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    Mettl14介導(dǎo)的m6A修飾對(duì)改善心肌梗死的分子機(jī)制

    2023-12-22 01:06:48鄭學(xué)斌沙莎楊慧瓊劉戀
    實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2023年21期
    關(guān)鍵詞:微血管孵育內(nèi)皮

    鄭學(xué)斌 沙莎 楊慧瓊 劉戀

    長沙市第四醫(yī)院(湖南師范大學(xué)附屬長沙醫(yī)院)全科醫(yī)學(xué)科(長沙 410006)

    心肌梗死(myocardial infarction,MI)是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題,隨著治療策略的改進(jìn),其病死率正在下降[1]。然而,在沒有建立靶向治療的情況下,與MI相關(guān)的心力衰竭仍然是一個(gè)主要問題。心肌梗死后心臟重塑是由左心室形狀和功能的若干變化引起的,最終導(dǎo)致繼發(fā)于心臟纖維化病理變化的心力衰竭[2]。作為真核信使RNA(mRNA)最豐富的化學(xué)修飾,已知N6-甲基腺苷(m6A)通過調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)來影響各種基本的生物過程[3]。m6A水平的改變介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增殖、自我更新和發(fā)育[4]。然而,m6A甲基化在MI進(jìn)展中的潛在作用仍有待進(jìn)一步挖掘。甲基轉(zhuǎn)移酶樣14(methyltransferase-like 14,METTL14)是一種m6A寫入蛋白,廣泛參與了心血管發(fā)病機(jī)制等重大疾病的進(jìn)展[5]。最近研究證實(shí),METTL14在糖尿病性心肌病大鼠心肌組織中下調(diào),其上調(diào)通過介導(dǎo)m6A修飾活性以NLRP3依賴性方式抑制心肌細(xì)胞焦亡[6]。然而,METTL14介導(dǎo)的m6A修飾是否調(diào)節(jié)MI及其潛在機(jī)制仍然未知。在這項(xiàng)研究中,我們探索了METTL14介導(dǎo)的m6A修飾在MI中的生物學(xué)作用,并揭示了METTL14可以作為一種新的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)來阻斷MI的進(jìn)展。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物和分組處理4周大的雄性C57BL/6小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。所有小鼠都喂食標(biāo)準(zhǔn)食物和水。實(shí)驗(yàn)小鼠維持在標(biāo)準(zhǔn)條件下[在(22 ± 2)℃ 恒溫和60%濕度的房間內(nèi)],以12 h的晝夜循環(huán)為小鼠提供自由采食的食物和水。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,通過永久結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(left anterior descending,LAD)構(gòu)建MI小鼠模型[7]。假手術(shù)組進(jìn)行相同的手術(shù),但沒有結(jié)扎LAD。將小鼠用于以下實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)1考察MI對(duì)小鼠心臟組織m6A修飾水平影響。將小鼠隨機(jī)分為4組,每組10只:假手術(shù)組(Sham)、MI誘導(dǎo)后1 d組、4 d組和7 d組。實(shí)驗(yàn)2考察METTL14過表達(dá)對(duì)MI小鼠的改善作用。將小鼠隨機(jī)分為4組,每組10只:Sham+AAV9-NC組、Sham+AAV9-METTL14組、MI+AAV9-NC組和MI+AAV9-METTL14組。各組小鼠分別在MI誘導(dǎo)前1周將AAV9-METTL14或AAV9-NC通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)。MI誘導(dǎo)后4 d,收集心臟組織用于后續(xù)分析。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)長沙市第四醫(yī)院(湖南師范大學(xué)附屬長沙醫(yī)院)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào):XD-2020-12)。

    1.2 AAV9介導(dǎo)的METTL14過表達(dá)AAV9基因組顆粒獲自本元正陽基因技術(shù)有限公司。將METTL14克隆到AAV9載體(AAV9-METTL14)中,然后通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi),滴度為每g體重0.5 × 1011個(gè)載體基因組(vg/g)。以相同的劑量和時(shí)間點(diǎn)注射對(duì)照AAV9載體(AAV9-NC)。

