加味桃仁承氣湯對(duì)機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷大鼠細(xì)胞自噬的影響

孫治霞，王麗輝，索紅亮，陳乾

機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷（ventilation-induced lung injury，VILI）是呼吸機(jī)應(yīng)用過程中由于機(jī)械通氣等諸多因素導(dǎo)致的肺組織損傷，其臨床病理特征為肺浸潤(rùn)、血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加、肺水腫、缺氧等［1-2］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為VILI 存在熱結(jié)腸腑、血瘀、肺氣內(nèi)閉等表現(xiàn)，治療應(yīng)從瀉腑通便、活血化瘀、宣通肺氣入手［3］。桃仁承氣湯源于《傷寒論》，具有破血祛瘀的功效。加味桃仁承氣湯是在桃仁承氣湯中加入黃芪、地黃、玄參、麥冬而成，其具有降糖、降脂、抑制炎癥等作用［3］。加味桃仁承氣湯為瀉腑通便、活血化瘀的重要方劑，有通腑氣、利肺氣的功效，但加味桃仁承氣湯對(duì)VILI 的預(yù)防作用鮮有報(bào)道。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase，AMPK）參與機(jī)體對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控，也與細(xì)胞自噬過程相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)AMPK 與哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的信號(hào)通路存在交叉，mTOR是細(xì)胞自噬過程中的重要細(xì)胞因子之一［4］。mTOR 具有mTORC1和mTORC2 兩種復(fù)合體，活化的AMPK 會(huì)使mTORC1 表達(dá)下調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬［5］。本研究通過建立大鼠VILI 模型，并予以加味桃仁承氣湯及AMPK 抑制劑Compound C，觀察加味桃仁承氣湯通過AMPK/mTOR信號(hào)通路對(duì)大鼠VILI的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～300 g，購自廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2021-0057。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，12 h晝夜交替，動(dòng)物自由攝食、飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)已得到河南省中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批號(hào)：2022-0148）。

1.2 主要試劑與儀器 加味桃仁承氣湯由桃仁12 g、大黃15 g、赤芍12 g、丹皮12 g、桂枝6 g、當(dāng)歸9 g、芒硝4 g、炙甘草6 g、黃芪30 g、地黃12 g、玄參12 g、麥冬12 g 組成，購于河南省中醫(yī)院中藥房，已經(jīng)鑒定均為正品，由河南省中醫(yī)院中藥制劑室煎制，于4 ℃儲(chǔ)存。AMPK 抑制劑Compound C 購自Sigma Aldrich 公司；戊巴比妥鈉購自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；Trizol 試劑、RIPA裂解液購自Thermo Fisher公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成；AMPK、p-AMPK、mTOR、pmTOR、Beclin-1、LC3 兔抗鼠一抗和相應(yīng)羊抗兔二抗購自美國(guó)Santa Cruz 公司。小動(dòng)物呼吸機(jī)購自Harvard Apparatus 公司；Image圖像分析儀購自美國(guó)Bio-Rad公司；RT-qPCR儀購自美國(guó)Thermo Fisher公司；倒置顯微鏡購自上海蔡康光學(xué)儀器廠；透射電子顯微鏡購自日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠VILI 模型的構(gòu)建與分組 參照文獻(xiàn)［6］方法，對(duì)48 只大鼠構(gòu)建VILI 模型。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，自由飲水。腹腔注射2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，將其仰臥位固定，頸部皮膚備皮，碘伏消毒，在頸部正中切口，止血鉗分離切口下皮膚與肌肉，暴露大鼠氣管。將氣管切開，插入氣管導(dǎo)管并固定，接小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，股動(dòng)脈插管進(jìn)行采血與動(dòng)脈壓監(jiān)測(cè)，股靜脈插管建立液體通道，保持經(jīng)脈通暢。呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置：呼吸頻率40 次/min，潮氣量為40 mL/kg，吸呼比（I∶E）1∶1，呼氣末正壓為0，吸入氧濃度（fraction of inspiration O2，F(xiàn)iO2）為21%。通氣時(shí)大鼠保持仰臥位，室溫維持26～28 ℃。

