支氣管肺泡灌洗液宏基因組二代測序在兒童難治性肺炎診治中的應(yīng)用

馮榮光 周麗巖 竇蕊 周雪原 王莉榮 韓麗紅 王育民

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院兒內(nèi)科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010）

難治性肺炎（refractory pneumonia, RTP）是指經(jīng)過積極抗感染治療后沒有明顯改善甚至病情惡化，并且預(yù)后較差的嚴(yán)重肺炎［1］，臨床表現(xiàn)多樣，易發(fā)生胸腔積液、肺膿腫、肺壞死及肺不張等嚴(yán)重并發(fā)癥。2019 年《中國兒童難治性肺炎呼吸內(nèi)鏡介入診療專家共識》［2］中提出，療效不佳、吸收緩慢甚至久治不愈以及出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥的肺炎可以被納入RTP 的范疇。近年來由于抗生素濫用、感染病原體的進化和變異、新型病原體不斷產(chǎn)生、混合感染率以及細菌耐藥性持續(xù)增加等多種因素的作用，RTP發(fā)生率明顯升高，同時因疑難危重感染所導(dǎo)致的膿毒血癥、呼吸衰竭等造成兒童患者病死率較高，RTP成為兒童呼吸系統(tǒng)疾病診治中的難點。宏基因組二代測序（metagenomic nextgeneration sequencing, mNGS）是20 世紀(jì)發(fā)展起來的新一代檢測技術(shù)，利用幾乎所有病原體都含有DNA 或RNA 的共性，直接從臨床標(biāo)本中提取微生物核酸進行大規(guī)?；蚪M測序，將樣本中的微生物和宿主遺傳物質(zhì)進行綜合分析［3］，并與已知微生物數(shù)據(jù)庫對比從而得出感染病原體的種類及序列數(shù)。mNGS包含了標(biāo)本中所有微生物的基因信息總和，對新發(fā)及臨床未知的病原體檢測具有重要意義［4］，彌補了傳統(tǒng)檢測法的不足，近年來在成人和兒童感染性疾病中逐漸得到應(yīng)用［5-6］。本研究旨在探討mNGS 與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法對于兒童RTP病原學(xué)診斷的臨床價值，盡早明確病原體，從而更精準(zhǔn)地指導(dǎo)臨床用藥。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性選取2020年1月—2023年3月內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院兒內(nèi)科收治的RTP住院患兒160例為研究對象，結(jié)合患兒的病情及家屬對mNGS的檢測意愿分為mNGS 組（80 例）和傳統(tǒng)檢測組（80例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《中國兒童難治性肺炎呼吸內(nèi)鏡介入診療專家共識》［2］中RTP 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡28 d至14歲；（3）久治不愈的肺炎，即抗感染治療＞2周，經(jīng)積極治療無效，臨床癥狀、體征及影像學(xué)無明顯改善或加重；（4）吸收緩慢的肺炎，即在使用抗感染治療后癥狀、體征有好轉(zhuǎn)，但2周后復(fù)查影像學(xué)病灶吸收＜50%，遷延不愈者；（5）重癥肺炎，即出現(xiàn)嚴(yán)重通氣和/或換氣功能障礙或肺內(nèi)外并發(fā)癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病歷資料不全者；（2）嚴(yán)重的肺部及全身基礎(chǔ)疾病者；（3）非感染性肺炎者；（4）存在支氣管鏡檢查禁忌證者。

本研究通過內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)（［2021］倫審第［079-2］號），患兒監(jiān)護人同意入組并簽署知情同意書。

1.2 病原檢測

兩組患兒入院后均予完善炎癥指標(biāo)檢測及傳統(tǒng)病原學(xué)檢測。傳統(tǒng)病原學(xué)檢測包括：微生物培養(yǎng)（吸痰管采集痰液標(biāo)本）、呼吸道病原核酸檢測、血清學(xué)檢測（支原體、結(jié)核、真菌）。mNGS組完善支氣管鏡檢查后留取支氣管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid, BALF）標(biāo)本同時送檢mNGS和微生物培養(yǎng)。