    1.3 超聲心動(dòng)圖使用帶有MS400換能器的Vevo 2100回波在麻醉小鼠(3.0%異氟醚和1.0 L/min的O2流量)中進(jìn)行二維超聲心動(dòng)圖。計(jì)算了射血分?jǐn)?shù)(%EF) 和縮短百分比(%FS)。

    1.4 斑點(diǎn)印跡使用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)從心臟樣本和細(xì)胞中提取RNA。NanoDrop(美國Thermo Fisher Scientific公司)用于分析RNA質(zhì)量。將RNA樣品點(diǎn)樣在尼龍膜上。然后將膜放入紫外交聯(lián)劑中交聯(lián)5 min。將膜置于5%脫脂牛奶中密封2 h,加入m6A一抗4 ℃孵育過夜。第2天,應(yīng)用二抗孵育2 h。另一張膜用亞甲藍(lán)染色作為對(duì)照。

    1.5 心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)分離和分組處理根據(jù)先前的研究[8],使用CD31偶聯(lián)微珠從小鼠心肌組織中分離CMECs,并在內(nèi)皮培養(yǎng)基(ECM,美國ScienCel公司)中培養(yǎng)。為了在體外刺激缺氧缺血微環(huán)境,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行去氧葡萄糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)處理。CMECs在動(dòng)態(tài)O2和CO2分室控制器Oxycycler C42(美國Biospherix公司)中于37 ℃下培養(yǎng)24 h,氣體混合物由5% CO2和95% N2組成。將細(xì)胞分為以下兩個(gè)實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)1考察考察OGD處理對(duì)CMECs中m6A修飾水平影響,將細(xì)胞分為NC組和OGD組,NC組在正常環(huán)境下培養(yǎng),OGD組則進(jìn)行OGD處理。實(shí)驗(yàn)2考察METTL14是否通過USP48對(duì)OGD誘導(dǎo)的CMECs細(xì)胞起保護(hù)作用,將細(xì)胞分為NC組、OGD組、OGD + SgNC組、OGD + METTL14KO組和OGD +METTL14KO + USP48組。除NC組外,其余組建立OGD模型。OGD + SgNC組、OGD + METTL14KO組和OGD + METTL14KO + USP48組在建立OGD模型前48 h分別用SgNC、METTL14KO或USP48過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

    1.6 CRISPR/Cas9技術(shù)敲除CMECs中的METTL14我們?cè)O(shè)計(jì)了靶向METTL14的單向?qū)NA(METTL14KO) (http://crispr.mit.edu):mMETTL14-sgRNA:CGCTTCGCGAGAGATTGCA。sgRNA至少選擇10~15個(gè)單克隆進(jìn)行敲除檢測(cè)。接下來,設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增敲除的目標(biāo)片段并送去測(cè)序。使用Lenti-V2-GFP病毒載體構(gòu)建敲除病毒。

    1.7 免疫熒光將心臟組織在/Tween-20封閉溶液中孵育1 h。然后將樣品與一抗在4 ℃下孵育過夜,并在室溫下與適當(dāng)?shù)臒晒舛狗跤? h。細(xì)胞核用DAPI染色。用LSM700激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)捕獲圖像。免疫印跡的一抗如下:α-SMA (1∶500,英國Abcam公司)、CD31(1∶500,英國Abcam公司)和VE-Cadherin(1∶500,英國Abcam公司)。

    1.8 ROS染色檢測(cè)在等密度的6孔培養(yǎng)皿上鋪板的CMECs中測(cè)量線粒體ROS水平[9]。細(xì)胞在37 ℃下用線粒體ROS指示劑MitoSOX? Red(2 μmol/L,美國Invitrogen公司)染色15 min。使用LSM700激光掃描共聚焦顯微鏡獲得細(xì)胞圖像。

