宮頸炎癥狀態(tài)對(duì)HPV 感染的影響研究

王嬙，宋殿榮

女性生殖道是一個(gè)開(kāi)放性腔道，其不斷暴露于內(nèi)源性和外源性微生物入侵的危險(xiǎn)環(huán)境中，極易出現(xiàn)生殖道感染。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是一種威脅女性生殖健康的性傳播病毒，主要感染宮頸上皮細(xì)胞。HPV 感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因，每個(gè)感染階段可能會(huì)受到宿主、病毒和環(huán)境因素的影響，故HPV 感染的獲得、清除、持續(xù)和進(jìn)展所涉及的因素和機(jī)制是深入研究的重點(diǎn)。陳慕璇等[1]的研究發(fā)現(xiàn)，HPV 陽(yáng)性者宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查中炎細(xì)胞浸潤(rùn)量高于HPV 陰性者。宮頸炎是臨床最常見(jiàn)的下生殖道炎癥性疾病，其特征主要表現(xiàn)為宮頸黏膜上皮的炎癥。本研究主要探討宮頸炎癥狀態(tài)對(duì)HPV 感染的影響，為控制HPV 感染提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑人正常宮頸上皮細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)CP-H059）；人正常宮頸上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)CM-H059）；1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered salin，PBS，美國(guó)康寧公司，批號(hào)21-040-CVC）；E6-c-Myc-P2A-E7-c-3Flag 基因慢病毒（山東維真生物科技有限公司，滴度5.0×108TU/mL，慢病毒活性單位為T(mén)U/mL，即每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)）；Ⅰ型鼠尾膠原（深圳立沃生物科技有限公司，批號(hào)LVCollagen001）；RNA 提取試劑盒（北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司，批號(hào)LS1040）；反轉(zhuǎn)預(yù)混液（北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司，批號(hào)A2800）；GoTaq定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）預(yù)混液（北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司，批號(hào)A6001）；人GAPDH 內(nèi)參引物（上海生工生物工程股份有限公司，批號(hào)B661104-0001）；β-actin 多克隆抗體（美國(guó)Immunoway 生物技術(shù)公司，批號(hào)YN5433）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H&L，美國(guó)Immunoway 生物技術(shù)公司，批號(hào)RS0002）；Anti-Flag 標(biāo)簽單克隆抗體（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)K200001M）；Anti-C-Myc 標(biāo)簽單克隆抗體（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)K20002M），超敏增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)P0018S）。

1.2 主要儀器實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司，型號(hào)：LightCycler480Ⅱ）；倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司，型號(hào)：Ti-S）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)：PowerPac 3000），化學(xué)發(fā)光掃描儀（上海天能科技有限公司，型號(hào)：Tanon-4800）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo) 將細(xì)胞融合率約90%的人正常宮頸上皮細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，重懸后以細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL 均勻種于Ⅰ型鼠尾膠原預(yù)包被的2 個(gè)T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。其中實(shí)驗(yàn)組中加入脂多糖（經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，脂多糖最佳濃度為1 μg/mL），對(duì)照組不加任何干預(yù)措施，均繼續(xù)培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RTqPCR）法分析白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6 和IL-17A mRNA 水平 根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，并從1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），進(jìn)行RTqPCR 檢測(cè)。以GAPDH 作為內(nèi)參，檢測(cè)IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA 的表達(dá)水平，并運(yùn)用循環(huán)閾值（2-ΔΔCt法）進(jìn)行分析，引物序列見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3 次。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.3.3 E6-c-Myc-P2A-E7-c-3Flag 基因慢病毒感染 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索確定的最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值40 計(jì)算慢病毒體積，并將5.0×108TU/mL 的E6-c-Myc-P2A-E7-c-3Flag 基因慢病毒分別加入對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中，混勻后置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。病毒感染24 h 后，用1×PBS 沖洗2 次，加入人正常宮頸上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基5 mL，置入37 ℃、5%CO2、95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；72 h 后在倒置熒光顯微鏡下觀察同一視野中熒光表達(dá)情況并拍照，采用ImageJ 軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。慢病毒體積=MOI×細(xì)胞數(shù)目/慢病毒滴度，轉(zhuǎn)染效率=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)Myc-E6、Flag-E7 標(biāo)簽蛋白的表達(dá) E6-c-Myc-P2A-E7-c-3Flag 基因慢病毒感染72 h 后提取2 組中細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行蛋白定量。取30 μg 蛋白進(jìn)行電泳，結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，在室溫下用快速封閉液封閉30 min，并在4 ℃下與一級(jí)抗體孵育過(guò)夜。使用的主要抗體為β-actin 多克隆抗體（1∶5 000）、Anti-Flag 標(biāo)簽單克隆抗體（1∶10 000）和Anti-C-Myc 標(biāo)簽單克隆抗體（1∶10 000）。次日將膜與過(guò)氧化物酶結(jié)合的二級(jí)抗體（1∶5 000）一起孵育2 h 后用超敏增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，并用化學(xué)發(fā)光掃描儀進(jìn)行檢測(cè)。以β-actin 為內(nèi)參，用ImageJ 軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度值分析，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參β-actin 的灰度值的比值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)分布且方差齊，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)或單因素方差分析。雙側(cè)檢驗(yàn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人正常宮頸上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察人正常宮頸上皮細(xì)胞呈典型的鵝卵石形態(tài)，胞體飽滿，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核清晰，可見(jiàn)明顯核仁，增殖速度較快；傳代培養(yǎng)的細(xì)胞在48 h 細(xì)胞融合率可達(dá)到90%。見(jiàn)圖1。

