曹越 高帥 羅剛 趙水炎 唐雅琪 杜占慧 泮思林
(青島大學附屬婦女兒童醫(yī)院心臟中心,山東青島 266034)
川崎?。↘awasaki disease, KD)是一種急性全身性非特異性血管炎,1967 年由日本醫(yī)生川崎富作首次報道,主要臨床特征包括發(fā)熱、皮疹、頸部淋巴結(jié)非化膿性腫大等癥狀[1]。KD 最嚴重的并發(fā)癥是冠狀動脈損傷(coronary artery lesion, CAL),如未得到及時有效的治療,CAL 的發(fā)生率可高達15%~25%,即使接受靜脈注射免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin, IVIG)及阿司匹林治療,CAL 的風險仍高達4%[2]。長期以來,對KD所致CAL 形成的病理生理學過程中分子機制尚未明確了解。持續(xù)性的亞急性和慢性血管炎可導致長期的血管改變和重塑,炎癥對KD血管內(nèi)皮細胞造成嚴重和持續(xù)的損害可能是重要原因[3]。因此,深入了解KD的血管內(nèi)皮細胞炎性損傷機制,是防治KD早期CAL的關鍵領域之一。
殼多糖酶3 樣蛋白1(chitinase 3-like protein 1,CHI3L1)是一種炎癥性糖蛋白,在急性、慢性和亞臨床炎癥條件下由各種細胞分泌[4]。據(jù)報道,血清CHI3L1 水平升高參與調(diào)節(jié)多個關鍵生物過程,包括炎癥激活、氧化損傷及細胞凋亡等[5]。CHI3L1 在多種炎癥性疾病中都發(fā)揮著重要作用,多項研究證實,CHI3L1 可能通過介導炎性損傷參與冠狀動脈粥樣硬化的進展情況[6-8]。然而,目前尚未明確CHI3L1 是否在KD 患兒CAL 的發(fā)生、發(fā)展中起作用。本研究旨在分析干酪乳桿菌細胞壁成分(Lactobacillus caseicell wall extract, LCWE)誘導下的KD 樣血管炎小鼠模型中CHI3L1 的表達情況,初步探討CHI3L1 在KD 所致CAL 中的作用及其潛在機制。
CP100NX 超速離心機購于日本Himac 公司,超聲破碎儀購于寧波新芝生物科技股份有限公司,多功能酶標儀購于美國Perkin Elmer 股份有限公司。干酪乳桿菌菌種購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院,糖類總量定量檢測試劑盒購于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司,十二烷基硫酸鈉(SDS)、核糖核酸酶(ribonuclease, RNase)、脫氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonuclease Ⅰ, DNase Ⅰ)、胰蛋白酶、MRS 肉湯培養(yǎng)基購于北京索萊寶科技有限公司,軟骨糖蛋白39(CHI3L1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)購于武漢云克隆科技股份有限公司,兔抗CHI3L1、鼠抗Bcl-2 抗體購于英國Affinity 公司,鼠抗α-SMA、兔抗α-SMA、鼠抗VE cadherin、兔抗Bax、兔抗Caspase-3 抗體購于美國Abcam 公司,兔抗NF-κB、兔抗p-NF-κB 抗體購于美國Cell Signaling Technology 公司,鼠抗CHI3L1、兔抗vWF、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG 購于武漢三鷹生物技術有限公司,鼠抗β-tubulin 抗體購于上海Abmart 公司,Alexa Fluor 488 標記羊抗鼠IgG、Alexa Fluor 647 標記羊抗兔IgG 購于美國Abcam公司。
根據(jù)文獻提供的造模方法[9],將干酪乳桿菌菌種接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中,在37°C厭氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h,經(jīng)離心和棄去上清的步驟,得到菌體沉淀物。向沉淀物中加入4% SDS 并在室溫過夜,隨后進行離心和洗滌,去除SDS及細菌碎片,再次得到沉淀物。向其中依次分別加入RNase、DNaseⅠ、胰蛋白酶消化處理,每一步消化后離心棄去上清,最后用PBS重懸沉淀,經(jīng)超聲破碎和超速離心處理后,取上清即為LCWE。使用糖類總量定量檢測試劑盒測定LCWE 含量,調(diào)整濃度為1 mg/mL,用于后續(xù)實驗。
