外周血C3aR1及NETs表達水平對膿毒癥性凝血病的預測價值

曹銳 劉開勛 胡丹 齊共健

（徐州醫(yī)科大學附屬徐州兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學科，江蘇徐州 221002）

膿毒癥是宿主對感染的反應失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙，凝血功能障礙是其常見并發(fā)癥，合并凝血功能障礙的膿毒癥患兒病死率明顯增高［1-2］。國際血栓和止血學會（International Society on Thrombosis and Haemostasis, ISTH）于2017 年提出了膿毒癥性凝血?。╯epsis-induced coagulopathy,SIC）的定義及診斷標準，為臨床醫(yī)師及時識別SIC提供重要依據(jù)［3］。SIC是一種復雜性疾病，已有的預測指標普遍存在相對滯后及缺乏特異性等不足，探索能夠早期預測膿毒癥患兒發(fā)生SIC的生物標志物，具有十分重要的臨床價值。膿毒癥患者中凝血功能紊亂與其過激的免疫反應密切相關(guān)。研究顯示，膿毒癥所致彌散性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation, DIC）患者存在可溶性C5b-C9 水平增高，且補體的激活程度與DIC 的預后相關(guān)［4］。補體C3a 受體1（complement-3a receptor 1,C3aR1）為導致嚴重膿毒癥的樞紐基因，參與內(nèi)皮損傷和炎癥風暴發(fā)生，目前C3aR1與凝血的相關(guān)研究主要集中于冠狀動脈疾病及血栓性微血管?。?-7］。中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps, NETs）作為先天免疫應答的一部分，過度堆積可導致組織損傷及炎性血栓形成，膿毒癥患者NETs水平對預測DIC發(fā)生具有一定價值［8］。然而，當膿毒癥相關(guān)凝血功能障礙進展為DIC后，多處于不可逆階段，錯失治療干預的最佳時機。因此，本研究以免疫血栓形成機制為切入點，探討患兒外周血C3aR1和NETs水平對SIC的預測價值，以便早期識別高風險患兒，采取相應的干預措施，進而改善疾病預后。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性選取徐州醫(yī)科大學附屬徐州兒童醫(yī)院2022 年6 月—2023 年6 月收治的78 例膿毒癥患兒為研究對象。納入標準：（1）年齡6個月至14歲；（2）符合2015 年中華醫(yī)學會發(fā)布的《兒童膿毒性休克（感染性休克）診治專家共識（2015 版）》中兒童膿毒癥的診斷標準［9］。排除標準：（1）既往存在血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤病史；（2）入院前6個月內(nèi)應用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等；（3）合并其他引起血小板（platelet,PLT）減少的疾病，或服用導致PLT 減少的藥物；（4）入院后24 h 內(nèi)死亡或住院期間放棄治療；（5）患兒監(jiān)護人要求退出。本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學附屬徐州兒童醫(yī)院倫理委員會評審通過（2023-05-73-H73），經(jīng)患兒監(jiān)護人書面知情同意。

1.2 分組

依照2017 年ISTH 發(fā)布的SIC 診斷標準［3］，即（1） PLT 計數(shù)為（100～150） ×109/L 記1 分，＜100×109/L 記2 分；（2） 1.2＜國際標準化比值（international normalized ratio, INR） ≤1.4 記1 分，INR＞1.4 記2 分；（3） 兒童序貫器官衰竭評分（pediatric Sequential Organ Failure Assessment,pSOFA）≥2 記2 分，pSOFA=1 記1 分。以上3 項評分累計≥4 分診斷為SIC。將78 例膿毒癥患兒分為SIC組（36例）與非SIC組（42例）。

1.3 資料收集

收集入組患兒年齡、性別、原發(fā)感染部位、入院時體溫、入院時心率、pSOFA、PLT 計數(shù)、INR、纖維蛋白原（fibrinogen, FIB）、白細胞介素（interleukin, IL） 水平、C 反應蛋白（C-reactive protein, CRP）等數(shù)據(jù)。