    1.9 RNA-seq和數(shù)據(jù)分析在OGD處理24 h后,收集METTL14敲低細(xì)胞及其對(duì)照用于RNA-seq。通過Oligo dT富集總RNA樣品,然后使用KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit(美國Illumina公司)構(gòu)建文庫。采用Illumina NovaSeq 6000儀器進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)Arraystar的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行小鼠m6AmRNA表觀轉(zhuǎn)錄組微陣列樣品制備和微陣列雜交。

    1.10 蛋白質(zhì)印跡將從組織和細(xì)胞中收集的蛋白通過10%~15% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜。次日,將膜與二抗一起孵育1 h,使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑(美國Millipore Sigma公司)觀察免疫反應(yīng)條帶。研究使用的一抗和二抗購自英國Abcam公司。以β-actin作為內(nèi)源性參考,使用Image J軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行量化。

    1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有結(jié)果均以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用單向方差分析進(jìn)行多重比較,組間兩兩比較使用Student-Newman-Keuls事后檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 MI和OGD誘導(dǎo)m6A修飾異常心臟組織RNA m6A修飾水平在MI誘導(dǎo)后4 d和7 d高于Sham組(圖1A)。MI誘導(dǎo)后1、4、7 d,METTL14表達(dá)降低,METTL3表達(dá)升高;其他酶(KIAA1429、WTAP、ALKBH5和FTO)沒有明顯變化(圖1B),此外,在OGD誘導(dǎo)的CMECs細(xì)胞中檢測(cè)到RNA m6A修飾水平高于NC組,并且METTL14表達(dá)降低(圖1C、D)。

    圖1 MI和OGD誘導(dǎo)m6A修飾異常Fig.1 Abnormal m6A modification induced by MI and OGD

    2.2 METTL14上調(diào)改善MI小鼠的微血管損傷和心臟功能小鼠在接受心肌MI損傷或假手術(shù)前,通過尾靜脈注射AAV9-METTL14上調(diào)心臟組織中METTL14(圖2A)。與Sham+AAV9-NC組相比,MI +AAV9-NC組小鼠心臟組織中血管內(nèi)皮連接蛋白VE-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。MI+AAV9-METTL14組小鼠心臟組織中VE-cadherin表達(dá)較MI +AAV9-NC組顯著上調(diào)(P<0.05)(圖2B)。MI+AAV9-METTL14組的射血分?jǐn)?shù)顯著高于MI+AAV9-NC組(P<0.05),和左心室尺寸低于MI +AAV9-NC組(P<0.05)(表1)。

    表1 MI后各組小鼠超聲心動(dòng)圖參數(shù)和心臟/體重的差異Tab.1 Differences of Echocardiographic Parameters and Heart/Weight of Mice in Different Groups after MI ±s

    表1 MI后各組小鼠超聲心動(dòng)圖參數(shù)和心臟/體重的差異Tab.1 Differences of Echocardiographic Parameters and Heart/Weight of Mice in Different Groups after MI ±s

    注:BW,體重;HW,心臟重量;LVDd,左心室舒張期尺寸;LVDs,左心室收縮尺寸;IVS,室間隔厚度;PW,后壁厚度;PW,后壁厚度;FS,左心室縮短率;HR,心率;與Sham+AAV9-NC組比較,*P<0.05;與MI +AAV9-NC組比較,#P<0.05

    P值0.632<0.001<0.001 0.315<0.001<0.001<0.001 0.426<0.001<0.001參數(shù)BW(g)HW(mg)HW/BW(mg/g)HR(次/min)LVDd(mm)LVDs(mm)IVS(mm)PW(mm)FS(%)EF(%)Sham+AAV9-NC組26.0 ± 1.0 156.4 ± 7.8 6.04 ± 0.33 451.7 ± 12.5 3.25 ± 0.14 2.24 ± 0.09 0.82 ± 0.03 0.77 ± 0.05 32.7 ± 1.5 61.3 ± 2.7 Sham+AAV9-METTL14組26.1 ± 0.8 154.2 ± 8.3 5.94 ± 0.58 462.2 ± 14.1 3.31 ± 0.12 2.20 ± 0.11 0.81 ± 0.02 0.76 ± 0.04 33.1 ± 1.2 62.1 ± 2.4 MI +AAV9-NC組25.9 ± 0.7 237.6 ± 1.2*9.27 ± 0.75*477.4 ± 18.1 3.96 ± 0.16*3.15 ± 0.18*0.70 ± 0.03*0.79 ± 0.03 21.3 ± 2.3*44.6 ± 4.8*MI+AAV9-METTL14組25.9 ± 0.9 186.4 ± 9.6#7.15 ± 0.66#465.3 ± 17.4 3.57 ± 0.13#2.56 ± 0.13#0.78 ± 0.04#0.78 ± 0.02 29.4 ± 2.1#58.2 ± 4.5#F值0.89 28.50 8.24 1.75 7.55 20.22 10.77 1.20 17.94 14.65