圖1 人正常宮頸上皮細(xì)胞形態(tài)（×10）

2.2 細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、IL-6 和IL-17A mRNA 的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中IL-6、TNF-α、IL-1β 和IL-17A mRNA 的表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 2 組宮頸上皮細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α 和IL-17A mRNA 的相對(duì)表達(dá)量 （）

表2 2 組宮頸上皮細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α 和IL-17A mRNA 的相對(duì)表達(dá)量 （）

2.3 2 組宮頸上皮細(xì)胞中形態(tài)學(xué)觀察及轉(zhuǎn)染效率的比較E6-c-Myc-P2A-E7-c-3Flag 基因慢病毒感染72 h 后，倒置熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)大量綠色熒光蛋白表達(dá)；普通倒置顯微鏡下，感染前后細(xì)胞形態(tài)相似，均呈多角形，且細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組轉(zhuǎn)染效率分別是（89.05±0.16）%和（79.30±1.97）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.966，P=0.022）。

圖2 慢病毒感染72 h 后2 組的細(xì)胞形態(tài)（×10）

2.4 2 組宮頸上皮細(xì)胞中Myc-E6、Flag-E7 標(biāo)簽蛋白的表達(dá)情況E6-c-Myc-P2A-E7-c-3Flag 基因慢病毒感染72 h 后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Myc-E6 和Flag-E7 標(biāo)簽蛋白表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表3、圖3。

圖3 2 組細(xì)胞中Myc-E6、Flag-E7 標(biāo)簽蛋白的表達(dá)

表3 2 組細(xì)胞中Myc-E6、Flag-E7 標(biāo)簽蛋白表達(dá)情況的比較 （）

注：Myc-E6 為帶Myc 標(biāo)簽的E6 蛋白；Flag-E7 為帶Flag 標(biāo)簽的E7 蛋白。

3 討論

HPV 感染是導(dǎo)致宮頸癌前病變及宮頸癌的主要原因，對(duì)宮頸病變病因的認(rèn)識(shí)為預(yù)防這種疾病提供了獨(dú)特的機(jī)會(huì)。HPV 感染具有隱匿性、復(fù)雜性和難治性等特點(diǎn)，目前仍未發(fā)現(xiàn)針對(duì)HPV 感染的特異性治療方法，因此，防治HPV 感染、消除宮頸癌是全球公共衛(wèi)生面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。HPV 主要通過(guò)性接觸傳播，但還可能存在其他影響HPV 感染的因素。Hughes等[2]的研究發(fā)現(xiàn)宮頸的特定解剖位置和性活動(dòng)增加了宮頸炎癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，因此，研究宮頸炎癥狀態(tài)對(duì)HPV 感染的影響有助于防治疾病的發(fā)生和進(jìn)展、預(yù)測(cè)個(gè)人感染HPV 的風(fēng)險(xiǎn)以及制定更有效的預(yù)防措施。