SPF 級雄性C57BL/6 小鼠20 只,4 周齡,體重20~25 g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[動物合格證號:SCXK(魯)20200009]。本研究已經(jīng)通過青島大學倫理委員會審核批準(動物實驗倫理號:202304C5712202306069)。所有小鼠適應性喂養(yǎng)1周后,將實驗動物按隨機數(shù)目表法分配原則分為正常對照組及模型組,每組10 只。模型組小鼠單次腹腔注射LCWE 0.5 mL,對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。分別在注射完后的第3天、第7 天和第14 天觀察小鼠的一般情況,并在第14天時對小鼠進行稱重。
兩組小鼠完成腹腔注射14 d后,采用4%水合氯醛溶液(0.1 mL/10 g)腹腔注射對小鼠進行麻醉,腹主動脈取血0.5 mL,2 000 r/min離心20 min,分離血清,置于-80°C保存,用于后續(xù)生化指標檢測。處死小鼠,在解剖板上固定小鼠四肢,沿前正中線剪開皮膚,依次剖開胸腔、腹腔,分離取出心臟組織與脾臟組織,在大體顯微鏡下,小心夾取冠狀動脈根部,從心臟表面緩慢逆行剝脫冠狀動脈組織。一部分冠狀動脈組織及脾臟組織采用4%多聚甲醛溶液進行固定,置于室溫保存,行組織病理學檢測;另一部分冠狀動脈組織置于-80°C冰箱凍存,以備后續(xù)實驗使用。
取小鼠冠狀動脈組織及脾臟組織樣品后經(jīng)梯度濃度乙醇脫水,再置于二甲苯溶液中透明,之后置于石蠟中包埋。將其切成厚度為3~5 μm 的切片,進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色,在光學顯微鏡下觀察,采集圖像并分析。
取出-80°C中保存的小鼠血清,按說明書要求進行檢測,根據(jù)標準曲線和吸光度(OD)值計算CHI3L1含量。
采用免疫熒光雙染色法通過標記α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)來檢測各組小鼠冠狀動脈組織內(nèi)皮標記物血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)和CHI3L1的表達。冠狀動脈組織經(jīng)多聚甲醛固定,石蠟包埋后切片,石蠟切片脫蠟前需放在60°C恒溫箱中烘烤2 h,經(jīng)過脫蠟、水化、抗原修復后,內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育20 min,10%正常羊血清室溫封閉20 min,分別加入一抗鼠抗CHI3L1(1∶100)、兔抗α-SMA(1∶100)和兔抗vWF(1∶100)、鼠抗α-SMA(1∶200)4℃孵育過夜,次日對應加入二抗Alexa Fluor 647 標記羊抗兔IgG (1∶100)、Alexa Fluor 488 標記羊抗鼠IgG(1∶100)室溫避光孵育2 h,滴上DAPI染色,用載玻片封片,在正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。
取-80°C中保存的冠狀動脈組織,研磨后加入組織裂解液,離心后取上清液并使用BCA 法測定蛋白濃度。取待測蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后封閉,分別加入一抗兔抗CHI3L1(1∶1 000)、兔抗vWF (1∶1 000)、鼠抗VE cadherin(1∶1 000)、兔抗Bax(1∶1 000)、鼠抗Bcl-2(1∶1 000)、兔抗Caspase-3(1∶1 000)、兔抗NF-κB(1∶1 000)、兔抗p-NF-κB(1∶1 000)、鼠抗β-tubulin(1∶1 000)4℃孵育過夜,次日對應加入二抗山羊抗兔IgG(1∶2 000)、山羊抗鼠IgG (1∶2 000) 室溫孵育1 h,ECL 顯影。用Image J 分析軟件分析各條帶灰度值,以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白β-tubulin 灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗獨立重復至少3次。
