基于生物信息學(xué)分析SPHK1 在胃癌中的表達(dá)及臨床價(jià)值

凌潛龍，管佳佳，紀(jì) 凱，朱爽秋，朱 冰

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃腸外科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科，安徽 蚌埠 233000）

胃癌（gastric cancer，GC）是常見的消化道惡性腫瘤之一，一直是南美、東歐和中國癌癥相關(guān)死亡的重要原因［1-3］。雖然有些高發(fā)地區(qū)進(jìn)行篩查，已經(jīng)降低了胃癌相關(guān)死亡率和發(fā)病率，但總體5 年生存率仍然很低［4］。盡管腹腔鏡手術(shù)和藥物治療取得了一系列進(jìn)展，但晚期GC 患者仍然預(yù)后較差［5，6］。因此，為確定GC 發(fā)生進(jìn)展的主要分子機(jī)理，尋找預(yù)后生物標(biāo)志物和基因調(diào)控靶點(diǎn)將有助于進(jìn)行個(gè)體化治療。

鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SPHK1）作為體內(nèi)一種脂質(zhì)活性激酶，可將鞘氨醇磷酸化生成鞘氨醇-1-磷酸（S1P）［7，8］，已被證明可以在癌癥進(jìn)展的不同階段中的發(fā)揮各種功能［9，10］。SPHK1 通過上調(diào)癌細(xì)胞中的S1P 受體表達(dá)，參與疾病進(jìn)程［11］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)SPHK1 在胃癌中起著至關(guān)重要的作用［12］。現(xiàn)在，許多研究表明 SPHK1 與胃癌診斷及預(yù)后生物標(biāo)志物可能存在關(guān)聯(lián)［13］。然而，SPHK1 在胃癌進(jìn)展中作用和具體機(jī)制尚不清楚，本研究利用生物信息學(xué)分析預(yù)測SPHK1 在胃癌中的表達(dá)。通過分析SPHK1 在胃癌組織中與免疫細(xì)胞浸潤的作用、與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為胃癌患者的診斷、治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要材料

臨床樣本收集于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃腸外科2020 年1 月～2022 年12 月手術(shù)切除的所需樣本組織和臨床病理數(shù)據(jù)。蛋白濃度BCA 試劑盒與凝膠PAGE 試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)公司。Omni-ECLTM 顯影試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司。小鼠多克隆抗體SPHK1、GAPDH 均購自武漢三鷹（Proteintech）公司。PVDF 膜購自Millipore 公司。其他試劑均為進(jìn)口。

1.2 數(shù)據(jù)庫分析

從HPA（https：//www.proteinatlas.org）下載胃癌與癌旁組織數(shù)據(jù)。使用 TIMER2.0（http：//timer.cistrome.org）數(shù)據(jù)庫分析SPHK1mRNA 在不同惡性腫瘤中的表達(dá)水平情況。GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）數(shù)據(jù)庫分析SPHK1 與腫瘤生長因子MKI67 在胃癌組織中的表達(dá)。Kaplan-Meier Plotter（http//：Kmplot.com）數(shù) 據(jù) 庫 在 線 分 析SPHK1mRNA 的表達(dá)水平與胃癌患者生存預(yù)后的關(guān) 系。cBioPortal（https：//www.cbioportal.org）數(shù)據(jù)庫下載與SPHK1 在胃癌中共表達(dá)的潛在靶基因。DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）數(shù)據(jù)庫分析下載富集相關(guān)數(shù)據(jù)。使用微生信網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn）在線編輯處理下載數(shù)據(jù)。基于TISCH（http：//tisch.comp-genomics.org/home）給定的數(shù)據(jù)，探討SPHK1 與TME 之間的關(guān)聯(lián)，其中網(wǎng)站提供的胃癌芯片為GSE134520。

1.3 免疫組織化學(xué)

50 例胃癌組織和34 例匹配的相鄰正常組織按標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行包埋。具體操作參考Deng 等［14］。由2 名病理科醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行盲審評(píng)分。染色百分率評(píng)分：0（＜5%陽性細(xì)胞）；1 個(gè)（5%～24%陽性細(xì)胞）；2 個(gè)（25%～49%陽性細(xì)胞）；3 個(gè)（50%～74%）和4個(gè)（≥75%）。染色強(qiáng)度評(píng)分為：0（未染色）、1（弱）、2（中等）、3（強(qiáng)）。聯(lián)合染色評(píng)分等同于染色百分比score×staining 強(qiáng)度評(píng)分，聯(lián)合評(píng)分≥4 為陽性表達(dá)，聯(lián)合評(píng)分＜4 為陰性表達(dá)。