mNGS 使用QIAamp?UCP 病原體DNA 試劑盒（德國，Qiagen）從所有樣品中提取DNA；使用Benzonase（德國，Qiagen）和Tween20（德國默克，Sigma）去除部分人源DNA。使用QIAamp?病毒RNA 試劑盒（德國，Qiagen）提取總RNA，用Ripo-Zero rRNA Removal Kit（美國，Illumina）去除核糖體RNA，并利用逆轉(zhuǎn)錄酶和脫氧核糖核苷三磷酸（美國，Thermo Fisher）生成cDNA。使用Nextera XT DNA文庫制備試劑盒（美國，Illumina）構(gòu)建DNA和cDNA樣本文庫。然后將構(gòu)建好的文庫加載到Illumina Nextseq CN500 測序儀上進行測序。刪除重復(fù)、短的和低質(zhì)量序列數(shù)，使用Burrows-Wheeler Aligner 軟件將測序數(shù)據(jù)中人源序列數(shù)據(jù)人類參考基因組（hg38）比對并進行識別和排除。從美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information）核苷酸和基因組數(shù)據(jù)庫中選擇具有代表性的微生物基因組作為數(shù)據(jù)庫搭建基礎(chǔ)（細菌、病毒、真菌、寄生蟲、支原體、衣原體等），獲取所有可能感染的病原微生物種類及相對豐度等數(shù)據(jù)。根據(jù)患兒其他病原體檢測結(jié)果、臨床癥狀及藥物治療反應(yīng)，綜合評估m(xù)NGS報告中的病原微生物是否與該患兒臨床癥狀相關(guān)。

1.3 療效判斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)患兒臨床癥狀的改善、白細胞、C反應(yīng)蛋白等炎癥指標(biāo)的恢復(fù)程度以及復(fù)查胸部影像學(xué)的吸收情況評價臨床療效。顯效：臨床癥狀消失，炎癥指標(biāo)恢復(fù)正常，影像學(xué)提示肺實變好轉(zhuǎn)面積≥80%病變區(qū)域；有效：臨床癥狀消失，炎癥指標(biāo)恢復(fù)正常，影像學(xué)提示肺實變好轉(zhuǎn)面積≥50%病變區(qū)域；無效：臨床癥狀及體征改善不明顯，肺實變好轉(zhuǎn)面積≤30%病變區(qū)域［7］。總體有效=顯效+有效。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（Q1，Q3）］ 表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗，采用McNemar 檢驗分析mNGS 檢測與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測病原學(xué)陽性率的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒基本資料比較

mNGS組和傳統(tǒng)檢測組患兒年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、早產(chǎn)或低出生體重、先天性心臟病、氣道或肺結(jié)構(gòu)異常方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患兒基本資料比較

2.2 兩組病原體檢測情況

mNGS組檢出病原體53種，共199株，其中細菌76株，病毒83株，真菌18株，特殊病原體（包括支原體、衣原體、結(jié)核分枝桿菌）22株。傳統(tǒng)檢測組檢出病原體26 種，共98 株，包括細菌52 株，病毒21株，真菌3株，特殊病原體22株。見表2。

表2 兩組病原體檢出情況 ［株（%）］

mNGS組陽性74例（92%），其中混合感染比例為61%（49/80），以細菌+病毒感染為主（21%，17/80）；單一感染比例為31%（25/80），以特殊病原體為主（14%，11/80）。傳統(tǒng)檢測組陽性65 例（81%），其中混合感染比例為31%（25/80），以細菌+特殊病原體為主（10%，8/80）；單一感染比例為50% （40/80），以細菌為主（30%，24/80）。見表3。

表3 兩組單一感染和混合感染情況比較 ［例（%）］

mNGS 組患兒支氣管肺泡灌洗液同時送檢mNGS 及微生物培養(yǎng)法，mNGS 陽性率為92%（74/80），高于微生物培養(yǎng)法陽性率（58%，46/80），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。若以微生物培養(yǎng)法陽性作為病原學(xué)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，mNGS 診斷靈敏度為98%，特異度為15%，陽性預(yù)測值為61%，陰性預(yù)測值為83%。見表4。

表4 mNGS組患兒mNGS與微生物培養(yǎng)法陽性結(jié)果比較（例）

2.3 兩組治療情況比較

mNGS組總體有效率高于傳統(tǒng)檢測組，住院期間并發(fā)癥發(fā)生率低于傳統(tǒng)檢測組（P＜0.05），見表5。

表5 兩組患兒治療情況比較 ［例（%）］

mNGS組中有68例患兒根據(jù)mNGS結(jié)果進行了治療調(diào)整，調(diào)整后總體有效率為96%（65/68），見表6。

表6 68例mNGS組患兒調(diào)整藥物方案情況 ［例（%）］

3 討論

RTP是兒童呼吸系統(tǒng)疾病中導(dǎo)致患兒死亡的主要原因，發(fā)生機制中感染占主要因素。目前臨床上病原檢測以微生物培養(yǎng)法、呼吸道病原核酸檢測等最為廣泛，但因培養(yǎng)時間長、易受上呼吸道定植菌污染及抗生素濫用等特性［8］，降低了病原體檢出率，延誤最佳治療時機。而mNGS是以群落為背景研究微生物種群的檢測技術(shù)，通過提取微生物的遺傳物質(zhì)來研究環(huán)境中的微生物多樣性，相比于微生物培養(yǎng)法及PCR 核酸擴增技術(shù)等具有測序迅速、覆蓋廣、靈敏度高、無偏移的特點［9］，且臨床藥物包括抗生素和糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用對其結(jié)果產(chǎn)生的影響較?。?0］，近年來逐漸應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)等多種臨床感染性疾病中。