采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(xˉ±s)表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
腹腔注射LCWE 3 d 后,與對照組相比,模型組小鼠出現(xiàn)毛發(fā)干枯,反應遲緩,飲食能力下降;7 d 后有個別小鼠肢端出現(xiàn)充血腫脹,鼠尾壞死。模型組小鼠體重[(21.0±0.8) g] 較對照組[(24.2±1.5)g]下降(t=6.025,P<0.001,n=10)。
對照組小鼠冠狀動脈組織內(nèi)膜光滑完整,內(nèi)皮細胞排列整齊,周圍無炎性細胞浸潤;而模型組小鼠冠狀動脈組織內(nèi)膜欠光滑,內(nèi)皮細胞排列紊亂,周圍有大量炎性細胞浸潤。對照組小鼠脾小體結(jié)構(gòu)完整,未見增生;而模型組小鼠脾臟組織中出現(xiàn)脾小體增生、融合。見圖1。
圖1 冠狀動脈及脾臟組織HE染色結(jié)果(光學顯微鏡;n=4) 對照組小鼠冠狀動脈組織內(nèi)膜光滑完整,內(nèi)皮細胞排列整齊,周圍無炎性細胞浸潤。模型組小鼠冠狀動脈組織內(nèi)膜欠光滑,內(nèi)皮細胞排列紊亂,周圍有大量炎性細胞浸潤。對照組小鼠脾小體結(jié)構(gòu)完整,未見增生。模型組小鼠脾臟組織中出現(xiàn)脾小體增生、融合。
模型組血清CHI3L1含量[(4.0±0.7)ng/mL]較對照組[(1.9±0.5)ng/mL]顯著升高(t=7.192,P<0.001,n=8)。
免疫熒光染色結(jié)果顯示,紅色為vWF 染色,綠色為α-SMA染色,藍色為DAPI染色。α-SMA是血管平滑肌的標志物之一,可有效定位血管的結(jié)構(gòu)和分布情況。模型組小鼠冠狀動脈組織中vWF表達較對照組降低。見圖2。
圖2 兩組小鼠冠狀動脈組織中vWF表達(正置熒光顯微鏡,×40;n=4) 紅色為vWF染色,對照組可見明顯紅色熒光,模型組紅色熒光表達不明顯;綠色為α-SMA染色,兩組均可見明顯綠色熒光;藍色為DAPI核染色。模型組小鼠冠狀動脈組織中vWF表達較對照組降低。
免疫熒光染色結(jié)果顯示,綠色為CHI3L1染色,紅色為α-SMA染色,藍色為DAPI染色。模型組小鼠冠狀動脈組織中CHI3L1表達較對照組升高。見圖3。
圖3 兩組小鼠冠狀動脈組織中CHI3L1表達(正置熒光顯微鏡,×40;n=4) 綠色為CHI3L1染色,對照組綠色熒光不明顯,模型組可見明顯綠色熒光;紅色為α-SMA染色,兩組可見明顯紅色熒光;藍色為DAPI核染色。模型組小鼠冠狀動脈組織中CHI3L1表達較對照組升高。
Western blot 結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組冠狀動脈組織中CHI3L1 蛋白表達水平升高(P<0.05),而內(nèi)皮標志物蛋白vWF 及VE cadherin 蛋白表達水平降低(P<0.05)。見表1、圖4。
圖4 兩組小鼠冠狀動脈組織中CHI3L1及內(nèi)皮標志物蛋白表達條帶圖
Western blot 結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組冠狀動脈組織中Bax、Caspase-3蛋白表達水平升高(P<0.05),Bcl-2 蛋白表達水平降低(P<0.05)。見表2、圖5。
表2 兩組小鼠冠狀動脈組織中細胞凋亡相關蛋白表達水平比較 (xˉ±s,n=6)
圖5 兩組小鼠冠狀動脈組織中細胞凋亡相關蛋白表達條帶圖
Western blot 結(jié)果顯示,與對照組(0.45±0.09)比較,模型組(0.81±0.06)冠狀動脈組織中NFκB蛋白表達水平升高(t=5.851,P=0.004,n=6);與對照組(0.37±0.15)比較,模型組(1.69±0.12)冠狀動脈組織中p-NF-κB 蛋白表達水平升高(t=11.996,P<0.001,n=6)。見圖6。
圖6 兩組小鼠冠狀動脈組織中NF-κB、p-NF-κB蛋白表達條帶圖