1.4 C3aR1及NETs表達水平檢測

入院2 h 內(nèi)采集外周靜脈血2 mL 于EDTA 抗凝管中，離心10 min（3 500 r/min），提取上清液，以-80℃低溫凍存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿標本中C3aR1及NETs表達水平，室溫平衡20 min后，向酶標板條內(nèi)依次加入樣本、標準品、生物素化抗體，覆膜以37℃孵育1 h，移去覆膜洗板3 次，加酶結(jié)合物工作液，以37℃孵育30 min，洗板5 次，加底物，以37℃孵育15 min，取出酶標板加終止液，以酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度，計算樣本濃度。試劑盒由上海江萊生物科技有限公司提供，該試劑盒C3aR1 測定范圍為0.15～10 ng/mL，NETs測定范圍為0.625～40 ng/mL。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（Q1，Q3）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率（%）描述，組間比較采用卡方檢驗。采用多因素logistic回歸分析篩選與SIC發(fā)生相關(guān)的危險因素。繪制受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC 曲線）分析C3aR1、NETs 對SIC 的預測價值，采用MedCalc 20.1.0 軟件對各指標曲線下面積（area under the cure, AUC）進行Z檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較

兩組患兒年齡、性別、原發(fā)感染部位、入院時體溫、入院時心率、pSOFA 評分比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組基線資料比較

2.2 兩組實驗室數(shù)據(jù)比較

SIC組患兒INR、CRP、IL-6、IL-10、C3aR1及NETs 水平高于非SIC 組，PLT 計數(shù)低于非SIC 組（P＜0.05）。兩組患兒FIB、IL-2 及IL-4 水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組實驗室數(shù)據(jù)比較 ［M（Q1，Q3）］

2.3 影響SIC發(fā)生的多因素logistic回歸分析

納入CRP、IL-6、IL-10、C3aR1 及NETs 進行多因素logistic 回歸分析，結(jié)果顯示C3aR1、NETs及IL-6 升高與SIC 發(fā)生密切相關(guān)（P＜0.05），見表3。

表3 影響SIC發(fā)生的多因素logistic分析

2.4 ROC曲線分析

C3aR1、NETs及IL-6預測SIC發(fā)生的AUC值分別為0.779、0.870 和0.760（P＜0.05）。當C3aR1 取最佳截斷值4.866 ng/mL時，靈敏度和特異度分別為72.2%和81.0%；當NETs取最佳截斷值8.650 ng/mL時，靈敏度和特異度均為83.3%；當IL-6取最佳截斷值57.800 pg/mL 時，靈敏度和特異度分別為72.2%和76.2%。C3aR1 聯(lián)合NETs 預測SIC 的AUC為0.913，靈敏度為83.3%，特異度為95.2%。C3aR1聯(lián)合NETs預測SIC的AUC高于C3aR1、IL-6的AUC （分別Z=2.039，P=0.041；Z=2.791，P=0.006），與NETs AUC 比較差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.733，P=0.083）。見表4。

表4 C3aR1、NETs及IL-6預測SIC的ROC曲線分析

3 討論

SIC是膿毒癥患者的常見并發(fā)癥，部分患兒可迅速進展為DIC，最終導致多臟器衰竭甚至死亡［10］。SIC的發(fā)病機制復雜，凝血系統(tǒng)的紊亂與炎癥反應、補體系統(tǒng)的異常激活密切相關(guān)［11］。早期凝血紊亂具有隱匿性，目前缺乏早期預測凝血障礙發(fā)生的生物學指標［12］。因此，尋找早期預測SIC發(fā)生的生物學指標具有重要臨床價值。