宮頸炎是婦科常見(jiàn)疾病之一。Lugo 等[3]研究發(fā)現(xiàn)宮頸炎患者的宮頸脫落細(xì)胞中IL-17A 和IL-6 水平較健康女性高，說(shuō)明宮頸炎患者的宮頸脫落細(xì)胞中存在高濃度的促炎細(xì)胞因子。促炎因子是一類(lèi)能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥過(guò)程的蛋白質(zhì)分子，但其異常的釋放可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和疾病的發(fā)展。IL-17A與各種炎癥性疾病的發(fā)生有關(guān)，其強(qiáng)大的促炎作用主要與其他促炎細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1β）的協(xié)同作用有關(guān)[4]。IL-1β、IL-6 和TNF-α 是關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，也是各種炎癥性疾病中研究最多的細(xì)胞因子。IL-1β 是應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中重要的細(xì)胞因子，具有強(qiáng)烈的促炎活性，其誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞通透性增加是導(dǎo)致上皮炎癥的重要因素[5]。IL-6 參與急性和慢性炎癥過(guò)程，并在急性到慢性炎癥的過(guò)渡以及慢性炎癥反應(yīng)的維持中起關(guān)鍵作用[6]。IL-6 可誘導(dǎo)C反應(yīng)蛋白的表達(dá)，特異性觸發(fā)CD4+T 細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的磷酸化并導(dǎo)致IL-17A 的產(chǎn)生增加[7]，還可通過(guò)激活單核細(xì)胞中的核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）來(lái)促進(jìn)TNF-α 的產(chǎn)生[8]，以及通過(guò)不同的信號(hào)傳導(dǎo)方式影響輔助性T 細(xì)胞亞群的產(chǎn)生[9]。TNF-α 是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其可通過(guò)誘導(dǎo)黏附分子的表達(dá)促進(jìn)白細(xì)胞的黏附[10]。脂多糖是革蘭氏陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)和功能成分，是體內(nèi)和體外研究中炎癥模型應(yīng)用最廣泛的一種強(qiáng)促炎劑[11]。研究發(fā)現(xiàn)脂多糖的刺激可增強(qiáng)人正常宮頸上皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)炎癥因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的表達(dá)[12]。本研究中實(shí)驗(yàn)組IL-6、TNF-α、IL-1β 和IL-17A mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組（P＜0.05），證實(shí)脂多糖可成功誘導(dǎo)宮頸上皮細(xì)胞的炎癥發(fā)生。

病毒E6 和E7 蛋白作為HPV 基因表達(dá)的生物標(biāo)志物，在HPV 感染和宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中起著核心作用。HPV E6、E7 過(guò)表達(dá)可引起細(xì)胞基因組不穩(wěn)定、持續(xù)增殖、逃避生長(zhǎng)抑制和免疫破壞、永生化、炎癥、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成以及抗細(xì)胞凋亡等，從而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。目前已鑒定出200 多種HPV亞型，其中HPV16 型在中國(guó)女性中最常見(jiàn)且致癌風(fēng)險(xiǎn)最高[13]。HPV 難以在體外分離培養(yǎng)，且缺少自然感染HPV 的細(xì)胞和動(dòng)物模型。慢病毒可以感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，并能將外源基因整合到宿主基因組上實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，是體外基因傳遞的有效工具。因此本研究運(yùn)用全基因合成HPV16 E6、E7 基因的E6-c-Myc-P2A-E7-c-3Flag 基因慢病毒分別感染實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組72 h，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)染效率高于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組中Myc-E6、Flag-E7 標(biāo)簽蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，表明宮頸炎癥狀態(tài)下HPV16 E6、E7 的表達(dá)增加。Long 等[14]采用液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查（thin-prep cytology test，TCT）檢測(cè)了46 255 名女性的宮頸細(xì)胞學(xué)異常及炎癥程度，發(fā)現(xiàn)重度炎癥組較無(wú)炎癥組的細(xì)胞學(xué)發(fā)生HSIL 的風(fēng)險(xiǎn)增加了756.47 倍（95%CI：239.07～+∞，P＜0.05）。Shen等[15]對(duì)杭州市89 例黏液膿性宮頸炎患者和217 例健康女性進(jìn)行HPV 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)黏液膿性宮頸炎患者HPV 感染率顯著高于健康女性（51.90%vs.16.70%，P＜0.05），與本研究中人正常宮頸上皮細(xì)胞處于炎癥狀態(tài)下更易感染HPV 的結(jié)果一致。

本研究在細(xì)胞水平上證實(shí)宮頸炎癥狀態(tài)下更易感染HPV，這不僅為研究有效的防治策略以降低HPV 感染相關(guān)宮頸病變發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)提供新的思路，同時(shí)還為進(jìn)一步研究宮頸疾病的病理生理特點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。此外，本研究還存在一些局限性，關(guān)于宮頸炎癥狀態(tài)如何影響HPV 感染的機(jī)制尚不清楚，今后還需進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的深入研究，以便從根本上消除宮頸癌。