KD 是一種以發(fā)熱為主要癥狀的全身性血管炎性疾病,常見于5 歲以下的兒童[10]。該疾病常引起冠狀動脈擴張甚至冠狀動脈瘤的形成,并可導致遠期的心血管后遺癥。在西方發(fā)達國家及我國大部分地區(qū),CAL 已成為后天獲得性心臟病的主要病因[11]。盡管目前IVIG 被廣泛用于KD 患兒,10%~20%的KD 患兒對IVIG 治療無應答,仍有進展為CAL的風險[12]。近年來,針對KD冠狀動脈內(nèi)皮細胞損傷的機制研究成為防治KD血管并發(fā)癥的理想策略。炎性介質(zhì)(如白細胞介素1、白細胞介素6、腫瘤壞死因子α 和NF-κB)促進炎癥和組織破壞,已成為KD患者CAL中發(fā)生內(nèi)皮細胞功能障礙的重要因素[13]。因此,探討KD相關炎性因子的作用機制,對精準抗炎治療和改善CAL 的預后尤為重要。
CHI3L1 屬于糖苷水解酶家族18,也被稱為YKL-40[14]。該蛋白能夠結(jié)合殼聚糖、肝素和透明質(zhì)酸,并受到細胞外基質(zhì)變化、細胞因子、生長因子、藥物以及應激的調(diào)控。CHI3L1 由多種細胞產(chǎn)生和分泌,包括巨噬細胞、中性粒細胞和平滑肌細胞等[15]。此外,CHI3L1在多種心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用,如冠狀動脈粥樣硬化和巨細胞動脈炎等[16]。Kwon 等[17]研究發(fā)現(xiàn),CHI3L1在冠狀動脈粥樣硬化病變中上調(diào),CHI3L1 可以阻止平滑肌細胞向合成和過度增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)換的不良改變,在抑制冠狀動脈斑塊形成中發(fā)揮重要作用[18]。van Sleen等[19]研究表明,在巨細胞動脈炎患者中,CHI3L1可通過與人白細胞介素13受體α2相互作用激活Akt/ERK途徑,促進炎癥反應、組織破壞和新生血管形成的過程。
單次腹腔注射LCWE可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生主動脈炎和近端冠狀動脈炎,其組織病理學、功能和免疫特征與人類KD中觀察到的血管炎非常相似[20],是目前常見的認可度較高的構(gòu)建KD樣血管炎小鼠模型的方法之一。本研究通過酶聯(lián)免疫吸附法、免疫熒光染色及Western blot 檢測正常對照組小鼠和單次腹腔注射LCWE 構(gòu)建KD 樣血管炎小鼠模型組小鼠冠狀動脈組織中CHI3L1 的表達水平,結(jié)果顯示與對照組小鼠比較,模型組的冠狀動脈組織中CHI3L1表達水平明顯升高,因此我們推測CHI3L1的過表達可能參與了KD所致CAL的發(fā)生。既往研究表明,內(nèi)皮細胞功能障礙是KD 的關鍵病理機制[21]。本研究檢測了內(nèi)皮標志物及細胞凋亡蛋白的表達,結(jié)果表明KD樣血管炎小鼠的冠狀動脈組織中,內(nèi)皮標志物vWF 及VE cadherin 表達水平降低,并且免疫熒光染色結(jié)果也顯示,對照組小鼠冠狀動脈組織中vWF 為高表達,而模型組小鼠冠狀動脈組織中vWF基本無表達;細胞凋亡基因Bax及Caspase-3 表達水平明顯升高,而抗凋亡基因Bcl-2表達水平明顯下降,提示CHI3L1可能通過介導內(nèi)皮細胞凋亡參與KD 血管炎性損傷。NF-κB 是一種核轉(zhuǎn)錄因子,可刺激下游炎癥介質(zhì)表達升高,促進人冠狀動脈內(nèi)皮細胞凋亡,參與KD血管炎癥損傷過程[22]。既往研究發(fā)現(xiàn),CHI3L1可通過激活NF-κB 通路促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤進展[23]。本研究結(jié)果表明在KD 樣血管炎小鼠的冠狀動脈組織中NFκB、p-NF-κB 表達水平升高,提示LCWE 誘導的KD樣血管炎可能是通過CHI3L1/NF-κB信號通路造成血管內(nèi)皮細胞凋亡。
綜上所述,LCWE 誘導的KD 樣血管炎小鼠模型中CHI3L1 的表達水平升高,可能通過炎性反應介導血管內(nèi)皮細胞凋亡在冠狀動脈損傷中發(fā)揮作用。今后將對CHI3L1 是如何通過NF-κB 介導的炎性信號通路來誘發(fā)KD血管內(nèi)皮細胞凋亡進一步研究。本研究為探索CHI3L1 預測KD 患兒發(fā)生CAL的潛在生物標志物提供了新的方向。
利益沖突聲明:所有作者聲明不存在利益沖突。