采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的48只大鼠分成4組，分別為模型組（Model 組）、加味桃仁承氣湯低劑量組（中藥-L組，2.85 g/kg［7］）、加味桃仁承氣湯高劑量組（中藥-H 組，8.55 g/kg［8］）和加味桃仁承氣湯高劑量+AMPK 抑制劑Compound C 組（中藥-H+CC 組，加味桃仁承氣湯8.55 g/kg+Compound C 250 μg/kg［7］），每組12只。另取12只大鼠作為假手術(shù)組（Sham組），Sham組不作機(jī)械通氣，僅行氣管切開和插管操作。中藥-L組、中藥-H組和中藥-H+CC 組機(jī)械通氣前7 d 灌胃相應(yīng)劑量的加味桃仁承氣湯，Model 組機(jī)械通氣前7 d灌胃等量生理鹽水，1次/d，共7次；Compound C 采取尾靜脈注射，每2 d注射1次，共3次。

1.3.2 動(dòng)脈血氧合指數(shù)（oxygenation index，OI）測(cè)定 各組大鼠在機(jī)械通氣插管即刻，機(jī)械通氣1 h、2 h、4 h（結(jié)束通氣）時(shí)采集動(dòng)脈血，進(jìn)行血?dú)鈾z測(cè)，記錄動(dòng)脈血氧分壓［p（O2）］，根據(jù)FiO2計(jì)算OI，OI=p（O2）/FiO2。

1.3.3 ELISA 法檢測(cè)肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中TNF-α、IL-1β、IL-18 水平 機(jī)械通氣4 h 后處死大鼠，結(jié)扎大鼠右主支氣管，用預(yù)冷的生理鹽水5 mL灌洗左肺，收集BALF，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，取出上清液，于-80 ℃保存。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)各組大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-18水平。

1.3.4 肺濕/干重（wet/dry lung weight，W/D）比值測(cè)定 處死大鼠后摘取其右肺，稱其質(zhì)量即為濕重；將其置于80 ℃恒溫箱干燥24 h，再次稱質(zhì)量計(jì)為干重。W/D=濕重/干重。

1.3.5 HE染色觀察大鼠肺組織病理學(xué)變化并評(píng)分 收集大鼠肺組織，使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，封片。于光鏡下觀察各組大鼠肺組織病理學(xué)變化。參照文獻(xiàn)［9］方法，對(duì)肺損傷程度進(jìn)行評(píng)分。根據(jù)損傷程度由輕到重，計(jì)為0、1、2、3、4分。觀察指標(biāo)為：肺泡水腫情況、出血、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁增厚或透明膜形成。

1.3.6 透射電鏡觀察自噬體情況 在低溫狀態(tài)下，從左肺門附近取約1 mm3組織塊，浸入2.5%的戊二醛固定液，混勻后于4 ℃固定2 h，并依次經(jīng)1%鋨酸固定、1%醋酸鈾塊染、梯度乙醇脫水、丙酮浸泡、包埋聚合，制作半薄切片和超薄切片，透射電鏡下觀察肺組織上皮細(xì)胞的形態(tài)并進(jìn)行拍照。

1.3.7 RT-qRCR 測(cè)定肺組織中AMPK、mTORC1 mRNA 表達(dá)水平 取大鼠肺組織，加入Trizol 試劑進(jìn)行組織RNA 的提取。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt計(jì)算AMPK、mTORC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