發(fā)生膿毒癥時，過敏毒素（C3a 和C5a）大量釋放會導致炎癥風暴及內(nèi)皮損傷，與凝血功能障礙密切相關(guān)［13-14］。在炎癥反應過程中，C3aR1與補體C3a特異性結(jié)合，通過PLC-PKC信號通路引起細胞內(nèi)鈣流的改變，發(fā)揮趨化效應，誘導端粒酶釋放及氧自由基的產(chǎn)生，介導血管內(nèi)皮細胞損傷，促進血栓形成［15-16］，推測C3aR1的高表達與SIC的發(fā)生具有一定關(guān)系。NETs 是中性粒細胞接受刺激后形成釋放的胞外結(jié)構(gòu)［17］，Varjú 等［18］證實，NETs 及其組分可直接參與血凝塊的形成并改變血凝塊中纖維蛋白的結(jié)構(gòu)，降低血凝塊對組織型纖溶酶原激活物的敏感性，發(fā)揮抑制纖溶作用。Pieterse 等［19］發(fā)現(xiàn)，膿毒癥中NETs 過度產(chǎn)生可能導致細胞毒性而損傷內(nèi)皮細胞。由此推測NETs 在SIC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究受試者為兒童，故采用pSOFA 量表，評價膿毒癥患兒的疾病嚴重程度和器官損傷情況［20］。

本研究中，SIC 組C3aR1 和NETs 水平高于非SIC組，多因素logistic回歸分析顯示C3aR1、NETs與SIC 的發(fā)生密切相關(guān)。Propson 等［21］研究證實，內(nèi)皮細胞中激活的C3a-C3aR1信號轉(zhuǎn)導可以引起淋巴細胞浸潤，觸發(fā)血管細胞黏附分子1 的分泌增加，由此分析C3aR1 的高表達可能通過促進血管功能的炎癥轉(zhuǎn)變，導致SIC的發(fā)生。Sauter 等［6］研究表明在冠狀動脈疾病中，C3aR1表達與血栓中活化PLT 表面糖蛋白IIb/IIIa 受體的共表達呈強正相關(guān)，C3aR1通過調(diào)節(jié)Ras相關(guān)蛋白1b的激活促進血栓形成，膿毒癥過程中同樣存在過激的炎癥反應與內(nèi)皮損傷，提示C3aR1可能通過誘導PLT過度活化、激活與血栓形成相關(guān)的細胞信號通路，增加SIC發(fā)生的風險。Abrams等［8］研究發(fā)現(xiàn)，DIC患者血漿誘導的NETs 形成顯著高于非DIC 患者，本研究結(jié)果與之相符。Alsabani 等［22］通過動物實驗顯示抑制CXC 趨化因子受體1/2 減少NETs 的生成可以降低膿毒癥小鼠血管功能障礙的發(fā)生。由此可見NETs 過度釋放可導致血管內(nèi)皮損傷，促進PLT聚集和免疫血栓形成，增加SIC發(fā)生的風險。

進一步繪制ROC曲線評估C3aR1、NETs及IL-6對SIC的預測價值，結(jié)果顯示C3aR1聯(lián)合NETs預測SIC 的價值高于C3aR1 與IL-6 單獨檢測，與NETs單獨預測價值相當。魯海艷等［23］發(fā)現(xiàn)IL-6在預測膿毒癥并發(fā)凝血功能障礙中的AUC 為0.716，其特異度為87.5%，本研究結(jié)果與之相似。俞秋興等［24］研究顯示，NETs相關(guān)標志物預測膿毒癥相關(guān)凝血功能障礙的AUC 可達0.97，本研究結(jié)果與之相符，均提示NETs 在預測膿毒癥并發(fā)的凝血性疾病中的重要價值。本研究采用的是SIC 診斷標準，Yamakawa 等［25］研究表明SIC 相較膿毒癥相關(guān)凝血功能障礙更有益于指導膿毒癥早期抗凝治療。

綜上所述，SIC 中C3aR1 及NETs 表達水平顯著增高，檢測C3aR1 及NETs 水平對預測SIC 發(fā)生具有重要臨床價值。本研究作為一項單中心前瞻性研究，樣本量數(shù)量偏少，有待進一步擴大樣本量完善研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。