    圖2 METTL14上調(diào)改善MI小鼠的微血管損傷Fig.2 Up-regulation of METTL14 improves microvascular injury in MI mice

    2.3 METTL14上調(diào)減輕MI誘導(dǎo)的內(nèi)皮線粒體功能障礙與Sham+AAV9-NC組小鼠相比,在MI+AAV9-NC組小鼠中觀察到線粒體長度顯著縮短(P<0.05),片段化線粒體的形成顯著增加(P<0.05),同時(shí)伴隨線粒體ROS水平顯著增加(P<0.05)。AAV9-METTL14抑制了MI誘導(dǎo)的內(nèi)皮線粒體功能障礙(圖3)。

    圖3 METTL14上調(diào)減輕MI誘導(dǎo)的內(nèi)皮線粒體功能障礙Fig.3 Up-regulation of METTL14 alleviates MI-induced endothelial mitochondrial dysfunction

    2.4 METTL14介導(dǎo)USP48 mRNA的m6A修飾METTL14敲低顯著影響CMECs細(xì)胞基因的表達(dá)(圖4A)。6個(gè)轉(zhuǎn)錄本在RNA-seq和表觀轉(zhuǎn)錄組微陣列數(shù)據(jù)中重疊。將這6個(gè)轉(zhuǎn)錄本與MI心臟組織的RNA-seq進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有USP48降低,m6A甲基化水平受METTL14顯著調(diào)節(jié)并影響其表達(dá)(圖4B)。與Sham+AAV9-NC組相比,MI+AAV9-NC組小鼠心臟組織中USP48表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。MI+AAV9-METTL14組小鼠心臟組織中USP48表達(dá)較MI +AAV9-NC組顯著上調(diào)(P<0.05)(圖4C)。

    圖4 METTL14介導(dǎo)的USP48 mRNA的m6A修飾Fig.4 m6A modification of USP48 mRNA mediated by METTL14

    2.5 METTL14通過USP48對(duì)OGD誘導(dǎo)的CMECs細(xì)胞起保護(hù)作用與NC組相比,在OGD組CMECs細(xì)胞中觀察到線粒體ROS水平顯著增加(P<0.05),同時(shí)伴隨著VE-cadherin表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)和α-SMA水平顯著增加(P<0.05)。CMECs細(xì)胞中METTL14敲低加劇了這些變化(P<0.05),當(dāng)加入U(xiǎn)SP48過表達(dá)質(zhì)粒則逆轉(zhuǎn)了這些變化(P<0.05)(圖5)。

    圖5 METTL14通過USP48對(duì)OGD誘導(dǎo)的CMECs細(xì)胞起保護(hù)作用Fig.5 METTL14 protects CMECs cells induced by OGD through USP48

    3 討論

    MI引起的微血管損傷的分子機(jī)制相對(duì)復(fù)雜,因此在心臟MI損傷期間保護(hù)心臟微循環(huán)的藥物很少。m6A修飾是真核mRNA和非編碼RNA中最豐富的修飾,在各種人類疾病中發(fā)揮著重要作用,包括癌癥進(jìn)展、糖尿病、神經(jīng)發(fā)育障礙和缺血性心臟?。?0]。最新證據(jù)[11-13]表明m6A修飾與CVD的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān),包括心臟肥大、心力衰竭、缺血性心臟病等。然而,METTL14是否與心血管疾病有關(guān),例如MI,在很大程度上是未知的。在這項(xiàng)研究中,我們證明MI中m6A水平顯著增加是由于甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14的下調(diào)。METTL14上調(diào)改善MI小鼠的微血管損傷和心臟功能,與先前研究發(fā)現(xiàn)一致[14-15]。