Tab.1 Sequences of the primers表1 引物序列

1.3.8 Western blot 法檢測(cè)肺組織中AMPK、p-AMPK、mTORC1、p-mTORC1 和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 取出大鼠肺組織加入PIPA 裂解液，經(jīng)高速低溫組織研磨儀研磨后，4 ℃低溫裂解，12 000 r/min 離心10 min 后，取上清液為肺組織總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。上樣，12%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后加入AMPK（1∶500）、p-AMPK（1∶500）、mTORC1（1∶500）、p-mTORC1（1∶500）、Beclin-1（1∶1 000）、LC3-Ⅰ（1∶1 000）、LC3-Ⅱ（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗，在4 ℃下孵育過夜。次日加入相應(yīng)二抗（1∶1 000），在37 ℃下孵育2 h，以GAPDH為內(nèi)參，Image圖像分析儀分析目標(biāo)蛋白條帶的相對(duì)灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 7.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)OI 比較 機(jī)械通氣2 h、4 h時(shí)，與Sham 組相比，Model 組OI 降低（P＜0.05）；與Model 組、中藥-L 組相比，中藥-H 組OI 升高（P＜0.05）；與中藥-H 組相比，中藥-H+CC 組OI 降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of OI at each time points between the five groups of rats表2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)OI比較（n=12，mmHg，±s）

Tab.2 Comparison of OI at each time points between the five groups of rats表2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)OI比較（n=12，mmHg，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Model組比較，c與中藥-L組比較，d與中藥-H組比較，P＜0.05；表3—5同；1 mmHg=0.133 kPa。

組別Sham組Model組中藥-L組中藥-H組中藥-H+CC組F插管即刻566.23±34.35 572.36±32.62 568.40±33.14 563.83±30.15 568.36±31.07 0.114通氣1 h 557.68±26.92 549.73±29.66 553.17±30.83 555.24±28.35 551.29±29.64 0.141通氣2 h 548.44±28.48 265.52±20.31a 286.50±21.22 521.86±27.96bc 432.64±20.33d 357.164＊＊通氣4 h 546.35±25.87 208.94±15.47a 223.64±16.42 515.30±23.65bc 410.68±23.52d 658.911＊＊

2.2 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-18水平比較 與Sham 組相比，Model 組大鼠BALF 中TNF-α、IL-1β 和IL-18 水平升高（P＜0.05）；與Model 組、中藥-L 組相比，中藥-H 組BALF 中TNF-α、IL-1β 和IL-18 水平降低（P＜0.05），中藥-L 組與Model 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與中藥-H組相比，中藥-H+CC 組大鼠BALF 中TNF-α、IL-1β 和IL-18水平升高（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of levels of TNF-α,IL-1β and IL-18 in BALF between the five groups of rats表3 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-18水平比較（n=12，ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of levels of TNF-α,IL-1β and IL-18 in BALF between the five groups of rats表3 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-18水平比較（n=12，ng/L，±s）

組別Sham組Model組中藥-L組中藥-H組中藥-H+CC組F TNF-α 16.59±2.48 128.45±12.06a 117.63±13.55 80.27±8.22bc 104.20±11.39d 223.256＊＊IL-1β 19.25±2.03 102.34±11.65a 96.41±9.50 68.42±6.22bc 83.69±8.24d 197.278＊＊IL-18 22.34±2.78 139.05±12.59a 128.55±11.31 85.65±8.24bc 116.52±12.35d 257.616＊＊

2.3 各組大鼠肺W/D 值比較 Sham 組、Model 組、中藥-L組、中藥-H組、中藥-H+CC組大鼠肺W/D值分別為4.59±0.42、6.67±0.65、6.13±0.57、5.16±0.54、6.09±0.58，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=13.521，P＜0.01）。與Sham組相比，Model組大鼠肺W/D值升高（P＜0.05）；與Model 組、中藥-L 組相比，中藥-H 組大鼠肺W/D值降低（P＜0.05），中藥-L組與Model比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與中藥-H組相比，中藥-H+CC組大鼠肺W/D值升高（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化與肺損傷評(píng)分的比較 Sham 組肺組織形態(tài)完整，肺泡腔清晰，未見肺泡隔增厚、水腫；Model組肺組織結(jié)構(gòu)缺失破壞，肺泡腔水腫、增厚，肺泡內(nèi)有滲出，肺泡萎縮；與Model組相比，中藥-H 組肺組織損傷明顯改善，組織結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，肺泡形態(tài)正常，肺泡隔增厚較輕微，肺泡壁水腫減輕，偶見肺泡腔水腫滲出。與中藥-H組相比，中藥-H+CC 組肺組織病理損傷加重，肺泡壁水腫明顯，肺泡腔滲出增多，見圖1。Sham 組、Model組、中藥-L 組、中藥-H 組、中藥-H+CC 組肺損傷評(píng)分分別為（0.00±0.00）分、（9.83±1.17）分、（9.33±1.37）分、（6.17±0.75）分、（8.33±0.82）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=108.024，P＜0.05）。與Sham 組相比，Model 組肺損傷評(píng)分升高（P＜0.05）；與Model組、中藥-L組相比，中藥-H組肺損傷評(píng)分降低（P＜0.05），中藥-L 組與Model 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與中藥-H組相比，中藥-H+CC組大鼠肺損傷評(píng)分升高（P＜0.05）。