1.4 Western Blot

將胃癌與癌旁組織進(jìn)行蛋白提取，使用BCA 法對(duì)獲取的蛋白進(jìn)行定量。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，在電泳試驗(yàn)完畢后將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至0.45 μm 的PVDF 薄膜上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。之后將膜浸入封閉液中封閉60 min。封閉完成3 次洗膜后，稀釋相應(yīng)一抗將 PVDF 薄膜放至4℃冰箱過夜孵育。次日洗膜，與二抗室溫?fù)u床孵育90 min 為宜。ECL-plus 檢測 PVDF 膜上的蛋白信號(hào)，然后曝光并顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用數(shù)據(jù)庫默認(rèn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。用Person 相關(guān)分析SPHK1 與相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系；采用Kaplan-Meier Plotter 統(tǒng)計(jì)患者生存率，并用Log-rank 檢驗(yàn)方法分析SPHK1 的表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)系；用χ2檢驗(yàn)分析SPHK1 的陽、陰性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系；胃癌與癌旁組織的WB 結(jié)果采用wilcoxon 檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPHK1 在細(xì)胞中的定位檢測

基于HPA 數(shù)據(jù)庫檢索，SPHK1 可能在細(xì)胞模型中的胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，見圖1A。為進(jìn)一步定位，利用HPA 數(shù)據(jù)庫分析細(xì)胞表達(dá)SPHK1 的免疫熒光，表明SPHK1 在人體正常細(xì)胞胞質(zhì)中高表達(dá)，見圖1B。

圖1 SPHK1 在細(xì)胞中的定位檢測Fig 1 Localization detection of SPHK1 in cells

2.2 SPHK1 在人體正常胃組織中的表達(dá)

HPA 數(shù)據(jù)庫解析，表明SPHK1 廣泛分布于身體各組織。在人體多種組織中SPHK1 低表達(dá)，且在人正常胃組織中表達(dá)也不高，見圖2A。此外，SPHK1 在正常胃組織細(xì)胞中也廣泛表達(dá)，如基質(zhì)細(xì)胞、纖維細(xì)胞、T 細(xì)胞等，見圖2B。

圖2 SPHK1 在人體正常組織和細(xì)胞中的表達(dá)Fig 2 Expression of SPHK1 in normal human tissues and cells.

2.3 SPHK1 在不同腫瘤類型中的表達(dá)

TCGA 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示，SPHK1 在多種癌癥中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢，如乳腺浸潤癌（BRCA）、膽管癌（CHOL）、結(jié)腸癌（COAD）、肝細(xì)胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）等（P＜0.05）。其中SPHK1 在胃癌組織中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于癌旁組織，P＜0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3A。同時(shí)，根據(jù)HPA 數(shù)據(jù)庫下載胃癌組織與正常組織中SPHK1 表達(dá)的免疫組化染色結(jié)果，表明SPHK1 在胃癌組織中高表達(dá)，見圖3B。

圖3 SPHK1 在各種腫瘤組織中的表達(dá)情況Fig 3 Expression of SPHK1 in various tumor tissues

2.4 SPHK1 表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

為深入探究SPHK1 與胃癌患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)。首先，采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析SPHK1 與腫瘤生長因子MKI67 在胃癌組織中的表達(dá)［15］。結(jié)果顯示，見圖4A，SPHK1 在胃癌組織中的表達(dá)量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其次，見圖4B，胃癌組織中MKI67 表達(dá)水平也高于癌旁組織，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外兩者表達(dá)呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 49），見圖4C?？赡芴崾維PHK1 高表達(dá)與胃癌患者不良預(yù)后有關(guān)。另外，利用Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫，在線評(píng)價(jià)SPHK1mRNA 的表達(dá)狀況與胃癌患者生存預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果表明，高表達(dá)的SPHK1 在胃癌中預(yù)示了較差的總生存期，log rankP=0.002，見圖4D。同時(shí)，也預(yù)示了更差的進(jìn)展后生成期，log rankP=0.001 9，見圖4E，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 SPHK1 表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig 4 Relationship between SPHK1 expression levels and prognosis of gastric cancer patients