    幾項(xiàng)研究已經(jīng)描述了METTL14在內(nèi)皮損傷中的作用,但是這些報(bào)道的結(jié)論并不一致。研究[16]表明,人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞模型中的METTL14沉默減少了鈣化并增強(qiáng)了血管修復(fù)功能。另一項(xiàng)研究[17]報(bào)道,METTL14的表達(dá)降低可以抑制內(nèi)皮炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展,表明METTL14可能作為動(dòng)脈粥樣硬化臨床治療的潛在靶點(diǎn)。然而,與m6A水平升高會(huì)導(dǎo)致許多心臟病的心臟損傷的證據(jù)相反,PANG等[18]研究發(fā)現(xiàn),在I/R損傷期間,腺病毒介導(dǎo)的METTL14過表達(dá)顯著減少了梗死面積和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,并改善了心臟功能。我們的結(jié)果與PANG等[18]發(fā)現(xiàn)一致,功能增益和功能喪失測(cè)定結(jié)果顯示,METTL14上調(diào)改善MI小鼠的微血管損傷和心臟功能,METTL14敲低則加劇了OGD誘導(dǎo)的CMECs細(xì)胞損傷。這些數(shù)據(jù)解釋了METTL14介導(dǎo)的m6A修飾對(duì)缺血性心臟的保護(hù)作用。

    據(jù)報(bào)道,線粒體損傷有助于MI誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷[19]。心肌缺血迅速增強(qiáng)線粒體裂變因子誘導(dǎo)的線粒體裂變,導(dǎo)致mtDNA損傷和內(nèi)皮氧化應(yīng)激[19]。此外,心肌缺血通過誘導(dǎo)線粒體膜高滲透性、mPTP開放和細(xì)胞色素c滲漏來激活線粒體凋亡[20]。同樣地,本研究發(fā)現(xiàn)在MI處理的CMECs中線粒體形態(tài)學(xué)發(fā)生改變,氧化應(yīng)激被誘導(dǎo),而AAV9-METTL14抑制了MI誘導(dǎo)的內(nèi)皮線粒體功能障礙。從機(jī)制上講,CMECs細(xì)胞中降低的METTL14會(huì)刺激USP48 mRNA的m6A修飾,導(dǎo)致USP48的穩(wěn)定性降低。先前研究[21]已證實(shí),USP48在肝細(xì)胞癌中的異常表達(dá)與METTL14誘導(dǎo)的m6A修飾有關(guān),該修飾影響了USP48 mRNA的穩(wěn)定性。此外,代謝是USP48消融改變的最顯著富集的途徑,即USP48的消耗增強(qiáng)了有氧糖酵解的代謝通量,同時(shí)增加了線粒體斷裂[22]。在進(jìn)一步研究中,我們發(fā)現(xiàn)USP48過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了OGD對(duì)METTL14敲低的CMECs細(xì)胞的損傷作用。這些結(jié)果表明,METTL14可能通過調(diào)節(jié)USP48的m6A修飾參與介導(dǎo)MI內(nèi)皮線粒體功能障礙。

    總之,我們的研究結(jié)果首次揭示METTL14在MI中低表達(dá),并通過增加CMECs細(xì)胞USP48的m6A修飾水平以降低其穩(wěn)定性,從而介導(dǎo)CMECs細(xì)胞線粒體功能障礙。我們的工作揭示了MI的新致病機(jī)制,并為探索有效的MI治療策略開辟了新途徑。然而,m6A穩(wěn)態(tài)是通過m6A甲基化酶復(fù)合物和去甲基化酶的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn),本研究并未闡明METTL3和METTL14的相互作用關(guān)系,及其對(duì)m6A修飾水平的影響,值得在未來的研究中做進(jìn)一步探討。

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