Fig.1 HE staining of rat lung tissue in each group(×100)圖1 各組大鼠肺組織HE染色（×100）

2.5 各組大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn) Sham 組肺泡組織結(jié)構(gòu)完整，線粒體形態(tài)正常，無水腫，呈較扁狀，嵴線分明，板層小體內(nèi)容物豐富；Model 組線粒體高度水腫，嵴線溶解甚至消失，板層小體內(nèi)容物減少，自噬體形成。與Model 組相比，中藥-L 組、中藥-H組的肺泡細(xì)胞損傷減輕，線粒體輕微腫脹，自噬小體增多；其中中藥-H 組的損傷更輕，自噬小體較多。與中藥-H 組相比，中藥-H+CC 組肺泡細(xì)胞損傷加重，自噬小體減少，見圖2。

Fig.2 Observation of alveolar epithelial cells of rats in each group by transmission electron microscope(×15 000)圖2 透射電鏡觀察各組大鼠肺泡上皮細(xì)胞（×15 000）

2.6 各組大鼠肺組織中AMPK、mTORC1 mRNA 的表達(dá)比較 與Sham 組相比，Model 組肺組織中AMPK mRNA表達(dá)水平降低，mTORC1 mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與Model 組、中藥-L 組相比，中藥-H 組肺組織中的AMPK mRNA 表達(dá)水平升高，mTORC1 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05），中藥-L組與Model 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與中藥-H組相比，中藥-H+CC組肺組織中AMPK mRNA表達(dá)水平降低，mTORC1 mRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Comparison of AMPK and mTORC1 mRNA expression in lung tissue between the five groups of rats表4 各組大鼠肺組織中AMPK、mTORC1 mRNA表達(dá)比較（n=6，±s）

Tab.4 Comparison of AMPK and mTORC1 mRNA expression in lung tissue between the five groups of rats表4 各組大鼠肺組織中AMPK、mTORC1 mRNA表達(dá)比較（n=6，±s）

組別Sham組Model組中藥-L組中藥-H組中藥-H+CC組F AMPK 1.00±0.00 0.57±0.05a 0.63±0.06 0.85±0.09bc 0.68±0.07d 48.738＊＊mTORC1 1.00±0.00 1.42±0.12a 1.35±0.13 1.14±0.11bc 1.33±0.12d 15.555＊＊

2.7 各組大鼠肺組織中AMPK/mTOR信號(hào)通路與自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與Sham 組相比，Model 組肺組織中p-AMPK、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 表達(dá)水平降低，p-mTORC1 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與Model 組、中藥-L 組相比，中藥-H 組肺組織中p-AMPK、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 表達(dá)水平升高，pmTORC1 表達(dá)水平降低（P＜0.05），中藥-L 組與Model 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與中藥-H組相比，中藥-H+CC 組大鼠肺組織中p-AMPK、LC3- Ⅱ/LC3- Ⅰ、Beclin-1 表達(dá)水平降低，pmTORC1表達(dá)水平升高（P＜0.05），見表5、圖3。