2.5 胃癌中的基因通路富集

在本研究中，首先利用cBioportal 數(shù)據(jù)庫下載與SPHK1 在胃癌中共表達(dá)的前500 個(gè)潛在靶基因，再利用DAVID 數(shù)據(jù)庫分析下載與SPHK1mRNA富集相關(guān)數(shù)據(jù)。包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和KEGG 通路。利用微生信網(wǎng)站對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并得出結(jié)果。見圖5A～C，發(fā)現(xiàn)在由BP、CC 和 MF 構(gòu)成的GO 分析中，富集到包括細(xì)胞內(nèi)受體（intracellular receptor）、ATP 酶激活（ATP enzymes activation）、生 長 結(jié) 合 因 子（growth binding factor）等癌癥相關(guān)信號(hào)通路（P＜0.05）。而在KEGG 富集通路中，SPHK1 潛在靶基因也富集了已被廣泛研究并證實(shí)與胃癌發(fā)展有關(guān)的信息通路，如Hedgehog signaling pathway、Relaxin signaling pathway 和cAMP signaling pathway 等，見圖5D，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.6 SPHK1 對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響

腫瘤微環(huán)境（tumour microenvironment，TME）非常復(fù)雜。TME 內(nèi)的各種免疫基質(zhì)細(xì)胞與癌細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等過程［16-18］。因此，深入研究SPHK1 與TME 關(guān)系十分必要。利用TIMER 數(shù)據(jù)庫研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌免疫微環(huán)境中，SPHK1mRNA 的表達(dá)水平與腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)（偏相關(guān)系數(shù)＝-0.148），P＜0.001。另一方面，SPHK1 在免疫微環(huán)境中與B 細(xì)胞也呈負(fù)相關(guān)（偏相關(guān)系數(shù)＝-0.291）（P＜0.001），存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，在免疫微環(huán)境中SPHK1 與中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞呈正相關(guān)（偏相關(guān)系數(shù)均為正值），而與CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表達(dá)無確切關(guān)聯(lián)（P＞0.05），見圖6A?；赥ISCH 給定的數(shù)據(jù)，探討SPHK1 與TME 之間的關(guān)聯(lián)。網(wǎng)站提供的胃癌芯片為GSE134520，收錄TME 相關(guān)細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞（ 如CD8+T 細(xì)胞、漿細(xì)胞等） 、間質(zhì)細(xì)胞（如黏液細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等），SPHK1基因與TME 相關(guān)性分析結(jié)果如下：SPHK1基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量最高（ Malignant cells：log（TPM/10+1） =0.39），見圖6B。此外，在巨噬細(xì)胞中，低SPHK1 表達(dá)組胃癌患者的進(jìn)展后生存期優(yōu)于SPHK1 高表達(dá)組，log rank P=0.002，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖6C。而在中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞 和B細(xì)胞中，SPHKmRNA 低表達(dá)對(duì)胃癌患者生存期無顯著差異（P＞0.05）。

圖6 SPHK1 對(duì)胃癌免疫微環(huán)境的影響Fig 6 Impact of SPHK1 on the immune microenvironment of gastric cancer

2.7 SPHK1 在胃癌組織中的表達(dá)

收集臨床胃癌組織樣本50 例和鄰近非腫瘤組織34 例。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，SPHK1 表達(dá)與胃癌患者性別（χ2=0.277，P=0.610）、年 齡（χ2=1.054，P=0.267）不 相 關(guān)，與 病 理 分 期（χ2=9.141，P=0.003 5）、TNM 分期（χ2=7.257，P=0.007 3）、N 分期（χ2=4.957，P=0.025 1）相關(guān)，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 SPHK1 表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系Tab1 Analysis of SPHK1 expression and clinicopathological characteristics

為進(jìn)一步探討SPHK1 在胃癌組織中的表達(dá)情況，將對(duì)臨床組織樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。IHC 結(jié)果顯示，見圖7A，SPHK1 在胃癌組織中的染色強(qiáng)度和染色陽性面積均高于鄰近非腫瘤組織，并且TNM 分期中胃癌組織染色強(qiáng)度TNMI、Ⅱ期弱于Ⅲ、Ⅳ期，提示SPHK1 表達(dá)可能與胃癌進(jìn)展相關(guān)。通過IHC 染色評(píng)分，表明SPHK1 在胃癌組織中高表達(dá)，見圖7C，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。此外，經(jīng)過Western Blot 檢測，在9 例胃癌組織及配對(duì)的癌旁組織中，SPHK1 在胃癌組織和癌旁組織的表達(dá)中位數(shù)分別為0.903 和0.615，其蛋白水平表達(dá)在胃癌組織中高于癌旁組織，見圖7B、D，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026 5）。同時(shí)，驗(yàn)證了生信數(shù)據(jù)分析部分結(jié)果。基于此，以上數(shù)據(jù)進(jìn)一步提示了SPHK1 在胃癌組織中高表達(dá)，可能與胃癌進(jìn)展不良預(yù)后相關(guān)。

