié) 果相似。

RBP-Jκ 依賴性Notch 通路是一種參與關(guān)節(jié)維持和關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)的新途徑［24］。Yang 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，抑制Notch1 受體和Jagged1 配體和Hes1 的表達(dá)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化為M2 巨噬細(xì)胞。相關(guān)性分析，CD80 與Notch1、Jagged1、Hes1、RBP-Jκ 蛋白成正相關(guān)，CD163 與Notch1、Jagged1、Hes1、RBP-Jκ 蛋白成負(fù)相 關(guān)，Notch1 與Jagged1 結(jié)合后，與RBP-Jκ結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)靶基因Hes1的表達(dá)，可以使巨噬細(xì)胞向M1 極化。結(jié)果表明，Notch1/Jagged1/RBP-Jκ/Hes1 信號軸與M1、M2 相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，Notch1 抑制劑組可以顯著下調(diào)滑膜組織中Notch1、Jagged1、Hes1、RBP-Jκ 蛋白表達(dá)，而與MC 組相比較，Notch1 抑制劑組大鼠E、AI 顯著降低；CD80+細(xì)胞表達(dá)明顯降低，CD163+細(xì)胞表達(dá)明顯升高；對比前期研究，本研究進(jìn)一步明確了抑制Notch1 信號通路可以通過調(diào)控巨噬細(xì)胞向M2 型極化，上調(diào)IL-4 和IL-10 表達(dá)，下調(diào)IL-1β和TNF-α 表達(dá)，來改善AA 大鼠的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，通過抑制Notch1/Jagged1/RBP-Jκ/Hes1 信號軸，可調(diào)控M1 型向M2 型巨噬細(xì)胞極化，改善AA 大鼠的免疫炎癥反應(yīng)，這為以后臨床研究提供了技術(shù)和科學(xué)基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

程靜：完成試驗、分析數(shù)據(jù)、撰寫論文；萬磊：進(jìn)行實(shí)驗設(shè)計，為論文提供方向；趙磊采集標(biāo)本； 李舒，李方澤，胡賽賽，陳瑩瑩：收集資料。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。