有研究認(rèn)為相對于傳統(tǒng)病原學(xué)檢測，mNGS可顯著提高兒童下呼吸道感染性疾病的病原體檢出率。本研究中mNGS 組共檢出53 種病原體，而傳統(tǒng)檢測組應(yīng)用了微生物培養(yǎng)、呼吸道病原核酸檢測、血清學(xué)檢測3 種傳統(tǒng)檢測方法共檢出26 種病原體，與何邦立等［11］、唐青等［12］的研究結(jié)果相近。將mNGS 組患兒的BALF 標(biāo)本同時進行mNGS和微生物培養(yǎng)，mNGS陽性率為92%，顯著高于微生物培養(yǎng)法陽性率58%，與既往報道結(jié)果［13-15］接近。mNGS 診斷靈敏度為98%，特異度為15%，陽性預(yù)測值為61%，陰性預(yù)測值為83%，與Miao等［16］的研究相差較大，可能與本研究樣本量較小有關(guān)。既往研究表明，RTP 患兒通常存在混合感染［17］。本研究對比兩組患兒病原體檢出情況，mNGS結(jié)果多為混合感染，而傳統(tǒng)檢測大多只能檢出單種病原體，這與mNGS 的測序優(yōu)勢有關(guān)。mNGS可以發(fā)現(xiàn)如星座鏈球菌、分枝桿菌、真菌等較多傳統(tǒng)檢測不能檢出的罕見微生物信息，對于混合感染患兒的病原學(xué)診斷率較高。然而本研究也發(fā)現(xiàn)，部分患兒的mNGS結(jié)果與其臨床表現(xiàn)并不完全相符。有文獻指出，mNGS雖覆蓋率廣泛，但其將呼吸道內(nèi)的定植菌及自身的某些宿主基因一并涵蓋其中，這也造成了對結(jié)果解讀的偏差，導(dǎo)致該項技術(shù)的應(yīng)用存在較大爭議［18］。本研究兩組真菌類檢出情況差異較為明顯，在臨床中采用傳統(tǒng)方法確診真菌感染通常較為困難，但近年來肺部真菌感染患兒較以往增加，尤其是在患有先天性心臟病、氣道發(fā)育不良等基礎(chǔ)疾病的患兒中真菌陽性率顯著高于無基礎(chǔ)疾病患兒，并且免疫系統(tǒng)受損患兒肺部感染真菌后通常病情進展較快，病死率較高［19］。mNGS相對于傳統(tǒng)檢測可以顯著提高真菌類病原的檢出率，縮短檢測時間，幫助此類患兒盡早明確感染原因，避免延誤治療［20］。

明確感染病原體的最終目的是輔助RTP 的病因治療，本研究mNGS組中68例患兒根據(jù)mNGS結(jié)果調(diào)整了治療，其中65例調(diào)整后顯效或有效，3例無效（1例放棄治療，1例轉(zhuǎn)院，1例存在嚴(yán)重后遺癥），治療總體有效率為96%，與崔鳳婷等［21］、鈕月英等［22］的研究一致。本研究發(fā)現(xiàn)mNGS 組總體有效率顯著高于傳統(tǒng)檢測組，且在住院期間的并發(fā)癥發(fā)生率顯著低于傳統(tǒng)檢測組，提示mNGS相對于傳統(tǒng)檢測法可以早期發(fā)現(xiàn)感染病原體，幫助臨床醫(yī)師精確指導(dǎo)治療，減少并發(fā)癥，縮短病程，改善預(yù)后。

但目前該技術(shù)仍存在很多不足，包括對數(shù)據(jù)庫的選擇沒有全面統(tǒng)一的參考，對報告結(jié)果的解讀缺乏標(biāo)準(zhǔn)的指南或共識，以及宿主背景核酸的干擾等，導(dǎo)致其準(zhǔn)確性和可信性尚存在一定爭議，且目前該項目的檢查費用相對較高，亦導(dǎo)致其在臨床中的應(yīng)用受到很大的限制。

總之，mNGS可在呼吸系統(tǒng)感染性疾病尤其是RTP中發(fā)揮不可替代的作用，其對于呼吸道感染性疑難重癥的病原學(xué)診斷，尤其對于新發(fā)和臨床未知的病原體的檢測具有重要意義。能夠有效幫助兒科醫(yī)生盡早識別病原體，使患兒得到精準(zhǔn)治療，提高治愈率。對于難以明確感染微生物以及存在基礎(chǔ)疾病的免疫系統(tǒng)受損RTP 患兒，應(yīng)盡早完善mNGS查找病原，早期診斷，早期治療，減少并發(fā)癥和后遺癥，降低病死率。但對于mNGS結(jié)果的解讀需結(jié)合具體臨床資料判定。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。