3 討論

胃癌一般起病較隱匿，大部分病例在初步診斷時(shí)就已達(dá)到局部發(fā)展階段，因而死亡率較高［19］。經(jīng)過傳統(tǒng)的手術(shù)與藥物治療的胃癌患者仍然有不良預(yù)后［20］。SPHK1基因在細(xì)胞生長和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用［21］。胃癌腹膜播散已被公認(rèn)為晚期胃癌最常見的轉(zhuǎn)移形式，SPHK1 驅(qū)動(dòng)的人腹膜間皮細(xì)胞自噬加速了胃癌腹膜播散在體外和體內(nèi)的發(fā)生［13］。Xia 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，SPHK1 在胃癌中表達(dá)升高，而下調(diào)SPHK1 可抑制胃癌細(xì)胞增殖，并且與患者的生存時(shí)間縮短有關(guān)。通過紫外線照射人MGC-803 胃 癌 細(xì) 胞，SPHK1 通 過AKT/FoxO3a/Bim 途徑賦予胃癌細(xì)胞凋亡抵抗力［23］。而SPHK1轉(zhuǎn)錄的ERK1 依賴性上調(diào)刺激胃癌細(xì)胞增殖［24］。這些結(jié)果預(yù)示SPHK1 將在胃癌診斷、治療和預(yù)后預(yù)測過程中起著重要意義，進(jìn)而為胃癌的精確診斷、治療指明了新走向。在Qin 等［25］的研究中發(fā)現(xiàn)，SPHK1 通過NONO/STAT3 軸促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞中的順鉑抵抗，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫逃逸。在一項(xiàng)非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)肝細(xì)胞癌臨床病理分析研究中，通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)SPHK1 較正常組織具有高水平表達(dá)［26］。此外，Peng 等［27］研究表明高水平表達(dá)的SPHK1 在肺腺癌的發(fā)展進(jìn)程中具有重要作用。與靶向治療耐藥相關(guān)的SPHK1 在預(yù)測腎細(xì)胞癌預(yù)后不良方面也呈過表達(dá)狀態(tài)［28］。因此，胃癌進(jìn)展中的靶基因研究更具有重要的臨床意義［29］。這也為本研究提供了研究基礎(chǔ)和方向。

在本研究中，基于TCGA 和HPA 數(shù)據(jù)庫，SPHK1 在胃癌組織和癌旁組織中表達(dá)存在顯著差異。IHC 和Western Blot 結(jié)果表明SPHK1 在胃癌組織中呈高表達(dá)趨勢，這與生物學(xué)信息分析結(jié)果一致。通過進(jìn)一步生物學(xué)信息檢索，SPHK1 與腫瘤生長因子MKI67 表達(dá)呈現(xiàn)正向相關(guān)性。Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫還提示高表達(dá)的SPHK1 在胃癌中預(yù)示更差的生存期。而富集通路分析結(jié)果同樣提示SPHK1 參與多種通路影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展。腫瘤微環(huán)境中各種免疫細(xì)胞在癌癥中的確切作用十分復(fù)雜［30，31］。淋巴細(xì)胞浸潤可以通過樹突狀細(xì)胞免疫療法誘導(dǎo)腫瘤浸潤，這可能對(duì)臨床結(jié)果產(chǎn)生積極影響［32］。本研究表明，SPHK1 的表達(dá)可能與3 種免疫細(xì)胞類型的浸潤顯著相關(guān)，提示SPHK1 不僅可以反映癌癥患者預(yù)后，還反映免疫狀態(tài)。此外，SPHK1基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量最高，繼而調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展。

綜上所述，SPHK1 在胃癌中的作用顯著，它可能是一個(gè)潛在的胃癌預(yù)后標(biāo)志物。但本研究仍有一定的局限性，因而將進(jìn)一步收集臨床胃癌患者數(shù)據(jù)，隨訪分析5 年生存率。同時(shí)干擾SPHK1基因表達(dá)，從細(xì)胞層面探討SPHK1 對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，繼而深入研究胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)度說明：

凌潛龍：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)執(zhí)行、數(shù)據(jù)庫檢索和論文撰寫；管佳佳：參與部分?jǐn)?shù)據(jù)庫檢索；紀(jì)凱與朱爽秋：參與部分基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)；朱冰：參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、論文撰寫指導(dǎo)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。

道德倫理：蚌埠醫(yī)學(xué)院人體倫理審批號(hào)［2023］第311號(hào)、405 號(hào)。