Fig.3 Expression of AMPK/mTOR pathway-related proteins and autophagy-related proteins in lung tissue of rats in each group圖3 各組大鼠肺組織中AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

Tab.5 Comparison of expression of AMPK/mTOR signaling pathway-related proteins and autophagy-related proteins in lung tissue between five groups of rats表5 各組大鼠肺組織中AMPK/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白與自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較 （n=6，±s）

Tab.5 Comparison of expression of AMPK/mTOR signaling pathway-related proteins and autophagy-related proteins in lung tissue between five groups of rats表5 各組大鼠肺組織中AMPK/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白與自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較 （n=6，±s）

組別Sham組Model組中藥-L組中藥-H組中藥-H+CC組F p-AMPK/AMPK 0.65±0.07 0.34±0.03a 0.39±0.04 0.58±0.06bc 0.42±0.04d 41.738＊＊p-mTORC1/mTORC1 0.41±0.04 0.86±0.09a 0.78±0.09 0.47±0.05bc 0.72±0.07d 46.393＊＊LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.78±0.20 0.88±0.09a 0.92±0.15 1.57±0.18bc 1.16±0.12d 40.661＊＊Beclin-1 0.82±0.08 0.25±0.03a 0.32±0.05 0.75±0.08bc 0.44±0.04d 110.444＊＊

3 討論

VILI 是由于機(jī)械通氣所致的肺損傷，而機(jī)械通氣是維持急性呼吸衰竭患者生命的干預(yù)手段之一［10］。越來越多證據(jù)表明，VILI 的發(fā)生機(jī)制是由于機(jī)械過度刺激，誘導(dǎo)肺部發(fā)生炎癥反應(yīng)，引起肺組織水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性因子入血導(dǎo)致全身性炎癥等嚴(yán)重后果［11］。臨床緩解VILI 主要依靠抗感染藥物、抗氧化藥物、環(huán)氧化酶抑制劑和肌松藥等［12］。本研究采用呼吸機(jī)對(duì)大鼠進(jìn)行機(jī)械通氣建立VILI 大鼠模型，HE染色結(jié)果顯示機(jī)械通氣導(dǎo)致Model 組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂、肺泡間隔增厚，肺泡腔水腫、增厚，肺泡內(nèi)有滲出。與Sham 組相比，VILI 大鼠血液OI 降低，肺W/D、炎性因子水平及肺損傷評(píng)分升高，提示大鼠VILI 模型建立成功，與相關(guān)文獻(xiàn)［2］報(bào)道一致。

加味桃仁承氣湯是治療傷寒太陽蓄血癥的經(jīng)典名方，以逐腑泄熱為主，桃仁能夠破血消瘀，大黃有攻下泄熱的作用，芒硝軟堅(jiān)散結(jié)；當(dāng)歸、黃芪補(bǔ)氣養(yǎng)血。諸藥合用能達(dá)到更好活血散瘀、通腑泄熱的功效［13］。黃耀明等［14］研究發(fā)現(xiàn)，桃仁承氣湯內(nèi)服與四黃膏加味外敷合用治療脊柱壓縮性骨折，可以提高療效。馬翠芹等［15］研究發(fā)現(xiàn)，加味桃仁承氣湯聯(lián)合護(hù)理干預(yù)能夠有效緩解胸腰椎壓縮性骨折后腹脹便秘癥狀。但加味桃仁承氣湯在VILI 預(yù)防與治療中的作用尚不清楚。通過參考相關(guān)文獻(xiàn)［7-8］以及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究確定了加味桃仁承氣湯的低、高劑量，給予VILI 模型大鼠不同劑量的加味桃仁承氣湯，觀察各組療效，以探究加味桃仁承氣湯在VILI中的作用。本研究肺組織HE 染色和炎性因子檢測(cè)結(jié)果顯示，機(jī)械通氣會(huì)使肺組織出現(xiàn)損傷，出現(xiàn)一系列炎癥反應(yīng)；加味桃仁承氣湯干預(yù)后肺組織病理損傷減輕，肺損傷評(píng)分降低，肺泡腔滲出和炎癥反應(yīng)減少；機(jī)械通氣使毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞通透性增加，引起肺水腫，加味桃仁承氣湯干預(yù)后肺水腫減輕。OI 是器官組織進(jìn)行氧合作用獲得能量的一個(gè)重要指數(shù)，在一定程度上可反映肺功能。本研究發(fā)現(xiàn)中藥-H組相比Model組OI明顯提高，說明肺功能有所恢復(fù)。以上結(jié)果提示加味桃仁承氣湯可能具有減輕VILI的作用。

細(xì)胞自噬是一種機(jī)體自我調(diào)節(jié)形式，機(jī)體通過吞噬自身衰老細(xì)胞或細(xì)胞器，一定程度上減輕機(jī)體損傷［16］。Beclin1 是自噬啟動(dòng)因子，當(dāng)自噬發(fā)生，胞質(zhì)型LC3 轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w，即LC3-Ⅱ［17］。因此，本研究以Beclin1、LC3作為檢測(cè)自噬水平的主要標(biāo)志物。AMPK/mTOR 信號(hào)通路是細(xì)胞自噬的重要途徑之一，AMPK 與mTOR 均是細(xì)胞自噬過程中的重要信號(hào)分子。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，AMPK被磷酸化激活，降低mTOR 磷酸化水平［18］。本研究結(jié)果顯示，機(jī)械通氣可通過抑制AMPK/mTOR 信號(hào)通路，使肺出現(xiàn)VILI，肺泡內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，肺泡腔水腫增厚，肺泡內(nèi)有滲出，肺泡萎縮；而加味桃仁承氣湯可以減輕VILI。本研究結(jié)果顯示，機(jī)械通氣可降低肺組織中AMPK mRNA 表達(dá)和AMPK 磷酸化水平，從而負(fù)向調(diào)控使mTORC1 mRNA 表達(dá)、mTORC1 磷酸化水平升高。而加味桃仁承氣湯可通過激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路，導(dǎo)致大鼠肺組織中AMPK mRNA 表達(dá)和AMPK 磷酸化水平上升，負(fù)向調(diào)節(jié)使mTORC1 mRNA 表達(dá)、mTORC1 磷酸化水平下降。隨著AMPK/mTOR 信號(hào)通路的抑制或激活，在有無加味桃仁承氣湯干預(yù)的大鼠肺組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)也發(fā)生一定變化。Western blot 結(jié)果顯示，機(jī)械通氣可抑制細(xì)胞自噬，使Model 組大鼠肺組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 蛋白表達(dá)降低；而加味桃仁承氣湯干預(yù)后的VILI 大鼠肺組織中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 表達(dá)升高，且與低劑量加味桃仁承氣湯相比，高劑量的中藥對(duì)細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用更強(qiáng)。因此，筆者推測(cè)加味桃仁承氣湯可能通過激活A(yù)MPK/mTOR 信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞自噬，減輕大鼠VILI，而透射電鏡實(shí)驗(yàn)也得到相同的結(jié)果。以AMPK 抑制劑Compound C 干預(yù)高劑量中藥處理的大鼠后，發(fā)現(xiàn)Compound C 可減弱高劑量中藥對(duì)VILI大鼠的保護(hù)作用。

綜上所述，加味桃仁承氣湯可能通過激活A(yù)MPK/mTOR 信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞自噬，減輕大鼠VILI。本研究為VILI 臨床治療藥物研發(fā)提供了參考。然而本研究還存在不足之處，加味桃仁承氣湯減輕大鼠VILI 可能還存在其他信號(hào)通路和機(jī)制，同時(shí)，本研究?jī)H初步說明加味桃仁承氣湯對(duì)VILI 可能具有一定的緩解作用，而與臨床肺保護(hù)性通氣策略相比，何者更優(yōu)或二者聯(lián)用能否增強(qiáng)療效，還需進(jìn)一步觀察。